O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

Resumo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Resumo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

Introdução

The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems^1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium³ and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system⁴. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood^4,5.

Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.

Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells^6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol⁸. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis^9,10.

We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system^11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons¹². The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.

Protocolo

NOTA: A manipulação de animais e experimentos foram realizados conforme aprovado pelo Comitê Universidade de Göttingen de Ética em Experimentação Animal.

1. Preparação de Instrumentos e Pipeta Fabrication

1. Certifique-se de que a configuração eletroporação consiste de um microscópio estereoscópico com grande distância de trabalho e está equipado com iluminação e filtro conjuntos fluorescentes para o corante usado.
2. Para eletroporação usar um electroporador única célula dedicada ou um gerador de pulso quadrado genérico ligado a um osciloscópio. Ligue as saídas electroporador a um titular pipeta e um eletrodo de banho. Ligar o terminal positivo do gerador de impulsos ao titular da micropipeta e o terminal negativo para o banho de eléctrodo. Assegure-se tanto o titular da pipeta e o eléctrodo do banho conter fios de prata revestidos com uma fina camada de cloreto de prata.
3. Montar o suporte da pipeta em um micromanipulator para permitir o posicionamento exato.
4. Fabricar micropipetas eletroporação de capilares de vidro de borosilicato com filamento interno.
5. Usar um puxador de micropipeta horizontal e aplicar um protocolo modificado para a fabricação de pipetas para experiências de fixação de membranas como descrito por Bestman et al. ^13.
6. Adaptar os parâmetros para produzir uma haste mais longa e uma abertura menor ponta resultando em uma resistência pipeta maior de cerca de 15-20 MOhm para eletroporação única célula. A resistência pipeta deve ser inferior, por exemplo, 3-4 MOhm, para rotulagem de grupos de células.
7. Medir a resistência pipeta, quer directamente com um electroporador de uma única célula dedicado ou calcular-o com a lei de Ohm depois de medir o fluxo de corrente com um osciloscópio após a aplicação de um impulso de tensão definida.

2. Preparação de Solução A electroporação

1. Dissolver dextrano-coupled fluoróforo em sapo campainha (NaCl 98, KCl 2 mM, 1 mM de _CaCl2, MGC 2 mMl _2, 5 mM de glucose, 5 mM de Na-piruvato, HEPES 10 mM, ajustado para pH 7,8, a osmolaridade foi de 230 mOsmol / l) a uma concentração de 3 mM. As células não podem ser tão intensamente marcado se concentrações mais baixas de corantes são usados. Prepare uma solução estoque grande volume e dividi-lo em pequenas alíquotas. Congelá-los para armazenamento (estável por meses).
   NOTA: Os dextranos estão disponíveis em diferentes tamanhos e uma variedade de espectros de emissão / excitação (por exemplo, Alexa 488-dextrano 10 kD, Alexa 546-dextrano 10 kD, Alexa 568-dextrano 10 kD, Alexa 594-dextrano 10 kD, TMR-dextrano 3kD.).
2. Backfill a micropipeta com uma ponta de pipeta alongada com um pequeno volume de solução de dextrano (1-5 ul). Agite cuidadosamente a micropipeta com o dedo para remover as bolhas de ar residuais a partir da ponta da pipeta.
3. Montar o micropipeta no suporte da pipeta. Certifique-se de que o fio de prata dentro da pipeta está em contacto com a solução de corante.

3. Seleção de larval X. laevis </ Em>

1. Use larvas albino de X. laevis para os experimentos. Animais tipo selvagem possuem melanóforos cheios de pigmento que mostram emissão autofluorescência durante confocal / multiphoton imagem e não são, portanto, adequados para os experimentos descritos.
2. Estágio girinos premetamorphotic após Nieuwkoop e Faber ^14. Selecione girinos de etapas 45-53 para os experimentos.

4. A electroporação de Dextranos Fluoróforo-acoplados

1. Coloque um pequeno pedaço de tecido em uma placa de Petri e cobri-lo com um pequeno volume de água contendo 0,02% tricaina (Acetato de 3-aminobenzoato metanossulfonato, ajustado para pH 7).
2. Anestesiar os girinos em água contendo 0,02% tricaina. Depois de alguns minutos, os animais deixam de se mover. Confirme anestesia adequada tocando girinos. Eles devem ser não-responsivos.
3. Transferir cuidadosamente o girino do anestésico para o tecido coberto placa de petri.
4. Certifique-se que o banho electrode fecha o circuito de eletroporação. Certifique-se de que o eléctrodo está em contacto com o tecido molhado; um contacto directo com o girino não é necessário.
5. Posicione a ponta da micropipeta perto do olfacto usando o micromanipulator.
6. Penetrar a pele que cobre o órgão olfativo com a ponta da pipeta e cautelosamente avançar a ponta na camada de neurônio sensorial localizado no centro da principal epitélio olfatório ou epitélio vomeronasal.
7. Desencadear impulsos positivos de tensão quadrada para transferir corante em neurônios sensoriais. Aplicar um único pulso de tensão (por exemplo., 25 V, comprimento de pulso de 25 ms) ou trens de pulsos múltiplos (eg., 50 V, comprimento de pulso de 300 ms, 400 ms de duração de trem a 200 Hz).
   NOTA: Determinar parâmetros de pulso de tensão ideais para a desejada extensão da rotulagem. Reduzir a amplitude do impulso de tensão, a duração e número de repetições para diminuir o número de células marcadas. Aplicar maior amplitude de pulso de tensão, duração e número de pulses para uma rotulagem mais difundido.
8. Visualize extrusão corante sucesso e eletroporação por pulsos disparados com uma iluminação fluorescente do microscópio estereoscópico. O corante difunde rapidamente para dentro do corpo celular e dendritos após a electroporação bem sucedida.
9. Repita os passos de 4,5-4,9 para o segundo órgão olfativo do girino.
10. Transferir o girino para um copo cheio de água fresca para a recuperação. Depois de ca. 5 min os girinos acordar da anestesia e iniciar movimentos normais de natação.
11. Após 24 horas o corante electroporados espalha nos neurônios sensoriais e, eventualmente, atinge o bulbo olfatório via transporte axonal.

5. Os animais de montagem para In Vivo visualização de células e processos axonais

1. Anestesiar os girinos em água contendo 0,02% tricaina.
2. Transferir cuidadosamente girinos em uma câmara de imagem, por exemplo, uma pequena borracha de silicone coberto com uma placa de petri de tamanho recesso-girino.
3. Corte um pequeno retângulo em uma faixa de Parafilm. Cubra o girino com o Parafilm, deixando o telencéfalo anterior exposto através da janela de recorte. Corrigir o Parafilm com agulhas no prato sem ferir o girino.
4. Certifique-se o girino é submerso em água suficiente contendo 0,02% tricaina.
5. Monte a câmara de imagem no palco de um microscópio multiphoton vertical ou microscópio confocal.
6. Adquirir uma pilha de imagens do bulbo olfatório tridimensional. Certifique-se que o procedimento de imagem é o mais curto possível e não exceda 10-15 min.
7. Retorne o girino em água normal em um tanque separado e evitar a exposição à luz. Após 5 min, o girino acorda da anestesia.
8. Repita os passos 5,1-5,7 após intervalos de tempo especificados, por exemplo., Todos os dias.

6. Os animais de montagem para Ex Vivo visualização de células e processos axonais

1. Como alternativa para a seção 5do protocolo, use uma preparação cérebro extirpado para visualizar os neurônios sensoriais rotulados.
2. Anestesiar e matar o girino por transecção do cérebro, na transição para a medula espinhal. Especiais sobre o consumo de um bloco de tecido contendo os órgãos olfativos, os nervos olfatórios e telencéfalo anterior.
3. Transfira o bloco de tecido para solução de Ringer rã e remover o tecido conjuntivo com uma tesoura fina para expor o lado ventral do cérebro.
4. Transfira o bloco de tecido para uma câmara de imagem e corrigi-lo com uma moldura de platina cordas com fios de nylon.
5. Monte a câmara de imagem no palco de um microscópio confocal / multiphoton.
6. Adquirir uma pilha de imagens do bulbo olfatório tridimensional.

7. Processamento de Imagem e Avaliação de Dados

1. ¹⁵ optimizar e aplicar meios não-locais de filtragem para melhorar a qualidade de imagem e visualização das estruturas neuronais, como descrito por coupé, P. et al..
   NOTA: Os dados de experimentos com imagens em camadas mais profundas do tecido de espécimes vivos são muitas vezes barulhento.
2. Criar projeções de intensidade máxima das pilhas de imagens para uma visão geral.
3. Por lapso de tempo experimentos com imagens de tela conjuntos de dados para os axônios inequivocamente identificáveis ​​únicas de neurônios sensoriais.
4. Reconstruir morfologia celular via rastreamento de processos neuronais assistida por software como descrito por Peng et al. ^16.

Resultados

O protocolo descrito pode ser aplicado com sucesso para eletroporação e na visualização in vivo dos processos axonais de neurónios sensoriais do sistema olfactivo dos X. anestesiado laevis, usando confocal a laser de varredura ou microscopia multiphoton (Figura 1).

Eletroporação permite dextrans-coupled fluoróforo para entrar e se espalhar rapidamente no interior das células do órgão olfativo. É útil para aplicar iluminação fluorescente para verificar a rotulagem bem sucedida depois de desencadeamento de impulsos de tensão. Dependendo dos parâmetros de electroporação, por ex., Resistência a pipeta, grupos de células (Figura 2A, B) ou as células individuais (Figura 2C) do órgão olfactivo são rotulados. Axónios dos neurónios sensoriais marcadas podem ser visualizadas no nervo olfactivo (Figura 2D) e os processos axonais, também pode ser observado no bolbo olfactivo, geralmente 24 horas após a electroporação bem sucedida(Figura 3). A electroporação de grupos de neurónios sensoriais permite visualizar os padrões de fiação grosseiras no bolbo olfactivo (Figura 3A). Eletroporação única célula pode ser aplicado para investigar padrões individuais axonal projeção, bifurcações axonal e conectividade para estruturas glomerulares no bulbo olfatório (Figura 3C-E).

Girinos albinos transparentes de X. autorização laevis em confocal vivo ou multiphoton imagem de neurônios sensoriais marcadas no cérebro intacto de girino anestesiados. O desenvolvimento de padrões de crescimento axonal pode ser rastreado ao longo de vários dias / semanas por repetidas em visualização vivo do mesmo neurônio sensorial marcada (Figura 4). Dependendo da maturidade do neurônio sensorial no ponto de tempo de eletroporação o padrão axonal no bulbo olfatório podem variar consideravelmente. Neurônios maduros já possuem ramos axonais elaborados que apresentam tufoed áreas ligadas aos glomérulos. O padrão de crescimento axonal de neurônios maduros é bastante estável, mas o alongamento de ramos do axônio e refinamentos de tufos glomerulares são observáveis ​​(Figura 4A-E). Neurónios sensoriais pode ser observada in vivo por períodos de tempo prolongados, por exemplo., Mais longo do que três semanas (Figura 4F-I). Por outro lado, os axônios dos neurônios imaturos ainda estão em processo de crescimento inicial, não possuem arborizações tufados e ainda não ligada a suas metas finais glomerular. O protocolo experimental permite acompanhar o desenvolvimento destes neurónios durante a maturação, por exemplo., O alongamento axonal, bifurcações e estabelecimento de arborizações tufados (Figura 4J-L). Para obter mais exemplos veja também Hassenklöver e Manzini ^12.

Figura 1. Visão esquemática do protocolo experimental. (A) neurônios sensoriais no epitélio olfatório principal (MOE) ou órgão vomeronasal (OVN) do órgão olfativo de X. anestesiado larvas laevis são rotulados através de electroporação utilizando uma pipeta de vidro preenchido com uma solução de dextrano fluorescente. Os axônios dos neurônios marcados pode ser seguido através do nervo olfativo (ON) e, eventualmente, atingir o bulbo olfatório (OB). (B) O girino é anestesiado e os neurônios marcados são repetidamente investigada utilizando um microscópio confocal ou multiphoton em intervalos de tempo específicos. (C) O desenvolvimento incremental dos padrões de crescimento axonal de células marcadas podem ser acompanhados ao longo de períodos de tempo de dias ou semanas.

Figura 2. Electroporation de neurônios sensoriais no órgão olfativo. (A) Eletroporação com pipetas de baixa resistência leva a rotulagem de várias células no órgão olfativo. Neste exemplo representativo vários neurônios olfativos receptores (ORNs, setas cheias) e duas células em forma colunar-sustentável (SCS, asteriscos) foram coradas. As linhas tracejadas demarcar fronteiras do epitélio olfactivo (OE). (B) Refinamento dos parâmetros de electroporação, por ex., Aumentando a resistência pipeta, restringe o número de células marcadas. Neste exemplo, um único neurónio sensorial (pontas de setas a cheio) e uma célula de apoio adjacente (asterisco) foram coradas após a electroporação. Observe o único axônio deixando o epitélio olfativo (setas abertas). (C) eletroporação única célula de sucesso leva a rotulagem exclusiva de um neurônio sensorial indivíduo (seta cheia) e seu axônio conectado (setas abertas) no epitélio olfatório. (D) O único axônio marcada (setas abertas) pode ser seguido através do nervo olfativo (ON) para o bulbo olfativo.

Figura 3. Visualização projeções axônio olfativos no bulbo olfativo extirpado. (A) A topologia grosseira de projeções axonais dos neurônios sensoriais no bulbo olfativo pode ser visualizado utilizando menores pipetas eletroporação de resistência. Um hemisfério bulbo olfatório e seu nervo olfativo associado (ON) são retratados. Quatro dextrans acoplados a diferentes fluoróforos foram electroporados em quatro locais distantes do órgão olfativo: lateral (verde), intermediária (amarelo), medial MOE (vermelho) e VNO (laranja). Isto permite a visualização do bulbo olfatório acessório (AOB) e os três principais campos de projeção do bulbo olfatório (MOB). (B) diferentes padrões de crescimento axonal de neurônios olfatórios individuais sobrepostas na estrutura do bulbo olfatório. Descrito são combinados reconstrução tridimensional de várias colorações unicelulares derivados de diferentes amostras de larvas. (CE) Exemplos de axônios olfativos individuais projetam para o bulbo olfativo e formando arborizações tufados / sinapses em glomérulos esférica (setas cheias). Note-se que em X. laevis axônios olfativos bifurcam regularmente (setas abertas) antes de ligar para um, dois ou múltiplos glomérulos (setas cheias, veja também Hassenklöver e Manzini ^12).

Figura 4. In vivo de imagens de lapso de tempo de solteiro axônios dos neurônios olfativos. (AE)Após a electroporação de células individuais bem sucedida do axónio marcado pode ser visualizado repetidamente no bolbo olfactivo (OB). Este exemplo mostra um axónio individual que foi investigada para uma semana. A morfologia geral não muda consideravelmente e dois grandes pontos de ramificação pode ser identificada (setas abertas). Note-se que ao longo do tempo, um tufo glomerular sofre redução contínua (ponta de seta a cheio), ao passo que os outros dois tufos glomerulares permanecem estáveis ​​(asteriscos). (FI) Este exemplo representativo mostra a viabilidade de observações a longo prazo, pois isso axónio específica foi investigada durante mais de três semanas. Nenhuma mudança aparente do seu padrão de crescimento pode ser detectada. (JL) Um exemplo de um axónio sensorial imatura no processo de crescimento é descrita. Ele ainda não se conectou aos glomérulos e tufos glomerulares característicos estão faltando. Após 5 dias os ramos axonais são alongadas, o axônio bifurcado várias vezes e arborizações finas sãoestabelecida.

Discussão

O procedimento experimental descrito aqui permite rotulagem neurónios sensoriais do órgão olfactivo larvar de X. laevis por electroporação de dextranos acoplado-fluoróforo e visualização subsequente do crescimento axonal sensorial no animal vivo. Ao variar os parâmetros do electroporação in vivo, é possível controlar o número de neurónios sensoriais marcados. É, assim, possível rotular grandes grupos de neurônios de um epitélio sensorial, muito poucos ou mesmo células individuais.

Para garantir a desejada extensão da rotulagem neuronal é importante ser particularmente cautelosos sobre as características micropipeta e os pulsos eletroporação. As resistências das pipetas mais elevadas e redução do impulso de tensão de amplitude, a duração e número de repetições pode reduzir a quantidade de células marcadas, enquanto diminuir as resistências das pipetas e maior amplitude do impulso de tensão, a duração, o número de impulsos pode levar a rotulagem mais generalizada. The uso de dextrans fluorescentes para eletroporação fornece feedback visual imediato, se as configurações aplicadas são adequadas. Tenha cuidado para que o uso de parâmetros de amplitude, duração e número de pulsos que excedem os valores previstos no protocolo pode potencialmente levar a danos celulares ou até mesmo a morte celular ^17. Dicas entupidos ou quebrados de micropipetas também pode dificultar a eletroporação de sucesso.

Em electroporação in vivo no órgão olfactivo de X. laevis está limitada a fases larvares uma vez que a pele de rãs postmetamorphotic é mais resistente e não pode ser facilmente penetrada com uma micropipeta. A visualização in vivo de processos neuronais pode ser prejudicado por espalhamento de luz de excitação / emissão de áreas cerebrais mais profundas ou por vasos sanguíneos. Este problema torna-se especialmente evidente nos estágios larvais mais elevados devido a um cérebro maior e pode levar a sinais ruidosos que fazem a identificação clara dos processos axonais finos mais difícil.

permite que o protocolo apresentado para visualizar os neurônios sensoriais no sistema olfativo intacta, sem dissecar o animal, danificando as células durante a etiquetagem, preparação de fatias de tecido ou a fixação do tecido como necessário para métodos alternativos, como rotulagem no patch de células inteiras experimentos -clamp ^18. Ao combinar a rotulagem dos poucos ou único neurônios sensoriais com in vivo lapso de tempo de imagem, é possível visualizar as conexões glomerular de simples neurônios sensoriais maduros em intervalos de tempo longos. Deste modo, também é possível acompanhar o desenvolvimento dos padrões de projeção axonal de neurônios sensoriais imaturos ao longo de várias semanas. Esta última opção é particularmente interessante, pois permite monitorar os padrões de crescimento de axônios individuais no animal vivo. Isso abre a possibilidade de investigar os mecanismos celulares e moleculares que controlam a orientação do axônio e pioneiro. Vários fatores, incluindo a expressão do receptor de odor, vários axomoléculas de orientação e n induzida por odorante / actividade espontânea de neurónios sensoriais foram mostrados para regular a constatação alvo de axónios de neurónios sensoriais ^4,5.

A aplicação do protocolo não está restrita aos neurónios sensoriais olfactivos, mas também pode ser aplicada ao estudo de outros tipos de células, por ex., As células estaminais / progenitoras das zonas neurogénicos do cérebro em desenvolvimento ou células mitrais do bolbo olfactivo. Além disso, a técnica demonstrada também pode ser usado em combinação com dextranos de cálcio sensíveis injectados ou corantes de cálcio permeáveis ​​à membrana para obter informações sobre o neurónio funcional marcado e / ou ligado a circuitos ^7,19. A disponibilidade de uma grande variedade de fluoróforos acoplados a dextranos permite rotulagem de várias células individuais ou populações com cores diferentes. Também plasmídeo solução de ADN, por exemplo, que codifica para proteínas fluorescentes, é adequado para eletroporação e pode aumentar ainda mais a versatility e utilidade da técnica ^6. O protocolo pode ainda ser melhorado para permitir a eletroporação combinado de dextrans e DNA ou morpholinos cobradas para manipular a expressão gênica ^13,17.

O método descrito, certamente, representa uma nova ferramenta para investigar o complexo e processos ainda não totalmente compreendidas que regulam a orientação axonal no sistema olfactivo de vertebrados.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SZX16	Olympus		Stereomicroscope with fluorescent illumination
Axon Axoporator 800A	Molecular Devices		Single cell electroporator
ELP-01D	npi electronic		Electroporator
MMJ	Märzhäuser Wetzlar		Manual micromanipulator
P-1000	Sutter		Horizontal micropipette puller
G150F-4	Warner Instruments		Glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier
Alexa 488-dextran 10 kD	Life Technologies	D22910
Alexa 546-dextran 10 kD	Life Technologies	D22911
Alexa 568-dextran 10 kD	Life Technologies	D22912
Alexa 594-dextran 10 kD	Life Technologies	D22913
TMR-dextran 3 kD (micro-Ruby)	Life Technologies	D7162
Microloader pipette tips	Eppendorf	930001007
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10521	Anesthetic; use gloves
A1-MP	Nikon		Multiphoton microscope
LSM 780	Zeiss		Confocal microscope
Imaris	Bitplane		Alternative software for neuronal tracing