Caracterizando Propriedades Multiscale mecânicas do tecido cerebral usando microscopia de força atômica, recuo de impacto, e Reologia

Resumo

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

Resumo

Para projetar e engenheiro de materiais inspirados nas propriedades do cérebro, seja para simuladores mecânicos ou para estudos de regeneração de tecidos, o próprio tecido cerebral deve ser bem caracterizada em várias escalas de comprimento e hora. Como muitos tecidos biológicos, tecido cerebral apresenta uma estrutura complexa, hierárquica. No entanto, em contraste com a maioria dos outros tecidos, o cérebro é de muito baixa rigidez mecânica, com elástico módulos E de novo na ordem de 100s de Pa. Esta baixa rigidez pode apresentar desafios para a caracterização experimental das propriedades mecânicas importantes. Aqui, demonstramos diversas técnicas de caracterização mecânicas que foram adaptados para medir as propriedades elásticas e viscoelásticas dos materiais hidratados, compatíveis biológicos, tais como tecido do cérebro, em diferentes escalas de comprimento e taxas de carregamento. Em microescala, realizamos creep-conformidade e força de relaxamento experimentos usando de força atômica recuo habilitado para microscópio. Nas mesoscale, realizamos experimentos de impacto de recuo usando um penetrador instrumentado à base de pêndulo. No macroescala, realizamos reometria de placas paralelas para quantificar o corte módulos elásticos dependente da freqüência. Nós também discutir os desafios e limitações associadas a cada método. Juntas, estas técnicas permitem uma caracterização mecânica em profundidade de tecido cerebral que pode ser usado para entender melhor a estrutura do cérebro e ao engenheiro de materiais bio-inspirados.

Introdução

Mais tecidos moles que compreendem órgãos biológicos são mecanicamente e estruturalmente complexa, de baixa rigidez em comparação com o osso mineralizado ou materiais de engenharia, e exibem deformação não-linear e dependente do tempo. Em comparação com outros tecidos do corpo, o tecido cerebral é extraordinariamente compatível, com módulos de elasticidade E na ordem de 100s de ¹ Pa. O tecido cerebral apresenta heterogeneidade estrutural com regiões da substância branca, que também diferem funcionalmente distinta e cinza e interdigitados. Compreendendo mecânica de tecido cerebral irá ajudar na concepção de materiais e modelos computacionais para simular a resposta do cérebro durante a lesão, facilitar a previsão de dano mecânico, e permitir a engenharia de estratégias de protecção. Para além disso, tal informação pode ser utilizada para considerar alvos ideais para a regeneração de tecidos, e para melhor compreender as alterações estruturais no tecido cerebral que estão associados a doenças tais como esclerose múltipla e autismo. Here, descrevemos e demonstrar várias abordagens experimentais que estão disponíveis para caracterizar as propriedades viscoelásticas dos tecidos compatíveis mecanicamente incluindo tecido cerebral, na micro, meso e macro-escalas.

Em microescala, realizamos creep-conformidade e forçar experiências de relaxamento usando microscópio de força atômica (AFM) recuo habilitado. Tipicamente, a indentação permitiu-AFM é utilizado para estimar o módulo de elasticidade (rigidez ou instantânea) de uma amostra de ^2-4. No entanto, o mesmo instrumento pode também ser utilizado para medir a viscoelasticidade microescala (tempo ou dependente da taxa de) propriedades ^5-10. O princípio destas experiências, mostrado na Figura 1, é para recuar um AFM em cantilever sonda no tecido cerebral, manter uma magnitude especificada de força ou de profundidade de penetração, e medir as alterações correspondentes na profundidade de indentação e força, respectivamente, ao longo do tempo. Usando esses dados, podemos calcular o comp fluêncialiance J _C e relaxamento módulo G _R, respectivamente.

No mesoescala, realizamos experimentos de recuo de impacto em condições imersas de líquido que mantêm a estrutura do tecido e os níveis de hidratação, usando um nanoindenter instrumentado à base de pêndulo. A montagem experimental é ilustrada na Figura 2. Uma vez que o pêndulo oscila em contacto com o tecido, a sonda de deslocamento é registada como uma função do tempo até que o pêndulo oscilante vem a descansar dentro do tecido. A partir do movimento oscilatório amortecido harmónica, resultante da sonda, pode-se calcular a profundidade máxima de penetração X _max, a capacidade de dissipação de energia de K, e o factor de qualidade Q de dissipação (que diz respeito à taxa de dissipação de energia) do tecido ^11,12.

No macroescala, foi utilizado um reómetro de placas paralelas para quantificar o corte dependente módulos elásticos frequência,denominado o módulo de armazenamento G 'e o módulo de perda G ", do tecido. Neste tipo de reometria, aplica-se uma tensão angular harmónica (e tensão de cisalhamento correspondente) em amplitudes conhecidos e frequências e medir o binário reacional (e tensão de cisalhamento correspondente) , como mostrado na Figura 3. a partir da amplitude e da fase lag resultante do binário medido e variáveis ​​geométricas do sistema, pode-se calcular G 'e G "aplicados a frequências de interesse ^13,14.

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Protocolo

Declaração de Ética: Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal do Hospital Infantil de Boston e cumprir com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Rato cérebro procedimentos de aquisição de tecido (para recuo permitiu-AFM e recuo de impacto)

1. Prepara-se uma mistura de cetamina / xilazina para anestesiar os ratos. Combinar 5 ml de cetamina (500 mg / ml), 1 ml de xilazina (20 mg / ml) e 7 ml de solução salina 0,9%.
2. Injectar rato (Raça: TSC1; Syn-Cre; PLP-eGFP; Idade: p21; Sexo: masculino ou feminino), com 7 ul por peso corporal gramas da solução de cetamina / xilazina.
3. Uma vez que o rato está totalmente anestesiado, como demonstrado pela falta de resposta aos pés e cauda pitadas, eutanásia o mouse por decapitação usando grandes tesouras de dissecação.
4. Remover o crânio, cortando ao meio usando menores tesouras de dissecação. Começando no cerebelo, REMpeças ove do crânio usando uma pinça curva. Após a remoção do crânio, extrair o cérebro, utilizando uma espátula plana para levantar o cérebro, começando no cerebelo, e colocar o cérebro em uma placa de Petri. Remover o cerebelo a partir do cérebro utilizando uma lâmina de barbear.
5. Se estiver usando um cérebro inteiro para testes de recuo de impacto sobre o tecido fresco, transferência de cérebro em um tubo de fundo redondo com _CO2 meio nutriente independente de para o tecido neural adulto no gelo e avançar para a secção 4. Caso contrário, vá para o passo 1.6 para cortar procedimentos.
6. Ajustar as configurações vibratome a uma velocidade de 0,7 mm / seg, uma frequência de 70 Hz de vibração, e uma espessura de corte de 350 um. Cerque o prato vibratome com gelo. Coloque um pouco de supercola sobre a placa vibratome e montar cérebro para que cortes coronais podem ser cortadas, com o cérebro orientada para cortar o lado dorsal em primeiro lugar.
7. Encher o prato vibratome com solução salina tamponada com fosfato suficiente de Dulbecco (DPBS) a apenas submergir o cérebro. Levantaro prato no vibratome de modo que a lâmina é apenas submerso no DPBS.
8. Pressione start para começar a cortar seções cerebrais coronais 350 mm de espessura.
9. Usando pincéis para evitar danos ao tecido, transferir as fatias de cérebro do banho de vibratome DPBS e para um tubo de fundo redondo com CO ₂ independente de meio nutriente para tecido neural adulto em gelo e realizar medições em tecido fresco dentro de 48 h. Para começar experimentos recuo permitiu-AFM, avance para a secção 3.

2. Pig Cérebro procedimentos de aquisição de tecido (por reologia)

1. Obter um suíno metade do cérebro sagital cortado dentro de ~ 1 hora de sacrifício de um talho local. Coloque a metade do cérebro de CO ₂ independente de meio nutriente para o tecido neural adulta, e armazenar no gelo.
2. Use uma lâmina de barbear ou bisturi para fazer uma ~ 5 mm de espessura fatia do cérebro coronal e armazenar em CO ₂ independente de meio nutriente para o tecido neural adulta. Certifique-se de que o surfac fatiae é o mais plano possível. Use movimentos laterais cuidado com navalha / bisturi durante o corte.
3. Loja tecido cerebral de suínos em CO ₂ independente de meio nutriente para o tecido neural adulto no gelo e realizar reometria (seção 5) no tecido fresco dentro de 48 horas.

3. Microscópio de Força Atômica habilitado Indentation

1. Preparar pratos 60 milímetros de diâmetro Petri (P60) com um bioadesiva derivada de mexilhões de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Prepara-se uma solução de estoque de tampão neutro que consiste em bicarbonato de sódio 0,1 M em água esterilizada com um pH óptimo de 8,0. Filtrar a esterilizar (0,2 micron) o tampão de bicarbonato de sódio e armazenar a 4 ° C.
   2. Em uma câmara de fluxo laminar, mistura uma solução de 6,25% de bio-adesivo e 3,125% de NaOH derivado de mexilhão no tampão de bicarbonato de sódio.
   3. 100 ul pipeta da solução de bio-adesivo de 3.1.2 para um mm de diâmetro 60 dica Petri (P60) prato e a utilização da pipeta de espalhar solution em um círculo 3-5 cm de diâmetro.
   4. Deixar P60 pratos descobertos em capela de fluxo laminar e deixe a solução seca (~ 30 min). pratos Lavar 1x com PBS e 2x com água estéril. Deixe secar os pratos do ar na câmara de fluxo laminar e armazenar em um saco plástico selado a 4 ° C por até 1 mês.
2. Calibrar o AFM e amostra cérebro set-up no AFM.
   NOTA: Siga as instruções de calibração AFM conforme o fabricante.
   1. Encher cuidadosamente uma sonda de AFM com uma constante da mola nominal de 0,03 N / m e uma mm de diâmetro borosilicato talão 20 no suporte da sonda.
   2. Calibrar a constante da mola e ópticos sensibilidade alavanca inverse (InvOLS) do cantilever AFM utilizando o método de sintonia térmica ^15,16.
      NOTA: Uma vez que a constante da mola para uma sonda de AFM é calculado, ele deve permanecer constante com o uso repetido. No entanto, os InvOLS cantilever terá que ser novamente calibrado de cada vez que o laser é realinhados com o braço de suporte. Além disso, a calibraçãodeve ser realizada de encontro a um substrato de várias ordens de magnitude mais duro do que o raio de acção, tal como poliestireno.
   3. Ligar o aquecedor montado na fase e a temperatura ajustada para 37 ° C.
   4. Monte a fatia do cérebro para os pratos preparados P60 na secção 3.1.
      1. Suavemente para um de 350 um de espessura fatia cerebral, bem como o CO ₂ independente de forma a partir do balão de fundo redondo em um prato P60 revestidos com o bioadesivo derivado de mexilhão.
      2. Ao inclinar ligeiramente o disco P60, posicionar a fatia do cérebro no centro do prato. Se necessário, pipetar lentamente meio de uma pipeta manual para desdobrar uma fatia do cérebro que dobrada sobre si mesma ou melhor posição a fatia do cérebro no centro do prato.
      3. Retirar cuidadosamente o excesso de mídia usando uma pipeta P1000 (não use o vácuo).
      4. Coloque a tampa no prato P60 e deixe a fatia do cérebro aderir durante 20 min.
   5. Retire a cabeça AFM, coloque a fatia do cérebro montado no P60prato no palco AFM, e adicionar ~ 2 ml de pré-aquecido CO ₂ médio independente de.
   6. Adiciona-se cuidadosamente uma gota de meios para a sonda de AFM para o proteger de quebrar, devido à tensão superficial, quando é abaixado no meio circundante da fatia do cérebro.
   7. Reposicionar a cabeça AFM para o palco, e começar a baixar a cabeça até que ele seja submerso no media.
   8. Usando a câmera CCD-vista de cima, reposicionar o laser sobre o cantilever.
      NOTA: O alinhamento do laser sobre o braço de suporte terá mudado ligeiramente, devido à diferença no índice de refracção do ar e forma.
   9. Espere 5 minutos para o cantilever se ajustar a ser submerso em um líquido quente, em seguida, redefinir o alinhamento espelho para uma deflexão livre 0 V.
   10. Executar um espectro térmico na sonda de AFM de acordo com as instruções do fabricante ^16. Usar o ajuste do primeiro pico térmico para recalcular InvOLS da sonda de AFM em meios.
   11. Utilizando o microscópio óptico,mover o estágio da amostra de tal forma que a região do cérebro de juro abaixo da sonda de AFM.
       NOTA: O corpo caloso aparece escuro, pois é mais opaca do que a massa cinzenta circundante. O córtex é superior à do corpo caloso.
   12. Redefinir o alinhamento espelho para uma deflexão livre 0 V.
   13. Na soma e deflexão do medidor no software AFM, clique em "Participar" para envolver a cabeça AFM.
   14. Usando o seletor de posição na cabeça AFM, baixar a cabeça até que o contato entre o cantilever ea amostra é feita.
3. (Opcional) Se desejado, medir o módulo de elasticidade da amostra, como descrito anteriormente ^4,17,18.
4. Conduzir experimentos de conformidade de fluência.
   1. Construir uma função de força aplicada no editor de funções do software. A função de força consiste em uma rampa de 0,1 seg a um ponto de 5 nN set e segure por 20 segundos, seguido por um 1 segundo rampa até uma força aplicada de 0 nN.
      1. No recuo Master Panel, de acordo com o método de recuo, selecione "Load" para o modo Indenter; "N" para unidades; e "editor Function" para a função Indenter.
      2. No editor de função, no segmento de painéis Parms, criar um segmento função de força aplicada que começa em 0 nN, termina em 5 nN, com um tempo de 0,1 segundos. Clique em "Inserir ->".
      3. Para o próximo segmento, defina começar a 5 nN, de ponta a 5 nN, e tempo para 20 seg. Clique em "Inserir ->."
      4. Para o segmento final, de começo ajustado a 5 nN, de ponta a 0 nN, e tempo para 1 seg. Clique em "Empate" e feche a janela do editor de função.
   2. Na Tab Força do Painel-Mestre, marque "rampa penetrador depois do disparo" e definir a função de força aplicada para disparar depois de atingir um ponto de disparo de 0,1 V.
   3. Clique em "Force Single" na parte inferior do Tab Força do Painel-Mestre, que irá acionar a função de força construída aplicada pelo cumprimento fluência.
   4. Depois deúnico recuo força é terminado, levantar a cabeça AFM para que ele está fora de contato com a amostra e, em seguida, voltar a envolver a cabeça e voltar a deflexão zero livre.
   5. Reposicionar o estágio da amostra para localizar uma nova área de interesse, e baixar a cabeça AFM para fazer contato. NOTA: A cabeça AFM deve ser recolhida a partir da superfície da amostra quando o estágio da amostra é movido. Não fazer isso pode resultar em danos para o cantilever AFM delicado.
   6. Repita os passos 3.4.3-3.4.5 até que a quantidade desejada de dados foram coletados.
5. Conduzir experimentos de relaxamento de força.
   1. Construir uma função de recuo aplicada no editor de funções do software. A função de recuo é constituído por uma rampa de 0,1 segundos para um ponto de 3 um conjunto e segurá-la durante 20 seg, seguido de uma rampa de 1 segundo até uma profundidade de penetração de 0 uM.
      1. No Painel Mestre de recuo, de acordo com o método de recuo, selecione "recuo" para o modo Indenter; "M" para as unidades; e "; Editor Function "para Indenter Função.
      2. No editor de função, no segmento de painéis Parms, criar um segmento de função força aplicada que começa em 0 ^ M, termina a 3 um, com um tempo de 0,1 segundos. Clique em "Inserir ->".
      3. Para o próximo segmento, defina começar a 3 um, de ponta a 3 mm, e tempo para 20 seg. Clique em "Inserir ->."
      4. Para o segmento final, de começo ajustado a 3 um, de ponta a 0 mm, e tempo para 1 seg. Clique em "Empate" e feche a janela do editor de função.
   2. Na Tab Força do Painel-Mestre, marque "rampa penetrador depois do disparo" e definir a função de força aplicada para disparar depois de atingir um ponto de disparo de 0,1 V.
   3. Clique em "Force Single" na parte inferior do Tab Força do Painel-Mestre, que irá acionar a função de recuo construído-aplicado para a força de relaxamento.
   4. Depois que o único recuo força é terminado, levantar a cabeça AFM para que sejafora de contato com a amostra e, em seguida, voltar a envolver a cabeça e re-deflexão zero.
   5. Reposicionar o palco para localizar uma nova área de interesse, e baixar a cabeça para fazer contato.
   6. Repita os passos de 5,3-5,5 até que a quantidade desejada de dados foram coletados.
6. Concluímos experiências e clean-up.
   1. Depois de concluir experiências, levantar a cabeça AFM e removê-lo a partir da amostra.
   2. Use um tecido laboratório para remover cuidadosamente o excesso de líquido sem tocar o cantilever.
   3. Cuidadosamente limpar o porta cantilever a AFM utilizando uma pequena quantidade de etanol. Não exponha os componentes electrónicos delicados no suporte do cantilever ao etanol. Remova o cantilever AFM e coloque em um recipiente de armazenamento.
   4. Descarte a amostra de tecido do cérebro, seguindo protocolos de biossegurança adequadas.
7. Usando MATLAB, calcular o cumprimento fluência e forçar relaxamento módulos usando a geometria penetrador, de acordo com a solução derivada por Lee e Radok de 1960 ^19.
   1. Calcular a força F e profundidade de recuo a partir de dados sobre a posição cantilever z, deflexão d, e constante da mola, k _c
      
      e .
   2. Localizar o ponto de contacto ao longo da curva de indentação utilizando o algoritmo descrito em Lin et ai. ^20.
   3. Definir uma janela de interesse para análise de dados. A janela de interesse é a região em que qualquer força (em conformidade fluência) ou profundidade de penetração (para a força de relaxamento) é mantida a um valor nominal (isto é, Região 3, como mostrado na Figura 1C, D).
   4. Para as experiências de conformidade de fluência, calcular o módulo de fluência conformidade experimental, _J-C (T), em resposta a uma carga etapan 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      ,
      em que h (t) é a função de passo Heavyside e R é o raio da sonda esférica.
   5. Para as experiências de força de relaxamento, calcular o módulo da força de relaxamento experimental, G _R (t), em resposta a uma profundidade de passo de recuo :
      .

4. Recuo Impacto

1. Calibrar o nanoindenter instrumentado e ajustar as configurações padrão para permitir experimentos impacto dinâmico no tecidos cerebrais hidratados de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Montar uma sonda esférica, deslizando-a para o pêndulo, usando uma pinça.
   2. Cole uma amostra de quartzo fundido para o poste de amostra, o qual é aparafusado no translacionaletapa.
   3. Vá para o menu Calibração e selecione "Cell líquido." Siga as instruções do software para fazer contato com a amostra de quartzo fundido.
   4. Selecione "Normal" para o tipo de Indenter e usar o valor padrão de 0,05 mN para a carga Indenter. Clique em "Continuar" para realizar a calibração para a configuração normal penetrador.
   5. Mova o estágio da amostra de volta, pelo menos, 5 mm. Montar o braço de alavanca, o que permite que a sonda a ser baixada para dentro da célula de líquido, e repetir a calibração da célula de líquido na nova configuração, seleccionando "Cell líquido" para o tipo Indenter. Clique em "Continuar" para obter o líquido Fator de Calibração celular.
   6. Ative a opção de software celular líquido, indo para o menu Experiment e selecionando "Opções especiais." Use o valor de calibração mais recente.
   7. Aumentar o espaçamento entre as placas do capacitor como isso vai levar a uma maior profundidade máxima mensurável, o que é necessário quando se testa higmateriais hly conformes.
      1. No menu Sistema, selecione "Configurações não Protegidas" e "Parâmetros da máquina" para alterar a taxa de teste do pêndulo de carga, taxa de carga zero, e rampa de espera compensar a 0,5 mN / seg, 0,1 mN / sec e 3 V, respectivamente.
      2. Com uma chave, vire as três porcas que controlam o horário espaçamento entre as placas do capacitor em pequenos incrementos.
      3. Depois de cada volta no sentido horário completo, selecione "Ajuste Ponte Box" no menu Manutenção e obter um bom teste do pêndulo, o que exigirá movendo o peso de contrapeso longe do pêndulo.
      4. Repita os passos até que a calibração 4.1.7.2-4.1.7.3 profundidade aproximada lê um valor de 70.000 nm / V ou superior.
   8. Posicionar um novo limite de parada, na parte inferior do pêndulo que pode ser ligado e desligado através de uma fonte de alimentação. Retraia o batente inicial sentado atrás do pêndulo para remover uma obstrução potencial do movimento pendular e permitem maiorvelocidades de impacto, bem como profundidades de penetração mais elevadas em amostras conformes.
   9. Permitir que o gabinete para atingir o equilíbrio térmico (demora cerca de 1 hora).
   10. Enquanto o gabinete equilibra, voltar para o menu Sistema e selecione "Configurações não protegidos" e "Máquina de Parâmetros". Defina a profundidade da velocidade de calibração (DCAL) de contacto a 1 mm / s, a velocidade de contacto recuo primário para 3 mm / s, e os ultra baixa velocidade contacto carga a 1 mm / seg.
   11. Sob o menu de calibração, execute uma calibração profundidade padrão nessa nova configuração.
   12. Ligue o fornecimento de energia para o solenóide e configurá-lo para 10 V. Vá para o menu Experiment e selecione "Impacto" e "Ajuste Impulse deslocamento". Siga as instruções do software (prompts automáticos) para calibrar a distância balanço do pêndulo.
2. Montar o tecido cerebral do rato na célula líquido.
   1. Após a colheita todo o cérebro de step 1.5, armazená-lo imediatamente em CO ₂ independente de meio nutriente para meios de tecido neural adulto no gelo.
   2. Quando a configuração da reentrância impacto é totalmente completa, transferir cuidadosamente o cérebro para uma placa de Petri, juntamente com o CO ₂ independente de forma. Cortar o cérebro em 6 mm de espessura com superfícies planas em ambos os lados.
   3. Aderir o tecido cortado para o posto de amostra de alumínio com uma camada fina de adesivo de cianoacrilato.
   4. Deslize a pilha líquido sobre o segundo anel de vedação sobre o post da amostra, e preencher a célula líquido com 5 ml de CO ₂ médio independente de imergir completamente o tecido. Este post amostra é então cuidadosamente montado para o palco de translação dentro da nanoindenter instrumentado.
3. Medir a resposta impacto do tecido cerebral.
   1. Se necessário, retire a sonda esférica e substituí-lo com a sonda de interesse, sem retirar o braço de alavanca.
   2. No menu Sistema, selecione "Não protegidoConfigurações "e" Máquina de parâmetros. "Alterar a velocidade de contacto impacto primário para 5 mm / seg.
   3. Com o banho de amostra baixo (direcção -z) e longe do pêndulo (+ x), mover-se na direcção -x, até a ponta sobre o braço de alavanca está adequadamente localizado acima do banho. Mover-se na direcção + z até que a ponta está completamente submerso no banho e em frente da amostra.
   4. Usando a janela controle do estágio da amostra, fazer contato com cuidado e, em seguida, voltar ao palco de distância da superfície da amostra em cerca de 30 mm.
   5. Sob o menu Experiment, clique em "Impacto" para configurar um experimento impacto. Escolha uma carga impulso específico que se relacionam diretamente com a velocidade de impacto resultante com base na calibração do balanço distância. Executar o experimento programado.
   6. Quando o pêndulo oscila para trás e para a superfície da amostra continua a mover-se ao plano de medição, ligue o interruptor de fim de curso inferior off.
   7. Observe como o pêndulo balança FORWard para impactar a amostra. O deslocamento da sonda como uma função de tempo será registado pelo software.
   8. Quando a janela do palco xyz aparecer, ligue o interruptor de fim de curso de volta.
   9. Repita os passos de 3,4-3,8 para testar o maior número de cargas e locais diferentes, conforme necessário.
4. Analisar o deslocamento adquiriu vs. tempo de resposta do pêndulo usando scripts MATLAB personalizadas para determinar a profundidade máxima de penetração x _max, capacidade de dissipação de energia K, e dissipação fator de qualidade Q. ¹¹
   1. Vá para o menu Análise e exportar os dados em um arquivo de texto.
   2. Aqui a derivada temporal do perfil de deslocamento para obter a velocidade em função do tempo. Ajuste de zero deslocamento como o ponto de contato x _o1.
      NOTA: Impacto _na velocidade v é a velocidade máxima imediatamente antes do contacto X _max corresponde à deformação em que a sonda.primeira velocidade diminui para zero. x _O2, que é equivalente a X _R, é a posição necessária para reiniciar o contacto com a amostra deformada no próximo ciclo. Velocidade Rebound v _fora é a velocidade no deslocamento x _r.
   3. Definir K (sem unidade) como a energia dissipada pela amostra normalizado pela soma das energias de amostra recuperados e dissipou-se durante o primeiro ciclo de impacto. Calcular K com base nas propriedades intrínsecas do pêndulo ²¹ (tal como rigidez e coeficiente de amortecimento de rotação), _O1 x, x _max, x _{r, v,} e v _a.
      NOTA: Para mais informações, pode consultar o trabalho de Kalcioglu et al, 2011..
   4. Desde o deslocamento pode ser descrito como um movimento oscilatório harmônico amortecido, encaixar uma função de decaimento exponencial aos valores máximos das discolocação vs a curva do tempo.
   5. Calcular Q (sem unidade) como π multiplicado pelo número de ciclos necessários para a amplitude de oscilação para diminuir por um factor de e. Um valor Q maior significa uma taxa de dissipação de energia mais baixo.

5. Reologia

1. Defina-se e calibrar o reómetro de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Inicializar o reômetro abrindo o painel do dispositivo / controle. No separador do painel de controle, clique em "inicializar".
   2. Montar a placa 25 mm de diâmetro de medição (PP25) e o sistema térmico.
   3. (Opcional) Para reduzir o deslizamento entre as placas e o reómetro de tecido, cortar fatias de lixa adesivas que correspondem à forma da placa de topo reómetro e aderem a lixa para a placa superior e inferior.
   4. Faça contato entre a placa superior e inferior, clicando em "definir a zero gap" no painel de controle.
   5. Zerar o transdutor normal de força por parte clicking "reset força normal."
   6. Realizar um teste de inércia, abrindo o guia de serviço no painel de controle, clicando em "sistema de medição", e depois clicar em "teste de inércia". Grave o velho eo novo inércia. Verificar que a inércia está dentro do limite permitido para a sonda, como listado pelo fabricante.
2. amostra de carga em reômetro.
   1. Após a colheita do tecido e cortar um segmento coronal do cérebro de porco à espessura ~ 5 mm, armazená-lo no gelo em CO ₂ médio independente de.
   2. Colocar o cérebro entre as duas placas. Remover grandes gotas de água a partir da superfície superior e inferior da amostra para evitar o deslizamento, mas não secar a amostra.
   3. Lentamente baixar a placa de medição até que a placa é completamente em contacto com a superfície superior do tecido e a força normal medido é consistente em 0.01 mN após um período de relaxação de 5-10 min.
      1. No painel de controle, digite alturas sucessivamente mais baixas in caixa e posição de medição clique em "posição de medição" para reduzir lentamente a placa de medição.
      2. Quando no interior de um milímetro de contacto com o tecido, baixar a placa de medição, em incrementos de 0,1 mm até que o prato está completamente em contacto com a superfície superior do tecido. Certifique-se que a força medida normal é consistentemente em 0.01 mN depois de um período de relaxamento 5-10 min.
      3. Grave a força normal de medição inicial. medições repetidas devem ser tomados ao mesmo compressão de tensões / deformações.
   4. Aparar a amostra com uma lâmina de plástico, se a amostra for superior ao diâmetro da placa. Pipetar um pequeno volume (~ 1-2 mL) dos meios sobre as arestas da amostra para hidratar o tecido.
   5. (Opcional) Abaixe a capa térmica. No painel de controle, defina a temperatura para 37 ° C e clique em "set".
3. Executar uma varredura de amplitude para estabelecer a gama viscoelástica linear do material (ou seja, o cisalhamentoestirpes em que G 'e G' 'são constantes) a frequências de interesse (por exemplo, 1 rad / seg).
   1. Selecione "File / New". Sob a guia gel selecione "varredura Amplitude: LVE-range". Selecione a janela e clique em "Medição 1: Varredura de Amplitude." Dê um duplo clique na caixa de oscilação. Introduza a estirpe inicial e final (por exemplo, 0,01-105), a frequência (por exemplo, 1 rad / seg) e o número de pontos por década (por exemplo, 6 pontos / dec). Selecione "ok" e clique em start ".
   2. Repita este procedimento para várias fatias com ensaios repetidos para garantir a consistência da faixa elástica linear. A compressão axial da amostra deve permanecer constante entre as amostras.
4. Realizar um varrimento da frequência de tecido a uma tensão na gama viscoelástica linear do tecido (por exemplo, 1% de deformação) ^22, e a uma gama de interesse (por exemplo, 0,1-100 rad / s) frequência.
   1. Clique "File / New" e sob o separador gel selecionar "Varredura de freqüência." Clique na janela / medição 1: Varredura de freqüência. Dê um duplo clique na caixa de oscilação. Entre a gama de frequências (por exemplo, 0,1 a 100 rad / s), a estirpe (por exemplo, 1% de deformação) e o número de pontos por década (por exemplo, 6 pontos / dec). Selecione "ok" e clique em "Iniciar" para iniciar a varredura de freqüência.
5. sweep Repita frequência (passo 5.4) em duplicado ou triplicado.
6. Reveja os dados que são calculados automaticamente e exportado pela rheometer: G 'e G "em função da frequência (varredura de freqüência) ou tensão de cisalhamento (varredura de amplitude). NOTA: G' e G '' são calculados a partir da amostra (máxima ) T 'reacional binário amplitude _0, e ângulo de deslocamento de rotação (ou ângulo de deflexão) E atraso de faseEquação 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>, da resposta da amostra com a estirpe oscilatório aplicada (Figura 3):
   
   
   em que R e h são o raio e altura da amostra.

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Resultados

A Figura 4 mostra recuo representativa e força versus respostas de tempo (Figura 4B, E) para o cumprimento de fluência e forçar experiências de relaxação, dada uma força aplicada ou profundidade de indentação (Figura 4A, D), respectivamente. Utilizando estes dados e a geometria do sistema, o cumprimento fluência J _c (t) e do relaxamento da força módulos G _R (T) pode ser calculada para d...

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Discussão

Cada técnica apresentada neste artigo mede diferentes facetas de propriedades mecânicas do tecido cerebral. cumprimento fluência e relaxação de tensão módulos são uma medida das propriedades mecânicas dependentes do tempo. Os módulos de armazenamento e de perda representam propriedades mecânicas dependentes de taxa. Impacto recuo também mede propriedades mecânicas dependentes da taxa, mas no contexto de dissipação de energia. Ao caracterizar as propriedades mecânicas dos tecidos, tanto recuo permitiu-AFM...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine	Lloyd Laboratoried		perscription drug
Ketamine	AnaSed Injections		perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome)	Leica	VT1200
Hibernate-A Medium	Gibco	A1247501	CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
Petri Dish Heater	Asylum Research	-
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere	Novascan	PT.GS
Cell-Tak	Corning	354240	mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N	Sigma-Aldrich	59223C	alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage	Micro Materials Ltd.	-	probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell	Micro Materials Ltd.	-
Parallel Plate Rheometer MCR501	Anton-Parr	-
PP25	Anton-Parr	-	25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper	McMaster-Carr	4184A48	alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive	Henkel	20268	alternate suppliers can be used