La caratterizzazione delle proprietà meccaniche del multiscala cervello tessuti utilizzando microscopia a forza atomica, Impatto rientro, e Reometria

Riepilogo

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

Abstract

Per progettare e ingegnere materiali ispirati dalle proprietà del cervello, sia per simulanti meccanici o per studi di rigenerazione del tessuto, il tessuto cerebrale stesso deve essere ben caratterizzata a varie scale di lunghezza e di tempo. Come molti tessuti biologici, tessuto cerebrale presenta una complessa struttura gerarchica. Tuttavia, a differenza di molti altri tessuti, cervello è molto bassa rigidità meccanica, con moduli di Young elastico E dell'ordine di 100s di Pa. Questa bassa rigidità può presentare sfide alla caratterizzazione sperimentale delle principali proprietà meccaniche. Qui, dimostriamo diverse tecniche di caratterizzazione meccanica che sono state adattate per misurare le proprietà elastiche e viscoelastiche di materiali idratati conformi biologici come tessuto cerebrale, a diverse scale di lunghezza e tassi di carico. Al microscala, conduciamo esperimenti di creep-compliance e la forza di rilassamento utilizzando microscopio a forza atomica abilitato indentazione. Al mesoscale, abbiamo eseguire esperimenti di indentazione di impatto con un penetratore strumentato pendolo-based. Al macroscala, conduciamo piatto reometria paralleli per quantificare il dipendente dalla frequenza di taglio moduli elastici. Discutiamo anche le sfide e le limitazioni associate con ogni metodo. Insieme queste tecniche consentono una caratterizzazione approfondita meccanica del tessuto cerebrale che può essere utilizzato per comprendere meglio la struttura del cervello e di ingegnere dei materiali bio-ispirati.

Introduzione

La maggior parte dei tessuti molli comprendenti organi biologici sono meccanicamente e strutturalmente complessa, una bassa rigidità rispetto a osso mineralizzato o materiali ingegnerizzati, e mostrano la deformazione non lineare e tempo-dipendente. Rispetto ad altri tessuti del corpo, tessuto cerebrale è notevolmente compatibile con moduli elastici E dell'ordine di 100s di Pa ^1. tessuto cerebrale presenta eterogeneità strutturale con il grigio distinto e interdigitata e le regioni sostanza bianca che differiscono anche funzionalmente. meccanica tessuto cerebrale comprensione sarà di aiuto nella progettazione di materiali e modelli computazionali per imitare la risposta del cervello durante ferita, facilitare la previsione dei danni meccanici e consentire ingegnerizzazione di strategie protettive. Inoltre, tali informazioni possono essere usate per esaminare obiettivi di progettazione per la rigenerazione tissutale, e per comprendere meglio i cambiamenti strutturali nel tessuto cerebrale che sono associati con malattie come la sclerosi multipla e l'autismo. Here, descriviamo e dimostriamo diversi approcci sperimentali che sono disponibili per caratterizzare le proprietà viscoelastiche dei tessuti compatibili meccanicamente tra cui tessuto cerebrale, al micro, meso e macro-scala.

Al microscala, abbiamo condotto scorrimento rispetto e la forza esperimenti di rilassamento utilizzando microscopio a forza atomica (AFM) indentazione -enabled. Tipicamente, indentazione AFM abilitato viene utilizzato per stimare il modulo elastico (o rigidità istantanea) di un campione ^2-4. Tuttavia, lo stesso strumento può essere utilizzato anche per misurare viscoelastico microscala (tempo o rate-dipendente) proprietà ^5-10. Il principio di questi esperimenti, mostrate nella Figura 1, è far rientrare un AFM sbalzo sonda nel tessuto cerebrale, mantenere una determinata grandezza di forza o profondità di indentazione, e misurare le corrispondenti variazioni di profondità di indentazione e forza, rispettivamente nel tempo. L'utilizzo di questi dati, si può calcolare la deformazione comp, liance J _C e relax modulo G _R, rispettivamente.

Al mesoscala, abbiamo condotto esperimenti di indentazione impatto in condizioni di liquido immersi che mantengono la struttura dei tessuti e livelli di idratazione, utilizzando un nanoindentatore strumentato pendolo-based. L'apparato sperimentale è illustrato nella figura 2. Come il pendolo oscilla in contatto con il tessuto, sonda spostamento è registrata come una funzione di tempo finché il pendolo oscillante si ferma all'interno del tessuto. Dal smorzato moto oscillatorio armonico risultante della sonda, è possibile calcolare la profondità massima penetrazione x _max, capacità di dissipazione di energia K e fattore di qualità Q di dissipazione (che riguarda il tasso di dissipazione dell'energia) del tessuto ^11,12.

Al macroscala, abbiamo usato un piatto reometro paralleli per quantificare il dipendente dalla frequenza di taglio moduli elastici,chiamato lo stoccaggio modulo G 'e modulo viscoso G ", del tessuto. In questo tipo di reometria, si applica una tensione angolare armonica (e corrispondente deformazione di taglio) ad ampiezze noti e frequenze e misurare la coppia di reazione (e corrispondente shear stress) , come mostrato in figura 3. Dalla risultante ampiezza e la fase di latenza della coppia misurata e variabili geometriche del sistema, si può calcolare G 'e G "a frequenze applicate di interesse ^13,14.

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Protocollo

Etica Dichiarazione: Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato per la ricerca degli animali del pediatrico di Boston e sono conformi con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. cervello di topo procedure tessuto di acquisizione (per l'indentazione AFM-enabled e indentazione impatto)

1. Preparare una miscela di ketamina / xylazina per anestetizzare i topi. Combinare 5 ml di ketamina (500 mg / ml), 1 ml xilazina (20 mg / ml) e 7 ml di 0,9% di soluzione salina.
2. Iniettare mouse (Razza: TSC1; Syn-Cre; PLP-eGFP; Età: p21; Sesso: maschio o femmina) con 7 ml per grammo di peso corporeo della soluzione di ketamina / xylazina.
3. Una volta che il mouse è completamente anestetizzato, come dimostrato da una mancanza di risposta a punta e coda pizzichi, eutanasia il mouse per decapitazione usando grandi forbici dissezione.
4. Rimuovere il cranio, diminuendo la metà con le forbici dissezione più piccoli. Partendo dal cervelletto, rempezzi ove del cranio con pinze curve. Dopo aver rimosso il cranio, estrarre il cervello utilizzando una spatola piatta per sollevare il cervello, partendo cervelletto, e posizionare il cervello su un piatto Petri. Rimuovere il cervelletto dal cervello usando una lama di rasoio.
5. Se si utilizza un intero cervello per le prove di indentazione di impatto sul tessuto fresco, il trasferimento del cervello in un tubo a fondo tondo con CO ₂ mezzo nutriente -indipendente per tessuto nervoso adulto su ghiaccio e passare alla sezione 4. In caso contrario procedere al punto 1.6 delle procedure per affettare.
6. Regolare le impostazioni vibratome ad una velocità 0,7 mm / sec, una frequenza di vibrazione di 70 Hz, e spessore di strato di 350 micron. Circondano il piatto vibratome con ghiaccio. Mettere una piccola quantità di colla sulla piastra vibratome e montare cervello in modo che le fette coronali possono essere tagliati, con il cervello orientato a tagliare il lato dorsale prima.
7. Riempire il piatto vibratome con tampone fosfato salina abbastanza Dulbecco (DPBS) per immergere solo il cervello. Aumentareil piatto sul vibratome in modo che la lama è solo immerso nel DPBS.
8. Premere Start per iniziare affettare sezioni del cervello coronali 350 micron di spessore.
9. Utilizzando pennelli per evitare danni al tessuto, trasferire le fette di cervello dal bagno vibratome DPBS e in un tubo a fondo tondo con CO ₂ mezzo nutriente -indipendente per tessuto nervoso adulto su ghiaccio e di eseguire misure su tessuto fresco entro 48 ore. Per iniziare esperimenti di indentazione AFM-enabled, passare alla sezione 3.

2. Pig cervello procedure sui tessuti di acquisizione (per reologia)

1. Ottenere un sagittalmente fette suina metà del cervello all'interno di ~ 1 ora di sacrificio da un macellaio locale. Posizionare la metà del cervello di CO ₂ mezzo nutriente -indipendente per tessuto neurale adulta, e memorizzare sul ghiaccio.
2. Utilizzare una lama di rasoio o bisturi per fare una spessa fetta cervello coronale ~ 5 mm e conservare in CO ₂ mezzo nutriente -indipendente per il tessuto nervoso adulto. Assicurarsi che la fetta surface è più piatta possibile. Uso attento movimenti laterali con rasoio / bisturi durante il sezionamento.
3. Conservare tessuto cerebrale maiale di CO ₂ mezzo nutriente -indipendente per tessuto nervoso adulto su ghiaccio e di eseguire misurazioni reometria (sezione 5) su tessuto fresco entro 48 ore.

3. microscopio a forza atomica abilitato indentazione

1. Preparare piatti 60 millimetri di diametro Petri (P60) con un bioadesivo cozza-derivati ​​in base alle istruzioni del produttore.
   1. Preparare uno stock di soluzione tampone neutro consistente di 0,1 M sodio bicarbonato in acqua sterile con un pH ottimale di 8,0. Filtro-sterilizzare (0,2 micron) il buffer di bicarbonato di sodio e conservare a 4 ° C.
   2. In una cappa a flusso laminare, miscelare una soluzione di 6,25% mitili derivato bio-adesivo e 3,125% NaOH in tampone bicarbonato di sodio.
   3. Dispensare 100ul della soluzione bio-adesivo 3.1.2 su 60 mm di diametro Petri (P60) piatto e l'uso della pipetta punta a diffondere solution in un cerchio del diametro di 3-5 cm.
   4. Lascia P60 piatti scoperti in cappa a flusso laminare e lasciare asciugare la soluzione (~ 30 min). piatti di lavaggio 1X con PBS e 2x con acqua sterile. Lasciare asciugare i piatti d'aria in cappa a flusso laminare e conservare in un sacchetto di plastica sigillato a 4 ° C per un massimo di 1 mese.
2. Calibrare la AFM e il campione del cervello set-up nel AFM.
   NOTA: Seguire le istruzioni di calibrazione AFM come per il costruttore.
   1. Sistemare con cura e una sonda AFM con una costante elastica nominale di 0,03 N / m ed un micron di diametro tallone 20 borosilicato nel supporto sonda.
   2. Calibrare la costante della molla e inverse ottica sensibilità leva (InvOLS) del cantilever AFM con il metodo melodia termico ^15,16.
      NOTA: Una volta che la costante elastica per una sonda AFM viene calcolato, deve rimanere costante con l'uso ripetuto. Tuttavia, dovranno essere ricalibrato ogni volta che il laser è riallineato con il cantilever i InvOLS a sbalzo. Inoltre, la calibrazionedeve essere effettuata contro un substrato diversi ordini di grandezza più rigido rispetto al cantilever, quale polistirene.
   3. Accendere il riscaldamento palco montato e la temperatura impostata a 37 ° C.
   4. Montare la fetta cervello sulle stoviglie P60 preparati nella sezione 3.1.
      1. Versare delicatamente una fetta cervello spessore 350 micron, così come la CO ₂ medio -indipendente dal pallone a fondo tondo in un piatto P60 rivestiti con il bioadesivo mitili derivato.
      2. Inclinando leggermente il piatto P60, posizionare la fetta cervello al centro del piatto. Se necessario, pipettare lentamente media da un pipetter manuale per dispiegare una fetta cervello che è ripiegata su se stessa o meglio posizionare la fetta cervello nel centro del piatto.
      3. Rimuovere l'eccesso di supporto utilizzando un pipetter P1000 (non utilizzare il vuoto).
      4. Posizionare la copertura sul piatto P60 e lasciare la fetta cervello aderire per 20 min.
   5. Togliere la testa AFM, posizionare la fetta cervello montato nella P60piatto sul palco AFM, e aggiungere ~ 2 ml preriscaldata CO ₂ media -indipendente.
   6. aggiungere cautela una goccia di supporto sulla sonda AFM per proteggerlo dalla rottura dovuta alla tensione superficiale quando viene abbassato nel mezzo circostante la fetta cervello.
   7. Riposizionare la testa AFM sul palco, e cominciare abbassando la testa fino a quando non è immerso nei media.
   8. Utilizzo della fotocamera CCD top-view, riposizionare il laser sul cantilever.
      NOTA: L'allineamento del laser sul cantilever sarà cambiato leggermente a causa della differenza di indice di rifrazione dell'aria e medio.
   9. Attendere 5 minuti per il cantilever per regolare ad essere immerso in un liquido caldo, quindi reimpostare l'allineamento specchio per una deviazione libera di 0 V.
   10. Eseguire uno spettro termico sulla sonda AFM secondo le istruzioni ¹⁶ del produttore. Utilizzare la misura del primo picco termico a ricalcolare InvOLS della sonda AFM nei media.
   11. Utilizzando il microscopio ottico,spostare la fase del campione in modo che la regione del cervello di interesse al di sotto della sonda AFM.
       NOTA: il corpo calloso appare scura in quanto è più opaco rispetto alla materia grigia circostante. La corteccia è superiore al corpo calloso.
   12. Ripristinare l'allineamento specchio per una deviazione libera di 0 V.
   13. Sulla somma e deflessione Meter nel software AFM, fai clic su "Engage" per impegnare la testa AFM.
   14. Utilizzando il selettore posizione sulla testa AFM, abbassare la testa fino avviene il contatto tra il cantilever e campione.
3. (Opzionale) Se lo si desidera, misurare il modulo elastico del campione, come descritto in precedenza ^4,17,18.
4. Condurre esperimenti di conformità di scorrimento.
   1. Costruire una funzione di forza applicata in editor di funzioni del software. La funzione forza costituito da una rampa 0,1 sec a un set point di 5 nN rilasciarlo per 20 sec, seguito da un 1 sec rampa di discesa ad una forza applicata da 0 nN.
      1. Al rientro Master Panel, con il metodo del rientro, selezionare "Load" per la modalità penetratore; "N" per le unità; e "Editor funzione" per la funzione penetratore.
      2. Nell'editor la funzione, sul segmento Parms pannello, creare un segmento funzione di forza applicata che parte da 0 NN, termina a 5 NN, con un tempo di 0,1 sec. Fai clic su "Inserisci ->".
      3. Per il segmento successivo, set iniziare a 5 NN, fine a 5 NN, e il tempo di 20 sec. Fai clic su "Inserisci ->".
      4. Per il segmento finale, fissata iniziare a 5 NN, fine a 0 NN, e il tempo di 1 sec. Fai clic su "Draw" e chiudere la finestra Editor funzione.
   2. Nella scheda forza del Master Panel, selezionare "rampa penetratore dopo trigger" e impostare la funzione di forza applicata per far scattare dopo aver raggiunto un livello di attivazione di 0,1 V.
   3. Fai clic su "Single Force" sulla parte inferiore della scheda forza del Master Panel, che attiverà la funzione di forza costruita applicata per la conformità scorrimento.
   4. Dopo ilsingola indentazione forza è finita, sollevare la testa AFM modo che sia fuori dal contatto con il campione e poi ri-impegnare la testa e ri-flessione zero libera.
   5. Riposizionare la fase del campione per individuare una nuova area di interesse, e abbassare la testa AFM di entrare in contatto. NOTA: La testa AFM deve essere ritirato dalla superficie del campione quando si sposta la fase di campionamento. In caso contrario, può causare danni al delicato cantilever AFM.
   6. Ripetere i passaggi 3.4.3-3.4.5 fino quantità desiderata di dati sono stati raccolti.
5. Condurre esperimenti di rilassamento di forza.
   1. Costruire una funzione di rientro applicata in editor di funzioni del software. La funzione indentazione costituito da una rampa 0,1 sec a un set point di 3 micron e tenerlo premuto per 20 sec, seguito da un 1 sec rampa fino a una profondità di penetrazione di 0 micron.
      1. Sul pannello Maestro rientro, con il metodo del rientro, selezionare "rientro" per la modalità penetratore; "M" per le unità; e "; Editor di funzione "per penetratore funzione.
      2. Nell'editor funzione, sul segmento Parms Panel, creare un segmento funzione forza applicata che inizia da 0 micron, termina a 3 micron, con un tempo di 0,1 sec. Fai clic su "Inserisci ->".
      3. Per il segmento successivo, set inizierà a 3 micron, fine a 3 micron, e il tempo di 20 sec. Fai clic su "Inserisci ->".
      4. Per il segmento finale, fissata iniziare a 3 micron, fine a 0 micron, e il tempo di 1 sec. Fai clic su "Draw" e chiudere la finestra Editor funzione.
   2. Nella scheda forza del Master Panel, selezionare "rampa penetratore dopo trigger" e impostare la funzione di forza applicata per far scattare dopo aver raggiunto un livello di attivazione di 0,1 V.
   3. Fai clic su "Single Force" sulla parte inferiore della scheda forza del Master Panel, che attiverà la funzione di rientro costruito applicata per forza di relax.
   4. Dopo il singolo indentazione forza è finita, sollevare la testa AFM modo che siafuori dal contatto con il campione e poi ri-impegnare la testa e ri-flessione zero.
   5. Riposizionare la fase di individuare una nuova area di interesse, e abbassare la testa di entrare in contatto.
   6. Ripetere i passaggi 5,3-5,5 fino a quando sono state raccolte quantità desiderata di dati.
6. Concludere esperimenti e pulizia.
   1. Dopo aver concluso gli esperimenti, sollevare la testa AFM e rimuoverlo dal campione.
   2. Utilizzare un tessuto laboratorio per rimuovere con attenzione il liquido in eccesso senza toccare il cantilever.
   3. Pulire accuratamente il supporto cantilever AFM utilizza una piccola quantità di etanolo. Non esporre i componenti elettronici delicati sul supporto a sbalzo di etanolo. Rimuovere il cantilever AFM e posto in un contenitore di stoccaggio.
   4. Smaltire il campione di tessuto cerebrale, seguendo i protocolli di biosicurezza adeguate.
7. Utilizzando MATLAB, calcolare conformità creep e forzare rilassamento moduli utilizzando la geometria penetratore, secondo la soluzione derivata da Lee e Radok 1960 ^19.
   1. Calcolare la forza F e la profondità di indentazione dai dati sulla posizione a sbalzo z, deflessione D e costante della molla, k _c
      
      e .
   2. Individuare il punto di contatto lungo la curva di rientro utilizzando l'algoritmo descritto in Lin et al. ^20.
   3. Definire una finestra di interesse per l'analisi dei dati. La finestra di interesse è la regione in cui viene mantenuto sia vigente (compliance scorrimento) o profondità di penetrazione (forza rilassamento) ad un valore di riferimento (cioè, la regione 3 come illustrato nella Figura 1C, D).
   4. Per gli esperimenti di conformità di creep, calcolare sperimentale scorrimento conformità modulo, J _c (t), in risposta ad un carico passon 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      ,
      dove H (t) è la funzione gradino Heavyside e R è il raggio della sonda sferica.
   5. Per gli esperimenti forza rilassamento, calcolare la sperimentale modulo forza rilassamento, G _R (t), in risposta ad una profondità passo indentazione :
      .

4. indentazione Impact

1. Calibrare il nanoindentatore strumentato e regolare le impostazioni predefinite per consentire esperimenti impatto dinamico sui tessuti cerebrali idratati in base alle istruzioni del produttore.
   1. Montare una sonda sferica infilandolo il pendolo con una pinzetta.
   2. Colla un campione di quarzo fuso sul montante del campione, che viene avvitato nel traslazionalepalcoscenico.
   3. Vai al menu di calibrazione e selezionare "Cell Liquid". Seguire le istruzioni del software di entrare in contatto con il campione di quarzo fuso.
   4. Selezionare "Normale" per il tipo di penetratore e utilizzare il valore predefinito di 0,05 mN per il carico penetratore. Fai clic su "Continua" per eseguire la calibrazione per la configurazione penetratore normale.
   5. Spostare la fase del campione indietro di almeno 5 mm. Montare il braccio di leva, che permette alla sonda di essere abbassato nella cella liquido, e ripetere la calibrazione della cella liquido nella nuova configurazione selezionando "Cell Liquid" per il Tipo penetratore. Fai clic su "Continua" per ottenere il fattore di cella Calibrazione Liquido.
   6. Attivare l'opzione software cellulare Liquid andando al menu Experiment e selezionando "Opzioni speciali." Utilizzare il valore di taratura più recente.
   7. Aumentare la distanza tra le piastre condensatore come questo porterà ad una maggiore profondità massima misurabile, che è necessaria quando si prova higmateriali HLY compliant.
      1. Nel menu di sistema, selezionare "Impostazioni protette non" e "Parametri macchina" per cambiare la frequenza di test del pendolo di carico, velocità di carico pari a zero, e la rampa di standby offset per 0,5 mN / sec, 0,1 mN / sec, e 3 V, rispettivamente.
      2. Con una chiave, ruotare i tre dadi che controllano la spaziatura piatto condensatore in senso orario in piccoli incrementi.
      3. Dopo ogni giro completo in senso orario, selezionare "Regolazione Ponte Box" sotto il menu di manutenzione e di ottenere un buon test del pendolo, che richiederà lo spostamento del peso contrappeso dal pendolo.
      4. Ripetere i passaggi 4.1.7.2-4.1.7.3 fino alla calibrazione approssimativa di profondità legge un valore di 70.000 nm / V o superiore.
   8. Posizionare una nuova battuta sul fondo del pendolo che può essere inserito e disinserito tramite un alimentatore. Ritrarre la battuta originale seduto dietro il pendolo per rimuovere una potenziale ostruzione del moto del pendolo e consentire maggiorevelocità d'impatto e profondità di penetrazione più elevati in campioni conformi.
   9. Lasciare che il gabinetto per raggiungere l'equilibrio termico (dura circa 1 ora).
   10. Mentre l'armadio equilibra, tornare al menu Sistema e selezionare "Impostazioni non protetto" e "parametri della macchina." Impostare la velocità di calibrazione (DCAL) Contatto profondità 1 micron / sec, la velocità di contatto indentazione primario 3 micron / sec, e la velocità ultra bassa contatto carico 1 um / sec.
   11. Nel menu di calibrazione, eseguire una calibrazione profondità standard in questa nuova configurazione.
   12. Accendere l'alimentazione per il solenoide e impostarlo a 10 V. Vai al menu Experiment e selezionare "Impact" e "Regola Impulse Displacement". Seguire le istruzioni del software (prompt automatici) per calibrare la distanza oscillazione del pendolo.
2. Montare il tessuto cerebrale del mouse nella cella liquido.
   1. Dopo la raccolta l'intero cervello da step 1.5, conservarlo subito in CO ₂ mezzo nutriente -indipendente per i media tessuto nervoso adulto su ghiaccio.
   2. Quando la messa a punto di impatto rientro è del tutto completa, trasferire accuratamente il cervello in una capsula di Petri con CO ₂ media -indipendente. Tagliate il cervello in 6 mm di spessore con sezioni superfici piatte su entrambi i lati.
   3. Aderire il tessuto fette al posto del campione di alluminio con un sottile strato di adesivo cianoacrilato.
   4. Far scorrere la cella liquido sul secondo O-ring sul palo campione e riempire la cella liquido con 5 ml di CO ₂ medio -indipendente immergere completamente il tessuto. Questo post campione viene poi accuratamente montato sul palco traslazionale all'interno del nanoindentatore strumentato.
3. Misurare la risposta all'impatto del tessuto cerebrale.
   1. Se necessario, rimuovere la sonda sferica e sostituirla con la sonda di interesse senza rimuovere il braccio di leva.
   2. Nel menu Sistema, selezionare "non protettiImpostazioni "e" Macchina parametri. "Cambiare la velocità di contatto impatto primario a 5 micron / sec.
   3. Con il bagno di esempio basso (direzione -z) e lontano dal pendolo (+ direzione x), muoversi nella direzione -x finché la punta del braccio leva è correttamente posizionato sopra la vasca. Spostare nella direzione + z finché la punta è completamente immerso nella vasca e di fronte al campione.
   4. Utilizzando la finestra di controllo fase del campione, entrare in contatto con cura e poi di nuovo il palcoscenico di distanza dalla superficie del campione di circa 30 micron.
   5. Sotto il menu Experiment, cliccare su "Impact" per impostare un esperimento impatto. Scegliere uno specifico carico di impulso che si riferiscono direttamente alla velocità d'impatto conseguente sulla base della taratura distanza di oscillazione. Eseguire l'esperimento programmato.
   6. Quando il pendolo oscilla avanti e la superficie del campione continua a muoversi al piano di misura, accendere l'interruttore di arresto di fine corsa di fondo off.
   7. Osservare come il pendolo oscilla forward per l'impatto del campione. Lo spostamento della sonda in funzione del tempo sarà registrato dal software.
   8. Quando appare la finestra fase xyz, girare l'interruttore di fine corsa indietro.
   9. Ripetere i passaggi 3,4-3,8 per testare il maggior numero di carichi e luoghi diversi a seconda delle necessità.
4. Analizzare lo spostamento acquisito rispetto al tempo di risposta del pendolo utilizzando script MATLAB personalizzati per determinare la massima profondità di penetrazione x _max, capacità di dissipazione di energia K, e la dissipazione di fattore di qualità Q. ¹¹
   1. Vai al menu Analisi ed esportare i dati in un file di testo.
   2. Prendere la derivata temporale del profilo di spostamento per ottenere velocità in funzione del tempo. Impostare a zero spostamento come il punto di contatto x _o1.
      NOTA: Impact velocità v _in è la velocità massima immediatamente prima del contatto x _max corrisponde alla deformazione in cui la sonda.velocità prima diminuisce a zero. x _o2, che è equivalente a x _r, è la posizione necessaria per ricominciare contatto con il campione deformato nel ciclo successivo. Velocità di rimbalzo v _out è la velocità in dislocamento x _r.
   3. Definire K (adimensionale) come l'energia dissipata dal campione normalizzato dalla somma delle energie campione recuperati e dissipata durante il primo ciclo di impatto. Calcolare K in base alle proprietà intrinseche del pendolo ²¹ (come rigidezza rotazionale e coefficiente di smorzamento), x _o1, x _max, x _{r, v,} e V _OUT.
      NOTA: Per ulteriori informazioni, si può consultare il lavoro di Kalcioglu et al, 2011..
   4. Dal momento che lo spostamento può essere descritto come un moto oscillatorio armonico smorzato, inserire una funzione di decadimento esponenziale ai massimali del DISposizionamento curva della volta.
   5. Calcolare Q (adimensionale) come π moltiplicato per il numero di cicli necessari per l'ampiezza di oscillazione per ridurre di un fattore e. Un valore Q più alto significa un tasso di dissipazione di energia più bassa.

5. reologia

1. Set-up e calibrare il reometro secondo le istruzioni del produttore.
   1. Inizializzare il reometro aprendo il pannello del dispositivo / di controllo. Nella scheda del pannello di controllo, fai clic su "inizializzare".
   2. Montare la piastra 25 mm di diametro misurazione (PP25) e il sistema termico.
   3. (Facoltativo) Per ridurre slittamento tra le piastre rheometer e il tessuto, tagliato a fette carta vetrata adesivi che corrispondono alla forma della piastra reometro superiore e aderiscono alla carta vetrata per la piastra superiore e inferiore.
   4. Rendere contatto tra la piastra superiore e inferiore con "impostato gap zero" sul pannello di controllo.
   5. Azzerare il trasduttore di forza normale clicking "reset forza normale."
   6. Effettuare un test di inerzia aprendo la scheda di servizio sul pannello di controllo, facendo clic su "sistema di misurazione," e poi cliccando su "test di inerzia". Registrare il vecchio e il nuovo inerzia. Verificare che l'inerzia è entro i limiti consentiti per la sonda, come indicato dal costruttore.
2. campione del carico in reometro.
   1. Dopo la raccolta il tessuto e tagliare un segmento coronale del cervello maiale di spessore ~ 5 mm memorizzarlo sul ghiaccio in CO ₂ media -indipendente.
   2. Posizionare il cervello tra le due piastre. Rimuovere grandi gocce d'acqua dalla superficie superiore e inferiore del campione per evitare lo slittamento, ma non asciugare il campione.
   3. Lentamente abbassare la piastra di misurazione finché la piastra è in pieno contatto con la superficie superiore del tessuto e la forza normale misurata è coerente a 0,01 mN dopo un periodo di rilassamento 5-10 min.
      1. Nel pannello di controllo, immettere le altezze in successione i più bassin casella posizione di misura e cliccare su "posizione di misurazione" per abbassare lentamente il piatto di misurazione.
      2. Quando all'interno di un millimetro di contatto con il tessuto, abbassare la piastra di misurazione con incrementi di 0,1 mm finché la piastra è completamente a contatto con la superficie superiore del tessuto. Assicurarsi che la forza misurata-normale è costantemente a 0.01 mN dopo un periodo di relax 5-10 min.
      3. Registrare la prima misurato forza normale. misurazioni ripetute dovrebbero essere prese le stesse sollecitazioni di compressione / ceppi.
   4. Tagliare il campione con una lama di plastica se il campione è superiore al diametro della piastra. Pipettare un piccolo volume (~ 1-2 ml) di supporti sui bordi del campione per idratare il tessuto.
   5. (Opzionale) Abbassare il cofano termica. Sul pannello di controllo, impostare la temperatura a 37 ° C e fare clic su "set".
3. Eseguire uno sweep di ampiezza per stabilire la gamma viscoelastica lineare del materiale (cioè, la cesoiaceppi in cui G 'e G' 'sono costanti) a frequenze di interesse (ad esempio, 1 rad / sec).
   1. Selezionare "File / Nuovo". Nella scheda gel selezionare "sweep Ampiezza: LVE-range". Selezionare la finestra e fare clic su "Misura 1: spazzata ampiezza." Fare doppio clic sulla casella di oscillazione. Inserire la tensione iniziale e finale (ad esempio da 0,01 a 105), la frequenza (ad esempio, 1 rad / sec) e il numero di punti per decennio (ad esempio, 6 punti / dec). Selezionare "OK" e cliccare su start ".
   2. Ripetere questa procedura per qualche fetta con prove ripetute per assicurare la coerenza del campo elastico lineare. La compressione assiale del campione deve rimanere costante tra i campioni.
4. Effettuare una frequenza di scansione del tessuto ad una deformazione nell'intervallo viscoelastica lineare del tessuto (ad esempio, 1% strain) ^22, e in un intervallo di frequenza di interesse (ad esempio, 0,1-100 rad / sec).
   1. Clic "File / Nuovo" e nella scheda di gel selezionare "sweep di frequenza." Clicca finestra / Misura 1: sweep di frequenza. Fare doppio clic sulla casella di oscillazione. Inserire la gamma di frequenza (ad esempio, da 0,1 a 100 rad / sec), il ceppo (ad esempio, 1% strain) e il numero di punti per decade (ad esempio, 6 punti / dec). Selezionare "OK" e fare clic su "Start" per avviare la scansione della frequenza.
5. Ripetere spazzata di frequenza (passo 5,4) in duplicato o triplicato.
6. Rivedere i dati che vengono calcolati ed esportati dal reometro automaticamente: G 'e G "in funzione della frequenza (frequenza di scansione) o deformazione di taglio (spazzata ampiezza). NOTA: G' e G '' sono calcolati dal (massima del campione ) l'ampiezza della coppia reazionale T _'0, e l'angolo di spostamento di rotazione (o angolo di deflessione) , E fase di latenzaEquazione 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>, della risposta del campione al ceppo oscillatorio applicata (Figura 3):
   
   
   dove R ed h sono il raggio e l'altezza del campione.

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Risultati

La figura 4 mostra indentazione rappresentante e la forza contro le risposte in tempo (Figura 4B, E) per la conformità allo scorrimento e la forza esperimenti di rilassamento, dato una forza applicata o profondità di penetrazione (Figura 4A, D), rispettivamente. Utilizzando questi dati e la geometria del sistema, il rispetto scorrimento J _c (t) e forzare il rilassamento moduli G _R (t) può essere...

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Discussione

Ogni tecnica presentata in questo articolo misura diversi aspetti della proprietà meccaniche del tessuto cerebrale. conformità Creep e lo stress di rilassamento moduli sono una misura di dipendenti dal tempo le proprietà meccaniche. I moduli di stoccaggio e perdite rappresentano proprietà meccaniche tasso-dipendente. indentazione Impact misura anche proprietà meccaniche tasso-dipendente, ma nel contesto di dissipazione di energia. Quando caratterizzare le proprietà meccaniche del tessuto, sia indentazione AFM abil...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine	Lloyd Laboratoried		perscription drug
Ketamine	AnaSed Injections		perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome)	Leica	VT1200
Hibernate-A Medium	Gibco	A1247501	CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
Petri Dish Heater	Asylum Research	-
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere	Novascan	PT.GS
Cell-Tak	Corning	354240	mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N	Sigma-Aldrich	59223C	alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage	Micro Materials Ltd.	-	probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell	Micro Materials Ltd.	-
Parallel Plate Rheometer MCR501	Anton-Parr	-
PP25	Anton-Parr	-	25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper	McMaster-Carr	4184A48	alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive	Henkel	20268	alternate suppliers can be used