Характеризуя Многомасштабное механических свойств ткани головного мозга Использование атомно-силовой микроскопии, наезд отступы и Реологии

Резюме

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

Аннотация

Для разработки и инженер материалов, вдохновленные свойствами мозга, будь то для механических имитаторов или для исследований регенерации ткани, сама ткань мозга должны быть хорошо охарактеризованы на различных масштабов длины и времени. Как и многие другие биологические ткани, ткани головного мозга обнаруживает сложную, иерархическую структуру. Тем не менее, в отличие от большинства других тканей, мозг очень низкой механической жесткости, с упругих модулей Юнга Е порядка 100е Па. Такая низкая жесткость может создавать проблемы для экспериментальной характеристике основных механических свойств. Здесь мы покажем несколько механических методов определения характеристик, которые были приспособлены для измерения упругих и вязкоупругих свойств гидратированных, совместимых биологических материалов, таких как ткани мозга, в различных масштабах длины и скоростей нагружения. На микроуровне, мы проводим ползучести соблюдения и релаксации силы эксперименты с использованием атомно-силового микроскопа с поддержкой отступа. На MesosКейл, мы проводим эксперименты с использованием отступов воздействия маятник на основе Instrumented индентора. На макроуровне, мы проводим параллельные пластины Реологии для количественной оценки частоты зависит от модуля упругости при сдвиге. Мы также обсуждаем проблемы и ограничения, связанные с каждым методом. Вместе эти методы позволяют углубленное механическую характеристику ткани головного мозга, которые можно использовать, чтобы лучше понять структуру мозга и инженеру био вдохновленный материалов.

Введение

Большинство мягких тканей-содержащие биологические органы механически и структурно сложный, низкой жесткости по сравнению с минерализованной костью или спроектированных материалов, а также обладают нелинейную и зависящих от времени деформации. По сравнению с другими тканями в организме, ткани мозга удивительно соответствует, с модулей упругости Е порядка 100е Па ^1. Мозговая ткань проявляет структурную гетерогенность с отчетливым и гребенчатой ​​серого и белого вещества областей, которые также отличаются функционально. Понимание механики ткани мозга поможет в разработке материалов и расчетных моделей для имитации реакции головного мозга при травме, облегчить прогнозирование механических повреждений, а также включить инженерных защитных стратегий. Кроме того, такая информация может быть использована, чтобы рассмотреть проектные цели для регенерации ткани, и, чтобы лучше понять структурные изменения в ткани головного мозга, которые связаны с такими заболеваниями, как рассеянный склероз и аутизм. ЧАСERE, мы описываем и продемонстрировать несколько экспериментальных подходов, которые доступны для характеристики вязкоупругих свойств механически совместимых тканей, включая ткани головного мозга, на микро-, мезо- и макро-масштабах.

На микроуровне, мы провели ползучести соблюдения и заставить экспериментов релаксации с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) -Enabled отступа. Как правило, АФМ с поддержкой отступы используются для оценки модуля упругости (или мгновенной жесткости) образца ^2-4. Тем не менее, тот же самый инструмент также может быть использован для измерения Microscale вискоэластик ( по времени или скорости-зависимых) свойств ^5-10. Принцип этих экспериментов, показанных на рисунке 1, является отступа асМ консольно зонд в ткани головного мозга, поддерживать заданную величину силы или глубины вдавливания, и измерить соответствующие изменения в глубину вдавливания и силы, соответственно, в течение долгого времени. Используя эти данные, мы можем вычислить ползучести компliance J _C и модуль релаксации G _R соответственно.

В мезомасштабе, мы провели эксперименты отступов воздействия в жидкости, погруженные в условиях, которые поддерживают структуру тканей и уровня гидратации, используя маятник на основе Instrumented наноиндентора. Экспериментальная установка показана на рисунке 2. По мере того как маятник качается в контакт с тканью, зонд смещения записывается как функция времени , пока качающийся маятник не приходит в состояние покоя в ткани. Из полученной затухающей гармоники колебательного движения зонда, можно рассчитать максимальную глубину проникновения х _Макс, рассеивание энергии мощности К, а добротность Q (рассеивание , которая относится к скорости диссипации энергии) ткани ^11,12.

На макроуровне, мы использовали параллельную пластину реометра для количественной оценки частоты зависит от модуля упругости при сдвиге,называется модуль накопления G 'и модуль потерь G ", ткани. В этом типе реометрии, применим гармоническую угловую деформацию (и соответствующие деформации сдвига) при известных амплитуд и частот и измеряют Реагирующей крутящего момента (и соответствующее напряжение сдвига) , как показано на рисунке 3. из полученной амплитуды и фазы запаздывания измеренного крутящего момента и геометрических переменных системы, мы можем вычислить G 'и G "на прикладной интерес частотах ^13,14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Заявление по этике: Все экспериментальные протоколы были одобрены Научно-исследовательского комитета Животный Бостонской детской больницы и выполнять Национальных институтов здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных.

1. мозга мыши Процедуры ткани Приобретение (для АФМ с поддержкой отступов и ударного вдавливания)

1. Подготовить кетамин / ксилазин смесь обезболить мышей. Смешайте 5 мл кетамина (500 мг / мл), 1 мл ксилазина (20 мг / мл) и 7 мл 0,9% физиологического раствора.
2. Вводят мыши (Порода: TSC1 син-Cre; PLP-EGFP; Возраст: p21; Пол: мужчина или женщина) с 7 мкл на грамм веса тела раствора кетамина / ксилазина.
3. После того, как мышь полностью под наркозом, о чем свидетельствует отсутствие реакции на носок и хвост пинчах, эвтаназии мышь обезглавливание с помощью больших рассечение ножницами.
4. Снимите череп вырубку середины используя меньшие рассечение ножницами. Начиная с мозжечком, бэрOve куски черепа с использованием изогнутых щипцов. После удаления черепа, извлечь мозг с помощью плоского шпателя, чтобы поднять мозг, начиная с мозжечком, и поместить мозг на чашку Петри. Удалите мозжечок из головного мозга с помощью лезвия бритвы.
5. При использовании весь мозг для воздействия отступа испытаний на свежей ткани, передача мозга в круглым дном трубки с CO ₂ -независимый питательной средой для взрослых нервной ткани на льду и перейдите к разделу 4. В противном случае перейдите к шагу 1.6 для нарезки процедур.
6. Настройка параметров vibratome до скорости 0,7 мм / с, с частотой колебаний 70 Гц, а толщина среза 350 мкм. Окружите vibratome блюдо со льдом. Поместите каплю суперклея на vibratome пластине и смонтировать мозг таким образом, что корональные срезы могут быть сокращены, с мозгом ориентированы на прорезать спинной стороне в первую очередь.
7. Заполните vibratome блюдо с фосфатным буферным солевым раствором Дульбекко достаточное количество (DPBS), чтобы просто погрузить мозг. подниматьблюдо на vibratome так, чтобы лезвие просто погружена в ДЗФР.
8. Нажмите кнопку Старт, чтобы начать нарезка корональные срезы головного мозга толщиной 350 мкм.
9. С помощью кисточки , чтобы избежать повреждения ткани, передать срезах мозга из vibratome DPBS ванны и в круглым дном трубки с CO ₂ -независимый питательной средой для взрослых нервной ткани на льду и выполнять измерения на свежей ткани в течение 48 часов. Для начала AFM-эксперименты позволили отступов, перейдите к разделу 3.

2. Процедуры мозга свиньи ткани Приобретение (для реологии)

1. Получить сагиттальной нарезанную половину мозга свиньи в течение ~ 1 ч жертвы от местного мясника. Поместите половину мозга в CO ₂ -независимый питательной среды для взрослой нервной ткани, и хранить на льду.
2. Используйте лезвие или скальпель , чтобы сделать толстый корональной срез мозга ~ 5 мм и хранить в СО ₂ -независимый питательной среды для взрослой нервной ткани. Убедитесь в том, что срез Surfacе как можно более плоским. Используйте тщательные боковые движения с бритвой / скальпелем во время секционирования.
3. Магазин тканей головного мозга свиньи в CO ₂ -независимый питательной среды для взрослых нервной ткани на льду и выполнять измерения Реологии (раздел 5) на свежей ткани в течение 48 часов.

3. Атомно-силовой микроскоп с поддержкой Отступ

1. Приготовьте 60 мм диаметра Петри (P60) блюда с мидиями происхождения биоадгезива в соответствии с инструкциями изготовителя.
   1. Готовят нейтрального буферного раствора, состоящего из 0,1 М раствором бикарбоната натрия в стерильной воде с оптимальным рН 8,0. Фильтр-стерилизовать (0,2 мкм), буфер бикарбоната натрия и хранят при температуре 4 ° С.
   2. В ламинарном потоке, перемешать раствор 6,25% мидий происхождения био-клей и 3,125% -ного раствора NaOH в буфере бикарбоната натрия.
   3. Пипетка 100 мкл био-клеевой раствор из 3.1.2 на 60 мм диаметра Петри (P60) блюдо и использование пипетки для распространения зольв круг социологическое загрязнение диаметром 3-5 см.
   4. Оставьте посуду P60 обнажение в капот ламинарного потока, и пусть решение сухой (~ 30 мин). Мыть посуду 1x с PBS и 2 раза стерильной водой. Пусть блюда сухой воздух в ламинарный и хранить в герметичном полиэтиленовом пакете при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.
2. Откалибруйте AFM и настройка образца мозга в атомно-силовой микроскопии.
   Примечание: Следуйте инструкциям калибровки AFM в соответствии с производителем.
   1. Осторожно загрузить зонд АСМ с номинальной жесткости пружины 0,03 Н / м, а мкм диаметром боросиликатного шарик в держатель зонда 20.
   2. Откалибруйте жесткость пружины и обратной оптической чувствительности рычага (InvOLS) кантилевера АСМ с использованием метода термического мелодия ^15,16.
      Примечание: После того, как постоянная пружины для зонда АСМ вычисляется, он должен оставаться постоянным при повторном использовании. Тем не менее, консольные InvOLS должны быть откалиброван каждый раз, когда лазер перестроены с кантилевера. Кроме того, калибровкадолжны быть выполнены в отношении подложки несколько порядков жестче, чем консольных, таких как полистирол.
   3. Включите стадии монтажа нагревателя и заданной температуры до 37 ° С.
   4. Установите срез мозга на P60 блюд, приготовленных в разделе 3.1.
      1. Аккуратно влить толстый ломтик 350 мкм мозга, а также СО ₂ -независимый среды из круглодонную колбу в P60 блюдо с покрытием мидий происхождения биоадгезива.
      2. По мягко наклоняя P60 блюдо, поместите кусочек мозга в центре тарелки. При необходимости, медленно пипеткой среду из ручного пипеткой, чтобы развернуть срез мозга, который сложенную поверх на себе или лучшем положении срез мозга в центр чашки.
      3. Осторожно удалите излишки средств массовой информации с использованием P1000 пипеттором (не используйте вакуум).
      4. Поместите крышку на P60 блюдо и пусть срез мозга придерживаться в течение 20 мин.
   5. Снимите головку AFM, поместите кусочек мозга, установленный в P60блюдо на сцене AFM, и добавить ~ 2 мл подогретого CO ₂ -независимый среды.
   6. Осторожно добавить каплю СМИ на AFM зонд, чтобы защитить его от разрушения из-за поверхностного натяжения, когда он опускается в средствах массовой информации, окружающих срез мозга.
   7. Переставьте голову AFM на сцену, и начать опускание головы, пока он не погружен в среду.
   8. Использование ПЗС-камеры вид сверху, переставить лазер на кантилевер.
      Примечание: Выравнивание лазера на кантилевер будет слегка изменились из-за разницы показателей преломления воздуха и среды.
   9. Подождите 5 минут для кантилевер, чтобы приспособиться к погружении в теплую жидкость, а затем сбросить выравнивание зеркало для свободного отклонения 0 В.
   10. Выполнить тепловой спектр на зонде AFM в соответствии с инструкциями изготовителя ^16. Используйте посадку первого термического пика повторно вычислить InvOLS АФМ зонда в средствах массовой информации.
   11. С помощью оптического микроскопа,перейти в стадию образца таким образом, что область мозга интерес ниже зонда AFM.
       ПРИМЕЧАНИЕ: мозолистое появится темно, как более непрозрачной, чем окружающие серого вещества. Кора превосходит мозолистого тела.
   12. Сбросить выравнивание зеркало для свободного отклонения 0 В.
   13. О сумме и отклоняющую метр в программном обеспечении AFM, нажмите кнопку "Участвовать", чтобы задействовать голову AFM.
   14. Используя положения диска на головке AFM, опустите голову, пока контакт между кантилевера и образца не производится.
3. (Необязательно) При необходимости измерения модуля упругости образца, как описано ранее ^4,17,18.
4. Провести эксперименты соответствия ползучести.
   1. Построить прикладную функцию силы в редакторе функции программного обеспечения. Силовая функция состоит из 0,1 сек рампе до заданного значения 5 нн и удерживайте ее в течение 20 секунд, после чего 1 сек сползать вниз к приложенной силе 0 нн.
      1. На Отступы Master PАнель, в соответствии с методом вдавливания, выберите "Load" для режима Indenter; "N" для блоков; и "Редактор Функция" для Indenter функции.
      2. В редакторе функции на отрезке Parms панели, создать прикладную сегмент силовой функции, которая начинается при 0 нн, заканчивается в 5 нн, со временем 0,1 сек. Нажмите кнопку "Вставить ->".
      3. Для следующего сегмента, установить время начала до 5 нн, конец 5 нн и время до 20 сек. Нажмите кнопку "Вставить ->".
      4. Для последнего сегмента, установить время начала до 5 нн, конец 0 нн и время до 1 сек. Нажмите кнопку "Draw" и закройте окно редактора функций.
   2. На вкладке сила мастера панели, установите флажок "индентора рампу после запуска" и установите прикладную функцию силы, чтобы вызвать после достижения точки запуска 0,1 В.
   3. Нажмите кнопку "Single Force" в нижней части вкладки сила мастера панели, которая будет инициировать сконструированную-прикладному силовую функцию на предмет соответствия ползучести.
   4. Послеединая сила вдавливания закончена, поднимите головку AFM так, что он находится вне контакта с образцом, а затем снова включите голову и повторно нулевым свободным прогибом.
   5. Переставьте этап выборки, чтобы найти новую область интереса, и опустить голову AFM, чтобы вступить в контакт. Примечание: Головка AFM должна быть втянута от поверхности образца, когда стадия образца перемещается. Несоблюдение этого правила может привести к повреждению деликатной AFM кантилевера.
   6. Повторите шаги 3.4.3-3.4.5, пока желаемое количество данных не были собраны.
5. Провести эксперименты релаксации силы.
   1. Построить прикладную функцию отступа в редакторе функции программного обеспечения. Функция отступа состоит из 0,1 сек пандуса до заданной точки 3 мкм и удерживать ее в течение 20 секунд, после чего 1 сек сползать вниз на глубину вдавливания от 0 мкм.
      1. На Отступы Master Panel, в соответствии с методом вдавливания, выберите "Отступ" для режима Indenter; "М" для блоков; а также "; Функция Редактор "для Indenter функции.
      2. В редакторе функции на отрезке Parms панели, создать прикладную сегмент силовой функции, которая начинается при 0 мкм, заканчивается в 3 мкм, со временем 0,1 сек. Нажмите кнопку "Вставить ->".
      3. Для следующего сегмента, установить время начала до 3 мкм, конец до 3 мкм, а время до 20 сек. Нажмите кнопку "Вставить ->".
      4. Для последнего сегмента, установить время начала до 3 мкм, конец до 0 мкм, и время до 1 сек. Нажмите кнопку "Draw" и закройте окно редактора функций.
   2. На вкладке сила мастера панели, установите флажок "индентора рампу после запуска" и установите прикладную функцию силы, чтобы вызвать после достижения точки запуска 0,1 В.
   3. Нажмите кнопку "Single Force" в нижней части вкладки сила мастера панели, которая будет инициировать построенную-прикладной функции отступа для релаксации силы.
   4. После того, как единая сила вдавливания закончена, поднимите головку AFM так, чтобы онавне контакта с образцом, а затем повторно включите головку и повторно нулевом отклонении.
   5. Переставьте сцену, чтобы найти новую область интереса, и опустить голову, чтобы вступить в контакт.
   6. Повторите шаги 5.3-5.5, пока желаемое количество данных не было собрано.
6. Заключить эксперименты и очистка.
   1. После завершения экспериментов, поднимите голову AFM и удалить его из образца.
   2. Используйте лабораторную ткань тщательно удалить лишнюю жидкость, не касаясь кантилевера.
   3. Тщательно очистить держатель кантилевера АСМ с использованием небольшого количества этанола. Не подвергать деликатные электронику на держателе кантилевера в этанол. Удалите кантилевера AFM и место в контейнере для хранения.
   4. Утилизацию образца ткани мозга, следуя соответствующим протоколам биологической безопасности.
7. Использование MATLAB, вычислить соответствие ползучести и релаксации сила модулей с использованием геометрии индентора, в соответствии с решением, полученного Ли и Радока 1960 ^19.
   1. Расчет силы F и глубину вдавливания из данных о консольном положении г, д, отклонения и постоянной весной, К _С
      
      а также ,
   2. Найдите точку контакта вдоль кривой вдавливания с использованием алгоритма , описанного в Lin и др. ^20.
   3. Определить окно интерес для анализа данных. Окно интерес представляет область , где либо сила (для ползучести соответствия) или глубины вдавливания (для релаксации силы) поддерживается на уровне заданного значения (то есть, область 3 , как показано на рисунке 1C, D).
   4. Для экспериментов соответствия ползучести, рассчитать экспериментальное ползучести модуль соответствия, J _С (Т), в ответ на шаг нагрузкип 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      ,
      где Н (т) является ступенчатой ​​функцией Хевисайда и R является радиус сферического зонда.
   5. Для экспериментов релаксации силы, вычислить экспериментальный модуль релаксации силы, G _R (T), в ответ на глубину вдавливания шаг :
      ,

4. Воздействие Отступ

1. Откалибруйте инструментированный наноиндентора и настроить параметры по умолчанию, чтобы включить динамические эксперименты Воздействие на гидратированных тканях мозга в соответствии с инструкциями изготовителя.
   1. Установите сферический зонд, надев его на маятник с помощью пинцета.
   2. Клей конденсированного образца кварца на образец поста, который ввинчивается в поступательнойсцена.
   3. Перейдите в меню калибровки и выберите пункт "Liquid Cell". Следуйте инструкциям программного обеспечения, чтобы установить контакт с расплавленным образца кварца.
   4. Выберите "Normal" для индентора типа и использовать значение по умолчанию 0,05 мН для нагрузки Indenter. Нажмите кнопку "Продолжить", чтобы выполнить калибровку для нормальной конфигурации индентора.
   5. Переместить сцену образца назад, по меньшей мере, 5 мм. Установить рычаг, который позволяет зонду быть понижены в жидкую ячейку, и повторите калибровку жидкостной ячейки в новой конфигурации, выбрав "Liquid Cell" для типа Indenter. Нажмите кнопку "Продолжить", чтобы получить Liquid Cell Factor калибровки.
   6. Активируйте опцию Liquid Cell программного обеспечения, перейдя в меню эксперимента и выбрав пункт "Специальные опции." Используйте последнее значение калибровки.
   7. Увеличьте расстояние между пластиной конденсатора, так как это приведет к большей максимальной измеримой глубины, которая необходима при тестировании HIGHLY совместимые материалы.
      1. В меню System выберите "Non Защищенные Settings" и "Параметры машины" для изменения скорости тестового маятника нагрузки, нулевой скорости нагрузки и в режиме ожидания пандус смещение до 0,5 мН / сек, 0,1 мН / сек и 3 В, соответственно.
      2. С помощью гаечного ключа поверните три гайки, которые управляют обкладки Разнос по часовой стрелке с небольшим шагом.
      3. После каждого полного оборота по часовой стрелке, выберите "Мост окна настройки" в меню Maintenance и получить хороший тест маятник, который потребует перемещения веса противовеса от маятника.
      4. Повторите шаги 4.1.7.2-4.1.7.3, пока приблизительная калибровки глубины не считывает значение 70000 нм / В или выше.
   8. Установить новый ограничитель в нижней части маятника, который может быть включен и выключен с помощью источника питания. Отвод первоначальный ограничитель, сидя за маятник, чтобы удалить потенциальное препятствие движения маятника и позволяют болеескоростей удара, а также более высокие глубины проникновения в совместимых образцов.
   9. Разрешить шкаф для достижения теплового равновесия (занимает примерно 1 час).
   10. В то время как кабинет уравновешивает, вернитесь в системное меню и выберите "Non Защищенные Settings" и "Параметры машины". Установите ограничитель глубины скорость калибровки (DCAL) контакта до 1 мкм / сек, первичная скорость вдавливания контакта до 3 мкм / с, а скорость контактной нагрузки со сверхнизким до 1 мкм / сек.
   11. В меню калибровки, выполнить стандартную калибровку глубины в этой новой конфигурации.
   12. Включите источник питания для соленоида и установить его на 10 В. Перейдите в меню и выберите Эксперимент "воздействие" и "Adjust Impulse Смещения." Следуйте инструкциям программного обеспечения (автоматические подсказки) для калибровки качания расстояние маятника.
2. Установите ткани мозга мыши в жидкой ячейке.
   1. После уборки весь мозг от СТЭр 1.5, хранить его сразу в CO ₂ -независимый питательной средой для взрослых сред нервной ткани на льду.
   2. Когда установка влияние отступы полностью завершена, тщательно перенести мозг в чашку Петри вместе с СО ₂ -независимый среды. Нарезать мозг в 6 мм толщиной секции с плоскими поверхностями с обеих сторон.
   3. Придерживайтесь нарезанную ткань к образцу поста алюминия с тонким слоем клея цианакриловым.
   4. Вставьте жидкую ячейку над вторым уплотнительным кольцом на образце пост, и заполнить жидкую клетку с 5 мл СО ₂ -независимый среды , чтобы полностью погрузить ткань. Этот образец пост затем тщательно смонтированный на трансляционной стадии внутри инструментированного наноиндентора.
3. Измерьте ответ воздействие мозговой ткани.
   1. При необходимости удалите сферический зонд и заменить его с зондом интереса, не снимая рычаг.
   2. В меню System выберите "Non ProtectedНастройки "и" Параметры машины. "Изменение основного контакта скорости удара до 5 мкм / сек.
   3. С помощью образца ванны низкой (-z направление) и далеко от маятника (+ х), двигаться в направлении -х, пока кончик на плечо рычага не будет правильно расположена над ванной. Перемещение в направлении + Z, пока наконечник полностью погружен в ванну и в передней части образца.
   4. Использование окна управления этапом пробы, контакт тщательно и затем обратно на сцену от поверхности образца приблизительно 30 мкм.
   5. В меню, нажмите на ссылку "Воздействие", чтобы настроить эксперимент воздействия. Выберите определенный импульс нагрузки, которая будет непосредственно относиться к полученной скорости удара на основе калибровки свинг расстояния. Запуск запланирован эксперимент.
   6. Когда маятник качается назад и поверхность образца продолжает двигаться к плоскости измерения, поверните нижний выключатель ограничения заезжать.
   7. Обратите внимание, как маятник качается ForwARD, чтобы воздействовать на образец. Смещение зонда в зависимости от времени, будет записан с помощью программного обеспечения.
   8. При появлении окна этап хуг, поверните выключатель стоп-лимит обратно.
   9. Повторите шаги 3.4-3.8, чтобы проверить, как много различных нагрузок и места в случае необходимости.
4. Анализировать полученные смещения в зависимости от времени отклика маятника используя пользовательские сценарии MATLAB , чтобы определить максимальную глубину проникновения х _макс, мощности диссипации энергии К, а рассеивание добротности. ¹¹
   1. Перейдите в меню Analysis и экспортировать данные в текстовом файле.
   2. Возьмем производную по времени от профиля смещения, чтобы получить скорость, как функция времени. Установка смещения нуля в качестве точки контакта х _o1.
      Примечание: Влияние скорости V _в это максимальная скорость непосредственно перед контактом х _макс соответствует деформации , при которой зонд.скорость сначала уменьшается до нуля. х _о2, что эквивалентно х _г, является положение необходимо возобновить контакт с деформированного образца в следующем цикле. Скорость отскока v _вне есть скорость смещения х _г.
   3. Определить K (безразмерный) , как энергия , выделяемая при образце , нормированную сумму выздоровевших и растрачивается энергий выборок в течение первого цикла воздействия. Вычислить K на основе собственных свойств маятника ²¹ (например, жесткость вращения и коэффициента затухания), х _o1, х _макс, х _г, v _в и v _вне.
      Примечание: Для получения дополнительной информации можно обратиться к работе Kalcioglu и др., 2011.
   4. Так как смещение может быть описана как затухающего гармонического колебательного движения, подходят экспоненциальную функцию затухания для максимумов дисРазмещение по сравнению с кривой времени.
   5. Рассчитать Q (безразмерный) , как π , умноженное на количество циклов , требуемых для амплитуды колебаний для уменьшения с коэффициентом е. Более высокое значение Q означает более низкую скорость диссипации энергии.

5. Реология

1. Установка и калибровки вискозиметра в соответствии с инструкциями изготовителя.
   1. Инициализировать реометра, открыв панель устройства / управления. На вкладке панели управления, нажмите кнопку "инициализировать".
   2. Установить измерительную пластину 25 мм диаметра (PP25) и тепловую систему.
   3. (Необязательно) Чтобы уменьшить проскальзывание между реометра пластинами и ткани, вырезать клейкие наждачная бумага кусочки, которые соответствуют форме верхней пластины реометра и приклеить наждачной бумаги верхней и нижней пластины.
   4. Сделать контакт между верхней и нижней пластиной, нажав кнопку "Установить нулевую пробел" на панели управления.
   5. Нулевой нормальный датчик силы со стороны клиCKING "сбросить нормальную силу."
   6. Провести тест инерции, открыв вкладку обслуживания на панели управления, нажав на кнопку "измерительной системы", а затем нажав кнопку "тест" инерционный. Запишите старый и новый инерцию. Убедитесь, что инерционность находится в пределах допустимого предела для зонда, как указано производителем.
2. Образец нагрузки в реометра.
   1. После сбора ткани и разделки корональной сегмент мозга свиньи толщиной ~ 5 мм, хранить его на льду в CO ₂ -независимый среды.
   2. Поместите мозг между двумя пластинами. Удалите большие капли воды из верхней и нижней поверхности образца, чтобы предотвратить проскальзывание, но не высыхают образца.
   3. Медленно опустить измерительную пластину до тех пор, пока пластина находится в полном контакте с верхней поверхностью ткани и измеренной нормальной силы соответствует 0,01 мН после периода релаксации 5-10 мин.
      1. В панели управления, введите последовательно более низкие высоты яп положение окно измерения и нажмите на кнопку "позицию измерения" медленно опустить измерительную пластину.
      2. Когда в пределах миллиметра контакта с тканью, опустить измерительную пластину с шагом 0,1 мм до тех пор, пока пластина полностью в контакте с верхней поверхностью ткани. Убедитесь в том, что измеряемая-нормальная сила последовательно на 0,01 мН после периода релаксации 5-10 мин.
      3. Запишите начальное измеренное нормальное усилие. Повторные измерения должны быть проведены при одинаковых сжимающих напряжений / деформаций.
   4. Обрежьте образец с пластмассовым лезвием, если образец превышает диаметр пластины. Пипетировать небольшой объем (~ 1-2 мл) носителя по краям образца для увлажнения ткани.
   5. (Необязательно) Опустите тепловой кожух. На панели управления, установите температуру до 37 ° C и нажмите кнопку "установить".
3. Выполните амплитуду развертки , чтобы установить линейный диапазон вязкоупругого материала (т.е. сдвигштаммы , в которых G 'и G' 'являются постоянными) на частотах , представляющих интерес (например, 1 рад / сек).
   1. Выберите "Файл / Новый". На вкладке гель выберите "Amplitude развертки: LVE-диапазон." Выберите окно и нажмите кнопку "Измерение 1: Amplitude зачистку". Двойной щелчок на поле колебаний. Введите начальное и конечное напряжение (например, от 0,01 до 105), частота (например, 1 рад / с) , и число точек на декаду (например, 6 баллов / разл). Выберите "OK" и нажмите кнопку Пуск ".
   2. Повторите эту процедуру для нескольких срезов при повторных испытаниях, чтобы обеспечить согласованность линейного упругого диапазона. Осевое сжатие образца должно оставаться постоянным между образцами.
4. Проведение частотной развертки ткани при деформации в линейном диапазоне вязкоупругих ткани (например, 1% деформации) ^22, а также в частотном диапазоне интерес (например, 0,1-100 радиан / сек).
   1. Нажмите "Файл / Новый" и на вкладке гель выберите пункт "Частота развертки." Нажмите окно / Измерение 1: Частота развертки. Двойной щелчок на поле колебаний. Введите диапазон частот (например, от 0,1 до 100 рад / сек), напряжение (например, 1% деформации) и количество баллов за десятилетие (например, 6 очков / DEC). Выберите "OK" и нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать зачистку частоты.
5. Повторите частоты развертки (шаг 5.4) в двух экземплярах или трех экземплярах.
6. Просмотрите данные, которые автоматически подсчитываются и экспортированных реометра: G 'и G "в зависимости от частоты (частота развертки) или деформации сдвига (амплитуда развертки) . Примечание: G' и G '' вычисляются из образца (максимум ) амплитуда Реагирующая крутящий момент Т _'0, а угол поворота смещения (или угол отклонения) И фазовая задержкаУравнение 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>, реакции образца приложенному колебательный деформации (рисунок 3):
   
   
   где R и H радиус и высота образца.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 4 показана репрезентативную отступы и силу в зависимости от времени реакций (рис 4B, E) на предмет соответствия ползучести и силы экспериментов релаксации, учитывая приложенная сила или глубина вдавливания (рис 4A, D), соответственно....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Каждый метод в данной работе измеряет различные аспекты механических свойств ткани мозга в. Creep соблюдение и модулей релаксации напряжений являются мерой зависящих от времени механических свойств. Хранение и потери представляют собой модули скорости зависящие от механических свойст...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine	Lloyd Laboratoried		perscription drug
Ketamine	AnaSed Injections		perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome)	Leica	VT1200
Hibernate-A Medium	Gibco	A1247501	CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
Petri Dish Heater	Asylum Research	-
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere	Novascan	PT.GS
Cell-Tak	Corning	354240	mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N	Sigma-Aldrich	59223C	alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage	Micro Materials Ltd.	-	probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell	Micro Materials Ltd.	-
Parallel Plate Rheometer MCR501	Anton-Parr	-
PP25	Anton-Parr	-	25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper	McMaster-Carr	4184A48	alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive	Henkel	20268	alternate suppliers can be used