Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

Resumo

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca²⁺ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Resumo

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca²⁺ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by β-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Introdução

A contração do músculo esquelético e cardíaco é desencadeada por retículo sarcoplasmático Ca ²⁺ liberação mediada por RyR. Existem três isoformas RYR de mamífero com o canal funcional composta de quatro subunidades idênticas. Cada subunidade consiste de RyR uma grande porção N-terminal citoplasmático reguladora e uma pequena parte do terminal C contendo os domínios de transmembrana que formam uma alta condutância Ca ²⁺ poro. Intra anormal e inter-subunidades interações subjacentes disfunção canal RyR e resultar em doenças neuromusculares e cardíacos ^1. A identificação e caracterização de domínios específicos envolvidos na estrutura RyR: relação de função é, portanto, crucial para a compreensão da fisiopatologia RyR.

técnicas de interacção proteína-proteína bioquímicos tradicionais exigem quantidades substanciais de proteína purificada, muitas vezes produzidos em bactérias. Isto não é possível no caso de o RyR, uma muito grande membrana de protein composto de ~ 5000 aminoácidos, enquanto que os seus fragmentos recombinantes não são facilmente passível de expressão bacteriano e purificação. Assim, são necessários sistemas de expressão alternativos que envolvem células hospedeiras eucarióticas para as proteínas de membrana integrais de mamífero. Temos anteriormente empregue Y2H, co-IP e ensaios de ligação cruzada para demonstrar que colectivamente N-terminal de tetramerização é uma característica estrutural que é conservado entre os três isoformas de mamífero RyR ^2,3. Mais importante, verificou-se que uma única mutação de ponto associado à doença cardíaca arritmogénica perturba N-terminal de auto-associação e resulta em um canal de RyR disfuncional ^4. Também têm aplicado estas técnicas para estudos de oligomerização do RyR cauda citoplasmática de terminal-C ^5, bem como o N-terminal do canal de ^{Ca2 +} intracelular homólogo de libertação, o receptor de inositol trifosfato 1,4,5 ^2.

No ensaio Y2H, o interactiem entre duas proteínas (X e Y) é medido pela reconstituição de um factor de transcrição funcional (GAL4) e a activação subsequente de genes repórter ^6-9. Dois vectores de clonagem diferentes são usados ​​para gerar fusões das duas proteínas testadas com os dois domínios fisicamente separáveis, independentes de GAL4: DNA-Binding Domain (DNA-BD) / proteína de fusão X (isca) e Activação de domínio (AD) / proteína Y fusion (alvo). O Y2H pode ser utilizado para testar se uma proteína interage com o próprio através da geração de fusões de AD da mesma proteína GAL4 DNA-BD e. Geneticamente modificada estirpes Y2H são GAL4 e GAL80 deficiente (GAL80 a proteína é um repressor de GAL4), bem como TRP1 e LEU2 deficiente (para proporcionar selecção nutricional para isco e presa plasmídeos, respectivamente). No núcleo de levedura, os péptidos de DNA-BD e Ad recombinantes são postos em proximidade física para produzir um factor de transcrição de GAL4 híbrido apenas através das suas fusões X: Y interaction. Esta abordagem permite o mapeamento genético rápida para detectar interacções proteína-proteína de activação da transcrição através do paralelo da prototrófica (codificação de HIS3 de uma enzima necessário para a biossíntese de histidina) e cromogénico (LacZ que codifica para β-galactosidase (β-Gal)) genes repórter. A principal vantagem do Y2H é que é um ensaio in vivo que detecta interacções proteína-proteína, mesmo fracas ou transitórios. Além disso, a detecção envolve a utilização simples de seleção de crescimento (em meio sem histidina) ou de um ensaio colorimétrico (β-Gal), sem necessidade de purificação das proteínas isco e de destino ou a geração de anticorpos específicos. Além disso, o Y2H pode ser utilizado para rastrear um conjunto de clones desconhecidos aleatórios (clones biblioteca de ADNc fundido com GAL4 AD) para novos parceiros de ligação de uma proteína isco, também dão acesso directo ao ADNc da proteína biblioteca.

Para estender as observações y2h, independtécnicas bioquímicas ent pode ser empregue. Os ensaios de ligação cruzada combinados com imunotransferência co-IP e são métodos utilizados para detectar associações de proteínas em amostras de misturas complexas, por exemplo., Lisados ​​de células inteiras ^10. A sua principal vantagem é que eles relatam em interacções proteína-proteína a partir de tecido nativo, ao contrário de outros métodos que requerem a utilização de proteínas recombinantes. As proteínas recombinantes podem também ser utilizados, normalmente expressos numa linha de células de mamífero, onde eles são susceptíveis de ter as suas modificações de conformação correcta e pós-tradução, assim como a localização subcelular. No entanto, uma vez que a co-IP e a ligação cruzada são, em ensaios in vitro fazendo uso de células homogeneizadas, é necessário confirmar se os dois parceiros de proteína são co-localizada na célula intacta ^11. Rotineiramente usar a transfecção de células de mamífero para expressar HEK293 transientemente integral da membrana de mamíferos e de proteínas citosólicas usando o método de precipitação com fosfato de cálcio ²-4,12-14, Aqui descrito em detalhe. Esta é uma forma barata para entregar eficazmente o DNA de plasmídeo dentro das células, mas é dependente da linha de célula particular utilizado e a confluência celular, bem como a pureza do ADN do plasmídeo ^11,15.

O ensaio de co-IP envolve o isolamento da proteína nativa ou recombinante de interesse a partir de lisados ​​de células em condições não desnaturantes, permitindo a co-purificação de parceiros de interacção ^10,16 putativos. É necessária a utilização de dois anticorpos independentes, o anticorpo para o isolamento de imunoprecipitar a proteína X, e o anticorpo para a detecção de imunotransferência Y. parceiro de proteína que ele pode ser utilizado para testar se uma proteína interage com o próprio através da geração de dois diferentes fusões com dois epitopo diferente marcações (por exemplo., HA e cMyc). O anticorpo é ligado imunoprecipitação através da sua região Fe em Proteína-A (ou proteína-G, dependendo das espécies de animais em que o anticorpo foi produzido), queestá conjugado a agarose (ou sefarose) resina. Proteína X é precipitado pelo anticorpo: Proteína-A resina após a incubação com o ligado de células, ou seja, a fracção solúvel em detergente de células homogeneizadas. Proteína imuno-complexos são eluídas com tampão contendo SDS e depois analisadas por SDS-PAGE e imunotransferência, utilizando um anticorpo para detectar a presença da proteína Y ^17. Co-IP deve ser realizado com proteínas solúvel em detergente para evitar excessiva ligação não-específica. A escolha do detergente e da sua concentração, bem como o número de lavagens, deve ser optimizado para cada X: Y par ^10,16,18.

A ligação cruzada é empregue para determinar a estequiometria do complexo de proteína oligomérica. Ele baseia-se numa reacção química para criar ligações covalentes entre prot�meros interagindo adjacentes, e por conseguinte, permite a preservação do estado oligomérico da proteína durante a separação por SDS-PAGE. Existem inúmeros REAGE cross-linkingNTS de vários comprimentos e química dirigidos a diferentes grupos reactivos em proteínas, aminas primárias, tipicamente carboxílico ou grupos tiol. Aqui, nós descrevemos o uso de glutaraldeído (OHC _{(CH2) 3-CHO),} um agente de reticulação homo-bi-funcionais, com dois grupos aldeído em ambas as extremidades que reagem com grupos amino livres presentes em resíduos de lisina ^19,20. A reticulação é seguido de um modo dependente da concentração-tempo ou resultando na formação do aduto. Glutaraldeído reacção é parada com hidrazina (H ₂ NNH ₂₎ e amostras de proteína são, então, analisadas por SDS-PAGE e immunoblotting ¹⁷ para avaliar o seu estado de oligomerização. Devemos notar que a ligação cruzada não induz oligomerização, mas apenas cria pontes estáveis ​​entre complexos de proteínas pré-existentes. Considerações importantes ao realizar experiências de ligação cruzada incluem a escolha do agente de reticulação, a sua concentração e tempo de reação ^19,20.

Protocolo

1. A levedura de dois híbridos

1. Transformação de levedura
   1. Prepare os seguintes meios e tampões:
      1. Preparar o meio de levedura completa de extracto de levedura-peptona-dextrose (YPD) por mistura de 20 g / L de peptona, 10 g / L de extracto de levedura, 2% w / v de glucose (adicionado após autoclave) e 20 g / L de agar (por placas única) ; esterilizar em autoclave e usar fresco no dia da experiência.
      2. Preparar o meio de levedura mínimo sintético definido (SD) (sem leucina e triptofano para manter a pressão selectiva nos dois isca e alvo plasmídeos) por mistura de 6,7 g / L de Yeast Nitrogen Base, 1,6 g / L Dropout suplemento sem leucina e triptofano, 2% W / v de glucose (adicionado após autoclave) e 20 g / L de agar (placas para apenas); esterilizar em autoclave e usar fresco no dia da experiência.
      3. Prepare a 50% w / v de PEG (polietilenoglicol) 3350; esterilizar através de um filtro de 0,2 um e armazenar a RT.
      4. Preparar 100 mM de Tris / 10 mM de EDTA (TE 10x), ajustaro pH para 7,5, esterilizar por meio de um filtro de 0,2 um e armazenar a RT.
      5. Prepare de etilo 1 M de lítio (10x LiAc); ajustar o pH para 7,5 com _CH3COOH, esterilizar através de um filtro de 0,2 um e armazenamento à temperatura ambiente.
   2. Reavivar a estirpe Y2H (por exemplo, Y190) riscando uma pequena quantidade do stock de glicerol congelado sobre uma placa de YPD. Incubar a 30 ° C até as colónias de levedura atingir ~ 2 mm de diâmetro (usualmente 3 - 5 dias, dependendo da estirpe de levedura).
   3. Inocular 0,5 ml de YPD (em um tubo de 1,5 ml) com uma única, grande (2 - 3 mm de diâmetro) colónia. Vortex vigorosamente durante ~ 2 minutos para dispersar quaisquer aglomerados.
   4. Transferir suspensão de células para um balão de 500 ml contendo 50 ml de meio YPD. Incubar a 30 ° C durante 16-18 horas com agitação a 250 rpm durante levedura para atingir a fase estacionária.
   5. Transferência de 4-5 ml da cultura durante a noite em 200 ml de YPD (em um balão de Erlenmeyer de 1 L) para produzir uma densidade óptica a 600 nm (OD _600, medidoutilizando um espectrofotómetro) de 0,2 - 0,3 (200 ml serão suficientes para transformações 20).
   6. Incubar a 30 ° C com agitação a 250 rpm até que as células estão na fase mid-log, isto é, OD ₆₀₀ = 0,5-0,6 (geralmente 2-3 horas).
   7. Colheita de levedura por centrifugação (em tubos de 50 ml) a 1500 xg durante 5 min à TA. Descartar o sobrenadante, ressuspender cada sedimento em 5 ml de H ₂ O esterilizada e piscina juntos.
   8. Re-centrifugar a 1500 xg durante 5 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Ressuspender pellet fermento em 1 ml de preparado na hora, estéril 1x LiAc / TE.
      NOTA: Utilize células de levedura competentes no prazo de 1 hora de preparação.
   9. Preparar amostras de plasmídeo (em tubos de 1,5 ml) através da adição de 200 ng de ADN de plasmídeo para transformações individuais, ou 0,5-1 ug de cada ADN de plasmídeo de co-transformação, e ADN transportador de 100 ug de testículos de arenque (fervida durante 20 min e arrefeceu-se sobre gelo imediatamente antes da utilização).
      NOTA: Incluir um controlo positivo, por exemplo, levedura.co-transformada com pVA3 (codificação para a fusão GAL4 DNA-BD com a proteína p53) e pTD1 (codificação para a fusão AD GAL4 com antigénio T grande SV40).
   10. Adicionar 100 ul da, suspensão de levedura competente recentemente preparada (passo 1.1.8) e 600 ul de solução 1x LiAc / PEG (8 ml de estoque de PEG 3350, 1 ml de estoque de TE, 1 ml de estoque LiAc), e agitar com vortex para ~ 30 seg. Incubar a 30 ° C durante 30 min com agitação a 200 rpm.
   11. Adicionar 80 uL de sulfóxido de dimetilo (10% v / v concentração final) e misturar bem por inversão suave. O choque térmico durante 15 minutos num banho de água a 42 ° C, enquanto se mistura a cada 2-3 minutos.
   12. Relaxar suspensão de células em gelo durante 2 min e centrifugar a 14000 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente para recuperar levedura.
   13. Ressuspender o sedimento celular em 100 ul de 1x TE e placa em placas de meio mínimo SD adequadas para o crescimento selectivo (meio sem leucina e triptofano para manter a pressão selectiva nos dois plasmídeos de isco e de destino).
   14. Incubar as placas up-side-down em 30° C até as colónias são ~ 2 mm de diâmetro (geralmente 4 - 5 dias). As placas podem ser armazenadas a 4 ° C durante 2 - 3 semanas; por mais tempo de armazenamento fazer stocks de glicerol e armazenar a -80 ° C.
       NOTA: Verifique se as proteínas de isca e de destino são expressas em levedura por immunoblotting ^17, e que eles não têm a activação do gene repórter autónoma quando expressos separadamente em levedura (por ensaio β-Gal conforme descrito na Seção 1.3).
2. Colony-lift β-Gal filtro de papel Ensaio
   1. Preparar os seguintes tampões:
      1. Preparar tampão Z, contendo 100 mM de Na ₂ HPO _4, 40 mM de NaH ₂ PO _4, 10 mM de KCl, 1 mM de _MgSO4; ajustar o pH para 7,4. Esterilizar em autoclave e armazenar a RT.
      2. Preparar tampão de X-Gal por dissolução de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido a 20 mg / mL em N, N-dimetilformamida e armazenar no escuro a -20 ° C. Prepare / solução tampão Z X-Gal. Faça tampãoantes da utilização por mistura de X-Gal a 0,33 mg / ml e β-mercaptoetanol a 0,27% v / v em tampão Z. Use 2,5 ml por amostra.
   2. Adicionar 2,5 ml de solução de tampão Z / X-Gal recentemente preparado em uma placa de 100 milímetros e limpo lugar dentro de um papel de filtro de celulose.
   3. Coloque um novo papel de filtro sobre a superfície da placa, com as colónias de levedura a ser doseada. Esfregue suavemente o papel de filtro sobre a placa com uma pinça e deixe por ~ 5 min para as colónias para anexar.
      NOTA: Processar o controlo positivo em paralelo, ou seja, a levedura co-transformada com pVA3 e pTD1..
   4. Levante o papel de filtro e submergi-lo (com uma pinça) em uma piscina de azoto líquido durante 30 segundos (azoto líquido deve ser manuseado com cuidado, sempre usar luvas grossas e óculos). Deixe o degelo papel de filtro congelados à temperatura ambiente durante ~ 2 min.
   5. Colocar o papel de filtro (lado de colónias para cima) na parte superior do papel de filtro pré-embebido no interior da placa de 100 mm, e incuba-se a 30 ° C.
   6. Verifique periodicamente(~ 30 min cada) para o aparecimento de colónias azuis. co-transformada de levedura Y190 com os plasmídeos de controlo positivo (+ pVA3 pTD1) ficará azul dentro de 60 min (observações não publicadas).
      NOTA: Isca ruim: interações alvo pode levar várias horas para produzir um sinal azul positivo (evitar a incubação prolongada (> 8 horas) que podem dar resultados falsos positivos). Para melhores resultados, usar colónias recém-co-transformadas, ou seja, cultivadas a 30 ° C durante 4 -. 5 dias, ~ 2 mm de diâmetro.
3. Β-Gal cultura líquida de Ensaio
   1. Preparar os seguintes tampões:
      1. Preparar tampão Z, contendo 100 mM de Na ₂ HPO _4, 40 mM de NaH ₂ PO _4, 10 mM de KCl, 1 mM de _MgSO4; ajustar o pH para 7,4, esterilizar por autoclavagem e armazenar a RT.
         1 M de Na ₂ CO _3; armazenar à temperatura ambiente.
      2. Preparar tampão Z / β-mercaptoetanol. Adicione tampão antes da utilização pela adição de β-mercaptoetanol a 0,27% v /v em tampão Z; usar 700 ul por amostra. Prepare tampão Z / solução ONPG. Adicione tampão antes da utilização por mistura de ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido) a 4 mg / ml e β-mercaptoetanol a 0,27% v / v em tampão Z; usar 160 ul por amostra.
   2. Usar uma única colónia para inocular 5 ml de meio SD mínimo (sem leucina e triptofano para manter a pressão selectiva nos dois plasmídeos de isco e de destino) e incubar a 30 ° C durante 16-18 horas com agitação a 250 rpm.
      NOTA: Ensaio cinco colônias separadas co-transformada com os mesmos isca e de destino plasmídeos.
   3. Transferir o suficiente da cultura durante a noite em 10 ml de meio SD fresco para produzir uma DO ₆₀₀ = 0,2-0,3. Incubar a 30 ° C com agitação a 250 rpm até que as células estão na fase mid-log _(DO600 = 0,5-0,6).
   4. Transferir 0,5 ml de cultura de levedura para um tubo de 1,5 ml e centrifugar a 14000 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Grave o OD exata ₆₀₀ quando a colheita da cells. Ressuspender pellet em 100 ul de tampão Z; isto irá resultar em um factor de concentração de 5 vezes.
   5. Coloque o tubo em nitrogênio líquido por ~ 1 min (azoto líquido deve ser manuseado com cuidado, sempre usar luvas grossas e óculos) e, em seguida, em um banho de água a 37 ° C durante 3 minutos para descongelar. Repita este ciclo de congelamento-descongelamento mais duas vezes para garantir as células são arrombado.
   6. Configurar um tubo em branco com 100 ul de tampão Z.
   7. Adicionar 700 ul de tampão Z / β-mercaptoetanol e 160 ul de tampão Z / ONPG para a amostra em branco e tubos; iniciar o temporizador e coloque em um 30 ° C incubadora.
   8. Verifique periodicamente para a cor amarela para se desenvolver. Adicionar 400 mL de 1 M Na ₂ CO ₃ a parar o desenvolvimento da cor e registrar o tempo decorrido em minutos. co-transformada de levedura Y190 com os plasmídeos de controlo positivo (+ pVA3 pTD1) ficará amarela dentro de 60 min ..
      NOTA: Isca ruim: interações alvo pode levar várias horas para produzir um sinal amarelo positivo para melhor resultados, usar colónias recém-co-transformadas, ou seja, cultivadas a 30 ° C durante 4 -. 5 dias, ~ 2 mm de diâmetro.
   9. Centrifugar a 14000 xg durante 5 min à temperatura ambiente para sedimentar os detritos celulares e transferir o sobrenadante para uma cuvete limpa.
   10. Usando um espectrofotómetro, medir a absorvência a 420 nm (A ₄₂₀₎ das amostras em relação aos valores em branco (deve estar entre 0,02-1,0).
   11. Calcular unidades β-galactosidase, com uma unidade definida como a quantidade que hidrolisa uma nmol de ONPG a o-nitrofenol e D-galactose por min por célula, de acordo com a seguinte fórmula:
       = unidades β-galactosidase
       Onde: t: tempo decorrido de incubação (em minutos); . cf: o factor de concentração do passo 1.4.8, ou seja, CF = 5; OD _600: quando as células foram recolhidas.

2. Expressão de proteína numa linha celular de mamífero

1. transfecção de células de mamíferos
   1. Prepare os seguintes meios e tampões:
      1. Preparar o meio de crescimento através da mistura de DMEM com 4,5 g / L de glucose, 10% v / v de soro fetal de bovino e 2 mM de L-glutamina; esterilizar através de um filtro de 0,2 um e armazenar a 4 ° C.
      2. Preparar solução salina tamponada com Hepes 2x (2x HBS) por mistura de NaCl 280 mM, KCl 10 mM, 1,5 mM de Na ₂ HPO _4, 12 mM de glucose, 50 mM de Hepes; ajustar o pH a 7,05, esterilizar através de um filtro de 0,2 um e armazenar a -20 ° C. Prepare 2,5 M CaCl _2. Esterilizar através de um filtro de 0,2 um e armazenar a -20 ° C.
   2. Um dia antes da transfecção, as sementes 1 - 2 x 10 ⁶ células HEK293 em uma placa de Petri de 100 mm de modo a ser de 60-70% confluentes no dia seguinte. Cultura de 16 - 18 h a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO _2.
   3. No dia da transfecção, remover as células velhas médias de alimentação e com 10 ml de meio de crescimento fresco.
      NOTA: Os antibióticos são omitidos do meio de cultura durante a transfecção, pois pode aumentar a morte celular.
   4. Dilui-se 24 ug de ADN de plasmídeo (por co-transf ecções, uma proporção molar igual dos dois plasmídeos) e 60 ul de 2,5 M de _CaCl2 em 600 ul de volume total (feito com estéril _H2O desionizada) dentro de um tubo de 1,5 ml; vortex para misturar.
      NOTA:. Para uma maior eficiência de transfecção, ADN de plasmídeo deve ser de elevada pureza, isto é, têm uma relação de Abs ₂₆₀ / Abs ₂₈₀ = ~ 1.8.
   5. Adicionar gota a solução de DNA de plasmídeo / cálcio sábio para um tubo de 50 ml contendo 600 ul de HBS 2x enquanto constantemente e misturar vigorosamente em vortex. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente para permitir a formação de complexos / ADN plasmídeo de fosfato de cálcio.
   6. Após a incubação de 20 min, vortex brevemente e adicionar gota a solução de sábio sobre as células para cobrir toda a área de superfície da placa de Petri de 100 milímetros.
   7. Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO _{2. Após 6 h ~ mudar o meio de crescimento e colocá volta na incubadora.}
   8. Recolher as células 24 h pós-transfecção por centrifugação a 1000 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Os sedimentos celulares podem ser armazenadas a -80 ° C até ser necessário.
      NOTA: Expressão normalmente picos 24-72 horas pós-transfecção.
2. A homogeneização celular
   1. Preparar os seguintes tampões:
      1. Preparar tampão de homogeneização Co-IP por mistura de NaCl 150 mM, Tris 20 mM; ajustar o pH para 7,4 e armazenar a 4 ° C.
      2. Prepare de reticulação tampão de homogeneização por mistura de tampão Hepes 5 mM, 0,3 M de sacarose; ajustar o pH para 7,4 e armazenar a 4 ° C (filtro antes da utilização para remover quaisquer partículas). Suplemento com inibidores de protease antes da utilização.
   2. Adicionar 250 ul de pérolas de vidro (425 - 600 mícrons) dentro de um tubo de 1,5 ml e lava-se com 500 ul de tampão de homogeneização. contas de vidro de pellets por uma breve centrifugaçãopulso (1000 xg durante 5 seg) e remover o sobrenadante. Repita este passo de lavagem mais uma vez.
   3. Ressuspender o sedimento de células (a partir do passo 2.1.8) em 500 ul de tampão de homogeneização arrefecida com gelo e transferir a suspensão de células para dentro do tubo de vidro grânulos contendo.
   4. Homogeneizar células sobre gelo por 20 passagens através de uma agulha fina (23 g, 0,6 x 30 mm) ligada a uma seringa de 1 ml. Com a tampa do tubo fechado, perfure através dele com a agulha e dispersar suspensão de células vigorosamente através das contas de vidro.
   5. Centrifugar a 1.500 xg durante 10 min a 4 ° C para remover núcleos e células inteiras e rejeitar o sedimento. Salve o sobrenadante que representa a fração de pós-nuclear e avançar directamente para co-IP ou de reticulação conforme apropriado.

3. métodos in vitro bioquímicos

1. Co-imunoprecipitação
   1. Preparar os seguintes tampões:
      1. Preparar tampão de homogeneização Co-PI, tal como descrito em Sexão 2.2.1.1. Preparar tampão de IP através da mistura de 20 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 0,5% (w / v) de CHAPS, ditiotreitol 2 mM (opcional; ditiotreitol pode ser incluído para reduzir agregados de proteínas que se possam ter formado devido à oxidação ao ar); ajustar o pH para 7,4 e armazenar a 4 ° C.
      2. Prepare a 2% w / v de CHAPS em tampão de homogeneização co-PI; Armazenar a 4 ° C.
      3. Preparar tampão de carregamento de proteína por mistura de Tris 60 mM, 2% w / v de SDS, 10% v / v de glicerol, 5 mM de EDTA, 0,01% w / v de azul de bromofenol, 2% v / v β-mercaptoetanol (facultativo); ajustar o pH para 6,8 e armazenar a RT.
   2. Homogeneizar as células confluentes de uma placa de 100 mm de Petri (~ 8 X 10 ⁶ células HEK293 se, contaram com a utilização de um hemocitómetro) tal como descrito na Secção 2.2.
   3. Solubiliza-se a fracção sub-celular pós-nuclear com 0,5% de CHAPS (utilizando o material de 2%) e incubação durante ≥2 h a 4 ° C com mistura constante. Centrifuga-se a 20000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar o materi insolúvelal e descartar o pellet. Salve o sobrenadante denominado ligado celular.
      NOTA: A inclusão de um detergente e a remoção do material insolúvel é absolutamente necessário para minimizar a ligação não específica. Detergentes. Intermediários, por exemplo, ou CHAPS Triton X-100, a uma concentração de 0,2-1%, são as mais vulgarmente usadas.
   4. Preparar dois separados tubos de 1,5 ml e adicionar 20 l ~ (dependendo da capacidade de ligação a IgG) de 6 mg / ml de Proteína A ou Proteína G-agarose (Sepharose) ou grânulos. Lava-se com 200 ul de tampão de IP.
      NOTA: Escolha a resina Ig de ligação apropriado, dependendo das espécies animais utilizados para elevar o anticorpo imunoprecipitação. Proteína-G liga-se uma ampla gama de subtipos de Ig em comparação com Proteína-A.
   5. Recuperar grânulos por centrifugação a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repetir a lavagem mais uma vez com tampão de IP e, em seguida ressuspender pérolas em 200 ul de tampão de IP.
   6. Adicionar 1 mg (5 ng / ul) de anticorpo IgG de imunoprecipitação ou não imune (paraservir como controle negativo) nos / L contendo tubos de dois separados Protein-A. Incubar durante ≥2 h a 4 ° C com mistura constante.
      NOTA: Sempre processar um controlo negativo, com o uso de IgG não imune levantada nas mesmas espécies animais como o anticorpo imunoprecipitação.
   7. Recuperar grânulos por centrifugação a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante cuidadosamente por pipetagem.
   8. Transferir 200 ul de lisado de células (a partir do passo 3.1.3) em cada um dos dois tubos com anticorpo e / G esferas de Proteína-A. Incubar durante ≥2 h a 4 ° C com agitação constante, para permitir a ligação ao antigénio-anticorpo.
   9. Recuperar grânulos e lava-se com 200 ul de tampão de IP; incubar durante 10 min a 4 ° C com mistura. Recuperar contas de e lavar duas vezes mais (evitar várias lavagens que irá reduzir tanto o específico não específica e obrigatória). Cuidadosamente descartar o sobrenadante por pipetagem.
   10. Adicionar 30 ul de tampão de carregamento de proteína para eluir immunoprecipitproteínas ated. Centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C, os grânulos descartar e guardar o sobrenadante que contém a amostra de co-eluída IP.
   11. Para verificar a bem sucedida proteína X precipitação, carregar uma pequena quantidade ^(1/10, 3 ul) da amostra de co-PI num gel de SDS-PAGE para ser analisados ​​por imunotransferência ¹⁷ com um anticorpo específico para a proteína X. Incluir uma alíquota da lisado celular para verificar a expressão da proteína X na sua amostra.
   12. Para testar a presença de proteína de co-precipitado Y, carregar o restante ^(9/10, 27 ul) da amostra de co-PI num gel de SDS-PAGE separado para ser analisado por imunotransferência ¹⁷ com um anticorpo específico para proteína Y. incluem-se uma alíquota do lisado celular para verificar a expressão da proteína Y na sua amostra.
2. Reticulação química
   1. Preparar os seguintes tampões:
      1. De reticulação tampão de homogeneização, tal como descrito na secção 2.2.1.1.
      2. Prepare p 5xrotein tampão de carregamento por mistura de Tris 300 mM, 10% w / v de SDS, 50% v / v de glicerol, EDTA 25 mM, 0,05% w / v de azul de bromofenol, 10% v / v β-mercaptoetanol (facultativo); ajustar o pH para 6,8 e armazenar a temperatura ambiente; aquecido a 50 ° C antes da utilização.
   2. Homogeneizar as células confluentes de uma placa de 100 mm de Petri (~ 8 X 10 ⁶ células HEK293 se, contaram com a utilização de um hemocitómetro) tal como descrito na Secção 2.2.
      NOTA: Sacarose (em 0,3M) é utilizado para criar um tampão iso-osmótico. Sal, por exemplo, 120 - 150 mM de NaCl ou KCl pode ser usada em vez disso, de acordo com o complexo de proteína oligomérica de interesse.
   3. Centrifugar a fracção sub-celular pós-nuclear a 20,000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar agregados de proteína e guardar o sobrenadante. Aqui oito aliquotas de 20 ul de cada um (tipicamente em ~ 20 ug de proteína) em tubos de 0,5 ml separados.
   4. Adicionar 0,0025% v / v glutaraldeído a todas as amostras e iniciar o temporizador. Deixe que cada uma das oito amostras reagem com glutaraldehyde à temperatura ambiente durante: 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 min.
      NOTA: O glutaraldeído tem dois grupos aldeído que reagem com as aminas livres. Evitar o uso de tampões de pH ou outras substâncias com grupos amino primários, porque eles vão parar a reacção glutaraldeído.
   5. Pare reacção glutaraldeído no momento especificado com 2% v / v de hidrazina e adicionar 5 mL de 5x tampão de proteína-carregamento para desnaturar proteínas.
   6. Continuar a SDS-PAGE e immunoblotting ^17.

Resultados

No sistema Y2H, a isca: presa interacção é inicialmente testado por selecção em meio de crescimento de levedura falta (triptofano, leucina e) histidina e, subsequentemente, avaliadas por β-Gal ensaios de actividade enzimática (Figura 1). Levedura cultivadas em histidina falta médio tem taxa de crescimento lento, que depende da força da isca: interação proteína presa. O ensaio β-Gal é levada a cabo em levedura (cultivadas em meio sem triptofano e leucina única) seja crescente no suporte sólido (placas de agar) ou em cultura líquida, com os últimos resultados quantitativos rendimento. Nós temos utilizado com sucesso o Y2H para identificar as interações domínio de domínio dentro do RyR2, bem como novos parceiros de proteína ^{2-4,12,21,22.} Por exemplo, nós analisamos uma série de construções de sobreposição abrangendo todo o comprimento da sequência do péptido RyR2 para a interacção com um fragmento N-terminal (AD4L: RyR2 resíduos 1-906 fundido com GAL4 AD). ³ ensaios filtros Colony-elevador de papel β-Gal produzida vivas colónias de levedura de cor azul única para o BT4L: par AD4L (Figura 2A), mostrando que AD4L interage com ele mesmo, ou seja, a BT4L construir (resíduos RyR2 1-906 fundidos com GAL4 DNA-BD). Pálidos colónias azuis foram detectados pela BT8: par AD4L sugerindo uma associação mais fraca secundário com o domínio C-terminal extremo (BT8), enquanto leveduras co-transformada com qualquer outra construção permaneceu branca e, portanto, negativo para isco: a interação proteína presa. Os resultados quantitativos obtidos através de ensaios de β-Gal líquidos (Figura 2B), indicado BT4L robusta: equivalente interacção AD4L em força para a conhecida associação entre a proteína p53 (pVA3) e o antigénio T grande de SV40 (pTD1), ao passo que o BT8: interacção AD4L foi consideravelmente mais fracos (<10% em comparação com o controlo).

Nós rotineiramente realizar experiências co-IP (Figura 3) fepois expressão transiente numa linha de células de mamíferos (células HEK293), como um ensaio bioquímico independente para reforçar as conclusões Y2H ^{2-4,12-14,21-24.} Para verificar a RyR2 N-terminal de auto-interacção, dois plasmídeos separados que codificam para os resíduos de RyR2 1-906 marcadas com tanto o epitopo péptido cMyc ou HA (BT4L e AD4L, respectivamente), foram co-transfectados em células HEK293 utilizando o método de fosfato de cálcio precipitação ^3. A fracção pós-nuclear de células homogeneizadas foi solubilizado com os detergentes CHAPS, e o material insolúvel foi removido por centrifugação para produzir o lisado celular. O ligado de células, tratadas com o agente redução de ditiotreitol foi então incubado com Ac ^{de HA} e esferas de Proteína-A Sepharose para imunoprecipitar AD4L marcada com HA. Amostras co-IP, eluídas com tampão contendo SDS, foram carregadas em dois geles de SDS-PAGE separadas ^(1/10 e ^9/10 de divisão) e analisados ​​por imunotransf erência com Ab ^HA e Ab ^cMyc, respectively. Bem sucedido IP directa de AD4L (~ 100 kDa) por Ab ^HA foi verificada por imunotransferência, mas não no controlo negativo utilizando IgG de coelho não imune (Figura 4A). Importante, cMyc-tagged BT4L (~ 100 kDa) foi recuperado apenas no ^HA IP Ab, e não no controlo negativo na ausência de AD4L imunoprecipitado (Figura 4B).

ensaios y2h e co-IP forneceram evidências consistentes para RyR2 N-terminal de auto-interação, mas eles não informam sobre o estado de oligomerização do domínio N-terminal, ou seja, se ele faz apenas dímeros ou complexos mais elevados. Deve notar-se que os complexos se dissociam e apenas as subunidades compreendendo será detectada por SDS-PAGE, devido a SDS e a desnaturação de proteínas induzida pelo calor, que suprime interacções proteína-proteína. Para ultrapassar esta situação, podemos utilizar a reticulação (Figura 5) que quimicamente e estavelmente conjuga protei pré-existenten oligómeros cuja massa molecular, pode então ser analisada por SDS-PAGE tamanho separação ^2-5. Por exemplo, homogenato de células HEK293 que expressam cMyc-BT4L, tratado com o agente redução de ditiotreitol, foi feita reagir com glutaraldeido e analisaram-se por SDS-PAGE e imunotransferência utilizando Ab ^cMyc (Figura 6). Em adição ao monómero (~ 100 kDa), uma banda de proteína de elevada massa molecular de ~ 400 kDa foi detectada de uma forma dependente do tempo, indicando RyR2 N-terminal tetrâmero formação ^3. Notavelmente, tetrâmero foi a espécie predominante oligoméricas, com dímero mínimo e bandas trimer observados. Para determinar sua massa molecular aparente, o oligômero BT4L foi separado por meio de 4-15% de gel de gradiente de SDS-PAGE ^3. Produzimos a massa / gel de curva padrão retardo molecular utilizando padrões de proteínas com uma gama de 30-460 kDa, e calculou-se o oligómero de ser 358 kDa 15 (n = 4). Esta massa molecular aparente está de acordo com um tetrâmero BT4L dispostos numaforma circular fechada em vez de na forma linear, como esperado a partir da disposição das quatro subunidades dentro do canal RyR2 nativa.

Figura 1. Y2H Fluxograma. Yeast, co-transformada com isca e de destino plasmídeos, é selecionada para crescimento em meio sem histidina e / ou testado quanto à actividade enzimática β-Gal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Y2H Sugere RyR2 N-terminal Domínio A auto-interacção. (A) Representação esquemática que descreve a série (isca) de fragmentos de proteínas humanas sobreposição RyR2 testados no sistema para Y2H interacção com o constructo AD4L RyR2 N-terminal (presa). Os resultados qualitativos obtidos por meio de ensaios de papel β-Gal filtro colónia-lift estão indicados em "+" múltiplos ou "-" para a interação negativa ensaios (B) líquidos Quantitative β-Gal normalizados contra o controle positivo (pVA3 codifica para GAL4 DNA-BD. fusão com a proteína p53; pTD1 codifica para a fusão AD GAL4 com antigénio T grande SV40). Modificado de ^3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Co-IP fluxograma. As células de mamíferos, co-transfectadas com plasmídeos que X e Y, são homogeneizados e para produzir o lisado celular utilizada no ensaio de co-IP, seguido de SDS-PAGE e imunotransferência solubilizada por detergente.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Co-IP indica RyR2 N-terminal Domínio A auto-interacção em células de mamífero. As células HEK293 foram co-transfectados para a co-expressão transitória de cMyc-etiquetado (BT4L) e marcada com HA domínio (AD4L) RyR2 N-terminal ( os resíduos 1-906). AD4L foi imunoprecipitada com Ab ^HA de solubilizadas em CHAPS e tratado com ditiotreitol HEK293 lisado, enquanto que os ensaios de controle, co-IP como negativos foram realizados com IgG de coelho não imune. As proteínas imunoprecipitadas foram aquecidos a 85 ° C durante 5 minutos e resolvidas em 20 mA durante 3 horas através de géis de SDS-PAGE 6% separadas carregadas com ^1/10 ou ^9/10 de amostras IP. Na sequência da transferência de proteína a 80 V durante 2 h para polyvinymembrana de difluoreto de lidene, análise de imunotransf erência foi realizada utilizando (1: 1000 de diluição) Ab ^HA (A) ou Ab ^cMyc (B), respectivamente, seguido de peroxidase de rábano conjugado com anti-IgG de ratinho (diluição de 1: 10.000) e a detecção de quimioluminescência aumentada (1 min de exposição). Uma alíquota de lisado celular, ^1/50 do volume processado em amostras IP, também foi incluído para servir como padrão de massa molecular. Modificado de ^3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Fluxograma de reticulação. As células de mamíferos, transf ectadas com o plasmídeo X, são homogeneizados e submetido a reacção com o glutaraldeído no ensaio de reticulação, seguido por SDS-PAGE e immunoblotting. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. A ligação cruzada Indica RyR2 N-terminal Domínio A formação Tetrâmero células HEK293 que foram transfectadas para a expressão transitória de cMyc-tagged domínio (BT4L) RyR2 N-terminal (resíduos 1 - 906).. homogenato celular, tratado com o agente redução de ditiotreitol, foi incubada com glutaraldeído para os pontos de tempo indicados. As amostras foram aquecidas a 85 ° C durante 5 minutos e resolvidas por SDS-PAGE (gel de 6%) a 20 mA durante 3 horas. Após a transferência de proteína, a 80 V durante 2 horas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno, análise de imunotransf erência foi realizada utilizando (1: 1000 de diluição) Ab ^cMyc, seguido de peroxidase de rábano conjugado com anti-IgG de ratinho (1:10000 diluição) e a detecção de quimioluminescência aumentada (1 min de exposição). Monomérico (H: ~ 100 kDa) e formas tetramérica (T) são indicados pelas setas. Modificado de ^3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A formação de homo-oligómeros de proteínas é um processo biológico fundamental que regula a actividade de factores de transcrição, enzimas, canais iónicos e receptores ^25,26. Importante, oligomerização proteína tem também implicações patológicas incluindo neurodegeneração e doença cardíaca arritmogênica ^4,27. As metodologias descritas neste artigo são usados ​​para identificar interações de domínio do domínio de mediação proteína auto-associação e oligomerização. Abaixo, destacamos nas etapas críticas dentro de cada protocolo, e discutimos considerações importantes, limitações e solução de problemas.

O sistema Y2H pode ser utilizado pela primeira vez para o rastreio de potenciais parceiros de proteína interagindo por causa de sua relativamente alta throughput screening, facilidade de uso e resultados altamente reprodutíveis. procedimentos y2h são realizadas em um laboratório de microbiologia com incubadoras padrão (placa ou shaker) e instalações de sala de contenção. A utilização de FRcélulas competentes preparadas eshly (passo 1.1.8) é crítica para a transformação de levedura de alta eficiência, enquanto que para obter os melhores resultados em ensaios β-Gal, recém colónias de levedura crescido (até 5 dias de idade) deve ser utilizada (passo 1.2.3). Sistemas baseados em outros do que GAL4 e / ou genes repórter adicionais / alternativas fatores de transcrição estão disponíveis e, portanto, isca e plasmídeos presa deve ser combinado com a estirpe Y2H adequado.

Algumas estirpes devem ser cultivadas na presença de 3-amino-1,2,4-triazole, um inibidor competitivo da proteína HIS3, de modo a extinguir qualquer expressão constitutiva do gene repórter HIS3 de ^7,8. Expressão de proteínas de fusão de iscas e de destino deverá ser verificada por imunotransferência ^17. No caso de isca / proteínas de fusão de presa são tóxicos para as leveduras, os níveis mais baixos de proteína toleráveis ​​poderia ser conseguido por clonagem em diferentes vectores de isco, onde / é presa expressão conduzido por um promotor diferente. Além disso, é essencial para assegurar tproteínas de fusão de isca / rapina chapéu não exibem a atividade do gene repórter autónoma. activação do gene repórter Autónoma pode ser resgatado por modificar a construção para remover a região responsável, ou trocando o GAL4 DNA-BD e fusões AD para as duas proteínas testadas. Além disso, os domínios transmembranares são melhor omitido de construções de isca / presa porque pode induzir misfolding ou mislocalization de proteínas de fusão em compartimentos de membrana intracelular. Com efeito, a principal desvantagem do sistema Y2H é que as proteínas isco e alvo estão localizadas no núcleo de levedura de distância da sua localização subcelular fisiológico e potencialmente desprovido modificações pós-traducionais específicas, resultando em falsos-positivos ou falsos negativos interacções ^6-9 .

Os sistemas de expressão heterólogos de mamífero são mais adequados para o estudo de proteínas de membrana integrais de mamífero em termos de conformação, de modificações pós-traducionais e localização subcelular.Um dos métodos de transfecção celular mais utilizado é a precipitação de fosfato de cálcio, principalmente por causa do equipamento mínimo e reagentes necessários ^11,15. Métodos alternativos, ou seja, electroporação, lipos somas, lípidos catiónicos e polímeros, podem originar uma maior eficiência de transfecção, dependendo da linha celular e construção utilizada. Em geral, os factores que afectam a eficiência da transfecção primárias são a qualidade do ADN de plasmídeo e de células de saúde / viabilidade. Os melhores resultados são obtidos quando o DNA de plasmídeo de mais alta pureza (260 nm / 280 nm Taxa de absorção de ~ 1,8) e células que se dividem activamente são utilizados. As células devem, portanto, ser transfectado em não mais do que 60 - 70% de confluência (passo 2.1.2), porque a capacidade de tomar-se DNA estranho está relacionada com a área de superfície da célula exposta ao meio ^11. Além disso, a inclusão de antibióticos no meio de cultura durante a transfecção (passo 2.1.3) não é aconselhável devido a um aumento da morte celular ^15.

Fou precipitação com fosfato de cálcio, em particular, a preparação, cuidadosa e ajustamento do pH (de 7,05 precisamente) da solução de HBS 2x (passo 2.1.1), e a formação correcta de DNA plasmídeo / cálcio / fosfato complexos por mistura vigorosa (passo 2.1.5) são passos críticos para alta transfecção eficiência. Tipicamente, a expressão da proteína por picos de transfecção transiente dentro de 24-72 horas.

Uma vez que as células são colhidas, procedimentos subsequentes devem ser realizadas a 4 ° C para minimizar a actividade de protease, e adição de inibidores de protease é recomendado. homogeneização celular deve ser seguido por um passo de centrifugação para remover os núcleos porque o ADN cromossómico pode aumentar a viscosidade da solução e aumentar a ligação não específica. Assim, homogeneização por meios mecânicos em um tampão iso-osmótico é preferido, usualmente na (0,3 M) de sacarose, ou (150 mM) de NaCl. De um modo geral, os tampões à base de sacarose são conhecidos para melhorar a estabilidade da proteína e reduzir a agregação de proteínas não-nativo potencial, mas devido a phidratação referencial na superfície da proteína, as interacções proteína-proteína electrostáticas são favorecidos. Por outro lado, tampões à base de sal influenciar a carga líquida de grupos laterais de aminoácidos carregados na superfície da proteína, tendo assim um viés para mais interações hidrofóbicas à base ^28.

Co-IP é o ensaio bioquímico mais vulgarmente empregues para avaliar as interacções proteína-proteína, especialmente a partir de tecido nativo. Sua principal desvantagem é a exigência de anticorpos altamente específicos validados para uso em IP e immunoblotting ^10,16,18. Assim, as proteínas recombinantes são frequentemente marcado com um epítopo de péptido, por exemplo., Hemaglutinina da gripe (YPYDVPDYA) ou cMyc humana (EQKLISEEDL), para o qual os anticorpos específicos de elevada afinidade estão disponíveis comercialmente. Se desejado, o anticorpo imunoprecipitação pode ser quimicamente conjugados para a Proteína-A resina para evitar a sua eluição e detecção durante a fase de imunotransferência que podem obscurecer o co-precipitado PRotein ^16; Para conseguir isso, temos utilizado com sucesso o agente de ligação cruzada química 3,3'-ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate) ^24. É imperativo que um detergente apropriado está incluído no tampão de IP e o material insolúvel das células homogeneizadas é removido por centrifugação para minimizar a ligação não específica (passo 3.1.3). A escolha e a concentração de detergente são considerações importantes: detergentes fortes e / ou concentrações mais elevadas reduzem substancialmente não específico de ligação, mas podem também abolir X: interacção proteína Y, enquanto que concentrações mais baixas ou detergentes mais leves pode permitir uma interacção fraca para ser observada, mas pode resultará em ligação não-específica excessiva. Detergentes força intermediários são os preferidos, por exemplo, Triton X-100 a 0,5 -. 1% de concentração. Para reduzir ainda mais a ligação não específica, uma proteína neutro (por exemplo, albumina de soro bovina a 100 ug / ml) pode ser incluído no tampão de IP, e / ou do lisado celular pode ser pré-Cleared com incubação prévia com resina de Proteína-A sozinho. O número de lavagens devem ser optimizados para a X: Y par testado, tipicamente três de 10 min lavagens com tampão IP (passo 3.1.9). Em qualquer caso, uma amostra de co-IP com IgG não-imune, como o anticorpo imunoprecipitar deve sempre ser processados ​​em paralelo para servir de controlo negativo (passo 3.1.6).

A principal vantagem de reticulação química é que informa sobre a composição estequiométrica da proteína de homo-oligómero. O glutaraldeído é um agente de ligação cruzada comumente usado, porque não requer equipamento especializado e gera termicamente e quimicamente ligações cruzadas estáveis ​​entre proteínas que interagem ^19,20. Os compostos com grupos amino livres deve ser omitido dos buffers de ensaio (passo 3.2.1), porque eles vão parar a reacção química. a concentração de glutaraldeído e tempo de reacção (passo 3.2.4) deve ser optimizado para o complexo de proteína oligomérica de interesse. A principal desvantagem desta técnica, especialiado quando realizada em preparações de células inteiras, é a não especificidade da reacção química que poderia produzir agregados de proteínas artificiais que não têm significado biológico.

Alternativa in vivo (por ex., Fluorescência de ressonância de transferência de energia, a fluorescência bi-molecular ou de complementação de luminescência) e em técnicas in vitro (por ex., Cromatografia de exclusão de tamanho, ultracentrifugação analítica, de titulação isotérmica calorimetria) estão disponíveis para a caracterização da proteína de auto-associação e de avaliação de oligomerização estequiometria ^29,30. Cada método tem as suas próprias vantagens e desvantagens, e que pode ser mais adequado para o estudo de uma proteína específica, dependendo de purificação de proteína / estabilidade e disponibilidade do equipamento / reagente. Os três métodos complementares aqui descritos em detalhe, nomeadamente Y2H, co-IP e a ligação cruzada, têm sido utilizados em combinação para fornecer evidências convincentes para RyR2 homo-oligomeR formação isoladamente e dentro de uma célula viva.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PART 1 yeast two-hybrid
Plate incubator	Hereaus	B6120	Used at 30 °C
Orbital shaker incubator	New Brunswick Scientific	INNOVA 4300	Used at 30 °C with shaking at 230 - 250 rpm
Spectrophotometer	Perkin Elmer	Lambda Bio+	To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay
Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit	Takara Clontech	K1604-1	Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2  and yeast strain Y190
Yeast Nitrogen Base	Sigma-Aldrich	Y0626	To prepare minimal SD growh medium
Dropout supplement lacking leucine and tryptophan	Sigma-Aldrich	Y0750	To prepare minimal SD growh medium
Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine	Sigma-Aldrich	Y2001	To prepare minimal SD growh medium
Herring testes carrier DNA	Takara Clontech	630440	For yeast transformation
Whatman filter paper Grade 5	Sigma-Aldrich	WHA1005070	for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)	Sigma-Aldrich	B4252	for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)	Sigma-Aldrich	N1127	for use in liquid b-Gal assay
PART 2. Protein expression in a mammalian cell line
HEK293 cell line	ATCC	ATCC® CRL-1573™
Humidified incubator (5% CO2, 37 °C)	SANYO	MCO-18AIC	To culture mammalian cells
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium)	Invitrogen (ThermoFisher)	41966	To prepare growth medium for mammalian cells
Fetal Bovine Serum	Invitrogen (ThermoFisher)	10500	To prepare growth medium for mammalian cells
Glass beads	Sigma-Aldrich	G8772	To homogenise cells
Needle 23 G (0.6 x 30 mm)	BD Microlance	300700	To homogenise cells
Protease inhibitor cocktail (Complete)	Roche	11873508001	To prevent proteolysis
PART 3. In vitro biochemical methods
Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system)	Bio-Rad	1658000EDU	For polyacrylamide gel electrophoresis
Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)	Bio-Rad	1703940	For electrophoretic transfer
Compact X-ray film processor	Xograph	X4	For use in immunoblotting
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882	For use in chemical cross-linking
Protein-A sepharose beads	GE Healthcare Life Sciences	17-5280-01	For use in co-IP assay
Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG)	Santa Cruz Biotechnology	sc-805	For use in co-IP assay
Non-immune rabbit IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2027	For use in co-IP assay
Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG)	Santa Cruz Biotechnology	sc-40	For use in immunoblotting
Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG)	Covance	MMS-101P	For use in immunoblotting
Anti-mouse IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	For use in immunoblotting
Hyperfilm ECL	GE Healthcare Life Sciences	28906836	For use in immunoblotting
ECL Western Blotting Substrate	Pierce (ThermoFisher)	32106	For use in immunoblotting