Генетические и биохимические подходы к<em&gt; В Vivo</em&gt; и<em&gt; In Vitro</em&gt; Оценка белка олигомеризации: The Рианодин Рецептор Case Study

Резюме

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca²⁺ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Аннотация

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca²⁺ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by β-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Введение

Скелетной и сердечной мышцы сокращение вызвано саркоплазматического ретикулума Са ²⁺ высвобождения , опосредованного RyR. Есть три млекопитающим RYR изоформы с функциональным каналом, состоящим из четырех идентичных субъединиц. Каждый RyR субъединица состоит из большого цитоплазматического регуляторной N-концевой части и небольшой С-концевой части , содержащей трансмембранный домены , которые образуют высокую электрическую проводимость Ca ²⁺ пор. Аномальные внутри- и меж-субъединичные взаимодействия лежат в основе дисфункции канала RYR и приводят к нервно - мышечной и сердечных заболеваний ^1. Идентификация и характеристика конкретных областей, участвующих в RyR структура: функции отношений Поэтому крайне важно для понимания RyR патофизиологии.

Традиционные биохимических методов белок-белкового взаимодействия требуют значительных количеств очищенного протеина, часто образуются бактерии. Это не представляется возможным в случае RyR, очень большой мембраной рrotein состоит из ~ 5000 аминокислот, в то время как его рекомбинантные фрагменты не так легко поддаются бактериальной экспрессии и очистки. Таким образом, альтернативные системы экспрессии, включающие эукариотические клетки-хозяева необходимы для млекопитающих интегральные мембранные белки. Ранее мы использовали Y2H, со-IP и сшивающие анализы в совокупности показывают , что N-конец тетрамеризации является конструктивной особенностью , которая сохраняется через три RyR млекопитающих изоформы ^2,3. Важно отметить, что мы обнаружили , что одна точечная мутация , связанная с аритмогенному заболеванием сердца нарушает N-концевой самоассоциация и результаты в дисфункциональной канале RyR ^4. Кроме того, мы применили эти методы для олигомеризации исследований RyR цитоплазматического С-концевого хвоста ^5, а также N-конца внутриклеточного гомологичной канала высвобождения Са ^2+, в инозитол - 1,4,5 трифосфата рецептора ^2.

В анализе Y2H, то interactiна между двумя белками (х и у) измеряют с помощью восстановления функционального фактора транскрипции (GAL4) и последующей активации репортерных генов ^6-9. Два разных вектора клонирования используются для генерации слитых двух испытанных белков с двумя физически разделяющимися независимыми доменами GAL4: ДНК-связывающий домен (ДНК-BD) / белка X фьюжн (приманка) и активация домена (AD) / белок Y фьюжн (цель). Y2H может быть использован для тестирования, взаимодействует ли белок с самим собой, генерируя GAL4 ДНК-BD и AD слитые того же самого белка. Генетически модифицированные штаммы Y2H являются GAL4 и GAL80 дефицитных (белок GAL80 является репрессором GAL4), а также TRP1 и LEU2 дефицитом (чтобы обеспечить выделение питательных веществ для приманки и добычей плазмид, соответственно). В ядре дрожжей, рекомбинантные ДНК-BD и AD пептиды приведены в тесной физической близости с получением фактора транскрипции GAL4 гибридного только через X их слитых ': Y INTeraction. Такой подход позволяет быстро генетический скрининг для выявления белок-белковых взаимодействий с помощью параллельного транскрипционной активации прототрофного (HIS3 кодирование для фермента , необходимого для биосинтеза гистидина) и хромоген (кодирование LacZ для бета-галактозидазы (β-гал)) репортерных генов. Основным преимуществом является то , что Y2H она представляет собой анализ в естественных условиях , который обнаруживает даже слабые или преходящие белок-белковых взаимодействий. Кроме того, обнаружение предполагает простое использование выбора роста (в средствах массовой информации, не содержащей гистидина) или колориметрическим (β-Gal) анализ без необходимости очистки приманку и белков-мишеней или выработки специфических антител. Кроме того, Y2H может быть использован для скрининга коллекции неизвестных случайных клонов (библиотеки кДНК клонов, слитые с GAL4 AD) для новых партнеров связывания протеина приманки, а также дает прямой доступ к кДНК библиотеки белка.

Для расширения Y2H наблюдения, Independмогут быть использованы биохимические методы Ent. Co-IP и сшивающие анализы в сочетании с иммуноблоттинга методы , используемые для обнаружения белковых ассоциаций в сложных смесях образцов . , Например, лизаты целых клеток ^10. Их главное преимущество заключается в том, что они сообщают о белок-белковых взаимодействий с нативной ткани, в отличие от других методов, которые требуют использования рекомбинантных белков. Рекомбинантные белки также могут быть использованы, как правило, выражается в линии клеток млекопитающих, где они, вероятно, имеют их правильной конформации и посттрансляционные модификации, а также субклеточном локализации. Тем не менее, так как со-IP и сшивание в анализах пробирке использования гомогенизированных клеток, необходимо подтвердить , является ли оба партнера в белках колокализуются в интактной клетке ^11. Мы обычно используют трансфекцию клеток млекопитающих HEK293 к скоротечно выразить млекопитающих интегральные мембранные белки и цитозольных с использованием метода осаждения фосфата кальция ²-4,12-14, Описано здесь подробно. Это недорогой способ для эффективной доставки плазмидной ДНК внутри клеток , но она зависит от конкретной клеточной линии и клеток слияния, а также чистоты плазмидной ДНК ^11,15.

Анализ со-IP включает в себя выделение нативного или рекомбинантного белка , представляющего интерес из лизатов клеток в условиях без денатурации , позволяющих совместное очистку предполагаемых партнеров взаимодействия ^10,16. Это требует использования двух независимых антител к иммунопреципитации антител для выделения белка Х, и иммуноблоттинга антитела для обнаружения белка-партнера Y. Он может быть использован для тестирования, взаимодействует ли белок с самим собой, генерируя два разных слитые с двумя различными эпитопом метки (например., HA и CMYC). Иммунопреципитации антитело связывается через Fc-области на протеин-А (или протеин-G, в зависимости от вида животного, где был поднят антитела), которыеконъюгируют с агарозы (или с сефарозой) смолы. Белок Х осаждают антителом: протеин-А смолы после инкубации с лизатом клеток, а именно детергентом растворимой фракции гомогенизированных клеток. Белковые иммуно-комплексы элюировали SDS-содержащего буфер , и затем анализируют с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга с использованием антител для обнаружения присутствия белка Y ^17. Со-IP следует проводить с моющими растворимых белков, чтобы избежать чрезмерного неспецифического связывания. Выбор моющего средства и его концентрации, а также число стирок, должны быть оптимизированы для каждого X: Y пары ^10,16,18.

Поперечное сшивание используется для определения стехиометрии олигомерных белкового комплекса. Он основан на химической реакции для создания ковалентных связей между соседними взаимодействующими протомерами, и, следовательно, она позволяет сохранение олигомерных статуса белка в процессе разделения в SDS-PAGE. Существуют многочисленные сшивающий reageNTS различной длины и химии, ориентированных на различные реакционноспособные группы белков, как правило, первичные амины, карбоновые или тиоловых групп. Здесь мы опишем использование глутаровый альдегид (ОНС (СН _{2) 3} CHO), что на гомо-бифункциональный сшивающий агент , с двумя альдегидных групп по обе стороны прилавка, которые взаимодействуют со свободными аминогруппами , присутствующих в остатках лизина ^19,20. Сшивание следуют в от концентрации или зависимости от времени, что приводит к образованию аддуктов. Реакцию останавливают Глютаральдегид гидразина (H ₂ NNH ₂₎ и образцов белка затем анализируют с помощью SDS-PAGE и иммуноблотинга ¹⁷ для оценки их состояния олигомеризации. Следует отметить, что перекрестное связывание не вызывает олигомеризацию, а лишь создает стабильные мосты между уже существующими белковыми комплексами. Важные соображения при проведении сшивающие экспериментов включает в себя выбор сшивающего агента, его концентрации и времени реакции ^19,20.

протокол

1. Дрожжи дигибридная

1. трансформации дрожжей
   1. Подготовьте следующие носители и буферы:
      1. Приготовьте дрожжевое полный дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (YPD) среде путем смешивания 20 г / л пептона, 10 г / л дрожжевого экстракта, 2% вес / об глюкозу (добавленный после автоклавирования) и 20 г / л агара (для пластин только) ; Стерилизовать автоклавированием и использовать свежие на день эксперимента.
      2. Готовят дрожжи минимальный синтетический определенный (SD) среды (с недостатком лейцина и триптофана, чтобы сохранить селективное давление на обе приманки и целевых плазмид) путем смешивания 6,7 г / л дрожжевого азотистого основания, 1,6 г / л Dropout добавки с недостатком лейцина и триптофана, 2% мас / объем глюкозы (добавляется после автоклавирования) и 20 г / л агара (для пластин только); Стерилизовать автоклавированием и использовать свежие на день эксперимента.
      3. Готовят 50% вес / об ПЭГ (полиэтиленгликоль) 3350; стерилизуют через фильтр с размером пор 0,2 мкм и хранят при комнатной температуре.
      4. Подготовьте 100 мМ Трис / 10 мМ ЭДТА (10x TE), отрегулироватьрН до 7,5, стерилизуют через фильтр с размером пор 0,2 мкм и хранят при комнатной температуре.
      5. Приготовьте 1 М ацетата лития (10x LiAc); доведения рН до 7,5 с помощью CH ₃ COOH, стерилизуют через фильтр и хранят 0,2 мкм при комнатной температуре.
   2. Возроди Y2H штамма (например, Y190) штриховой разводкой небольшое количество замороженного раствора в глицерине на YPD в пластине. Инкубируют при 30 ° С до тех пор, дрожжевые колонии не достигнет ~ 2 мм в диаметре (обычно 3 - 5 дней, в зависимости от штамма дрожжей).
   3. Привить 0,5 мл YPD (в 1,5 мл трубки) с одной большой (2 - 3 мм в диаметре) колонии. Vortex энергично в течение ~ 2 мин для разгона комков.
   4. Передача клеточной суспензии в 500 мл колбу, содержащую 50 мл YPD среды. Инкубируют при 30 ° С в течение 16 - 18 ч при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту для дрожжей для достижения стационарной фазы.
   5. Передача 4 - 5 мл ночной культуры в 200 мл YPD (в 1 л коническую колбу , а) для получения оптической плотности при 600 нм (OD _600, измереннаяс помощью спектрофотометра) 0,2 - 0,3 (200 мл будет достаточно для 20-преобразований).
   6. Инкубируют при 30 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту до тех пор , пока клетки не находятся в фазе середины логарифмического, т.е. OD ₆₀₀ = 0,5 - 0,6 ( как правило , 2 - 3 ч).
   7. Урожай дрожжей путем центрифугирования (в 50 мл пробирки) при 1500 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант, ресуспендируют каждый осадок в 5 мл стерильной H ₂ O и бассейн вместе.
   8. Повторная центрифуге при 1500 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант. Ресуспендируют дрожжевой осадок в 1 мл свежеприготовленного, стерильного 1x LiAc / TE.
      Примечание: Используйте компетентных клеток дрожжей в течение 1 часа подготовки.
   9. Готовят плазмидных образцы (в 1,5 мл пробирки), добавляя 200 нг плазмидной ДНК для отдельных преобразований, или на 0,5 - 1 мкг каждой плазмидной ДНК для совместных преобразований и 100 мкг семенников сельди ДНК-носитель (кипятят в течение 20 мин и охлаждают на лед непосредственно перед использованием).
      Примечание: Включите положительный контроль, например, дрожжи.совместно трансформировали pVA3 (кодирование для GAL4 ДНК-BD слияния с белком p53) и pTD1 (для кодирования GAL4 AD слияния с SV40 большого Т-антигена).
   10. Добавляют 100 мкл свежеприготовленного, компетентной дрожжевой суспензии (этап 1.1.8) и 600 мкл раствора 1x LiAc / PEG (8 мл запаса ПЭГ 3350, 1 мл исходного ТЕ, 1 мл исходного LiAc), а также для вихря ~ 30 сек. Инкубируют при 30 ° С в течение 30 мин при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту.
   11. Добавляют 80 мкл диметилсульфоксида (10% об / конечная концентрация v) и хорошо перемешать с помощью осторожного переворачивания. Тепловой удар в течение 15 мин в C водяной бане при 42 ° при перемешивании каждые 2 - 3 мин.
   12. Охладить клеточной суспензии на льду в течение 2 мин и центрифугируют при 14000 х г в течение 15 с при комнатной температуре для восстановления дрожжей.
   13. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 1х ТЕ и пластины на соответствующие минимальной средой SD-планшетах для селективного роста (среду, не содержащую лейцина и триптофана, чтобы сохранить селективное давление на обе приманки и целевых плазмид).
   14. Инкубируйте пластины вверх стороной вниз на 30° C, пока колонии не ~ 2 мм в диаметре (обычно 4 - 5 дней). Пластины можно хранить при температуре 4 ° С в течение 2 - 3 недель; для более длительного хранения сделать запасы глицерина и хранят при температуре -80 ° C.
       Примечание: Убедитесь , что приманку и целевые белки экспрессируются в дрожжах с помощью иммуноблоттинга ^17, и что у них нет активации гена - репортера , когда автономный отдельно экспрессией в дрожжах ( с помощью β-гал анализа , как это описано в разделе 1.3).
2. Колонии увеличения подъемной силы β-Gal фильтровальная бумага Анализ
   1. Подготовьте следующие буферы:
      1. Приготовьте Z буфера , содержащего 100 мМ Na ₂ HPO _4, 40 мМ NaH ₂ PO _4, 10 мМ KCl, 1 мМ MgSO _4; довести рН до 7,4. Стерилизовать автоклавированием и хранить при комнатной температуре.
      2. Готовят X-Gal буфер путем растворения 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида при концентрации 20 мг / мл в N, N-диметилформамиде и хранить в темноте при -20 ° C. Приготовьте Z буфера / X-Gal раствор. Сделать буферперед применением путем смешивания X-Gal при 0,33 мг / мл и бета-меркаптоэтанола на 0,27% об / об в Z буфере. С помощью 2,5 мл на образце.
   2. Добавить 2,5 мл свежеприготовленного раствора Z буфера / X-Gal в чистом 100 мм пластины и место внутри фильтра целлюлозной бумаги.
   3. Поместите новую фильтровальную бумагу по поверхности пластины с дрожжевые колонии, которые будут проанализированы. Аккуратно руб фильтровальную бумагу на тарелку с пинцетом и оставить на ~ 5 мин для колоний прикрепляются.
      Примечание: Процесс положительного контроля параллельно, то есть, дрожжи совместно преобразованное с pVA3 и pTD1..
   4. Поднимите фильтровальную бумагу и погрузить его (пинцетом) в бассейн жидкого азота в течение 30 сек (жидкий азот следует обращаться с осторожностью, всегда носить толстые перчатки и очки). Пусть замороженный фильтровальной бумаги оттепели при комнатной температуре в течение ~ 2 мин.
   5. Поместите фильтровальную бумагу (со стороны колонии вверх) на верхней части предварительно вымоченные фильтровальной бумаги внутри 100 мм пластины, и инкубировать при 30 ° С.
   6. периодически проверяйте(Каждые ~ 30 мин) для появления синих колоний. Дрожжи Y190 котрансформируют с положительными плазмид управления (pVA3 + pTD1) загорится синим цветом в течение 60 мин (неопубликованные наблюдения).
      Примечание: Слабая приманка: целевые взаимодействия может занять несколько часов, чтобы произвести положительный синий сигнал (во избежание длительной инкубации (> 8 ч), что может давать ложные положительные результаты). Для достижения наилучших результатов используйте свеже котрансформируют колоний, т.е. выращивали при 30 ° С в течение 4 - 5 . Дней, ~ 2 мм в диаметре.
3. Β-Gal культуральной жидкости Анализ
   1. Подготовьте следующие буферы:
      1. Приготовьте Z буфера , содержащего 100 мМ Na ₂ HPO _4, 40 мМ NaH ₂ PO _4, 10 мМ KCl, 1 мМ MgSO _4; довести рН до 7,4, стерилизуют автоклавированием и хранить при комнатной температуре.
         1 М Na ₂ CO _3; Хранить при комнатной температуре.
      2. Приготовьте Z буфера / бета-меркаптоэтанола. Сделать буфер перед использованием путем добавления -меркаптоэтанола на 0,27% V /v в Z буфере; используют 700 мкл на образце. Приготовьте Z буфер / раствор ONPG. Сделать буфер перед применением путем смешивания ONPG (о-нитрофенил-β-D-галактопиранозида) в дозе 4 мг / мл и бета-меркаптоэтанола на 0,27% об / об в Z буфере; используют 160 мкл на образце.
   2. Используйте одну колонию для инокуляции 5 мл минимальной среды SD (с недостатком лейцина и триптофана, чтобы сохранить селективное давление на обе приманки и целевых плазмид) и инкубируют при 30 ° С в течение 16 - 18 ч при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
      Примечание: Анализ пяти отдельных колоний совместно трансформировали с теми же приманку и целевых плазмид.
   3. Перенести достаточно ночной культуры в 10 мл свежей среды SD для получения OD ₆₀₀ = 0,2 - 0,3. Инкубируют при 30 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту до тех пор , пока клетки не находятся в фазе середины логарифмического (OD ₆₀₀ = 0,5 - 0,6).
   4. Перенести 0,5 мл культуры дрожжей в 1,5 мл пробирку и центрифугируют при 14000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Запишите точное OD ₆₀₀ при сборе СЕLLS. Ресуспендируют осадок в 100 мкл буфера Z; это приведет к фактору концентрации 5-кратного.
   5. Место трубки в жидком азоте в течение ~ 1 мин (жидкий азот следует обращаться с осторожностью, всегда носить толстые перчатки и очки), а затем на водяной бане 37 ° С в течение 3 мин до оттепели. Повторите эту замораживании-оттаивании цикл в два раза больше, чтобы обеспечить клетки взломана.
   6. Установите пустую трубку с 100 мкл буфера Z.
   7. Добавить 700 мкл буфера Z / бета-меркаптоэтанола и 160 мкл буфера Z / ONPG к образцу и пустых трубок; запустить таймер и место в 30 ° С инкубатор.
   8. Периодически проверяйте желтый цвет, чтобы развиваться. Добавить 400 мкл 1 М Na ₂ CO ₃ , чтобы остановить развитие цвета и записать прошедшее время в минутах. Дрожжи Y190 котрансформируют с положительными плазмид управления (pVA3 + pTD1) пожелтеют в течение 60 мин ..
      Примечание: Слабая приманка: целевые взаимодействия может занять несколько часов, чтобы получить положительный желтый сигнал для лучшего повторноготаты, используют свежеприготовленные котрансформированы колоний, т.е., выращивали при 30 ° С в течение 4 -. 5 дней, ~ 2 мм в диаметре.
   9. Центрифуга при 14000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы осадить клеточный дебрис и перенести надосадочную жидкость в чистую кювету.
   10. С помощью спектрофотометра, измеряют поглощение при 420 нм (А ₄₂₀₎ образцов относительно заготовки (значения должны быть между 0,02 - 1,0).
   11. Вычислить β-галактозидазы единиц, с 1 единица определяется как количество, которое гидролизует 1 мкмоль ONPG к о-нитрофенола и D-галактозы в минуту на ячейку, в соответствии со следующей формулой:
       = β-галактозидазы единиц
       Где: T: истекшее время инкубации (в минутах); . ср: коэффициент концентрации от стадии 1.4.8, т.е., ср = 5; OD _600: когда клетки собирали.

2. Экспрессия белка в линии клеток млекопитающих

1. Трансфекция клеток млекопитающих
   1. Подготовьте следующие носители и буферы:
      1. Готовят среду для роста путем смешивания DMEM с 4,5 г / л глюкозы, 10% об / об эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ L-глутамина; стерилизуют через фильтр и хранят 0,2 мкм при температуре 4 ° С.
      2. Готовят 2x Hepes-буферном физиологическом растворе (2x HBS) путем смешивания 280 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1,5 мМ Na ₂ HPO _4, 12 мМ глюкозы, 50 мМ Hepes; довести рН до 7,05, стерилизуют через фильтр и хранят 0,2 мкм при -20 ° C. Готовят 2,5 М CaCl _2. стерилизовать через фильтр и хранят 0,2 мкм при -20 ° C.
   2. За один день до трансфекции, начальное число 1 - 2 х 10 ⁶ клеток НЕК293 в 100 - мм чашки Петри с тем , чтобы быть на 60-70% сплошности на следующий день. Культура в течение 16 - 18 ч при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO _2.
   3. В день трансфекции, удалить старые средние и кормовые клетки с 10 мл свежей среды для роста.
      ЗАМЕТКА: Антибиотики опущены из культуральной среды во время трансфекции, потому что они могут увеличить клеточную гибель.
   4. Разбавляют 24 мкг плазмидной ДНК (для совмещенного трансфекциях, равном молярном соотношении двух плазмид) и 60 мкл 2,5 М CaCl ₂ в 600 мкл общего объема (из стерильной деионизованной H ₂ O) внутри 1,5 мл трубки; вихревая перемешать.
      Примечание:. Для достижения максимальной эффективности трансфекции, плазмидная ДНК должна быть высокой чистоты, то есть, имеют соотношение Абс ₂₆₀ / Abs ₂₈₀ = ~ 1.8.
   5. Добавляют раствор капель плазмидной ДНК / кальция мудрое в 50 мл пробирку, содержащую 600 мкл 2x HBS в то время как постоянно и энергично перемешивания встряхиванием. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить образование комплексов фосфата / плазмидной ДНК кальция.
   6. После 20 мин инкубации, вихря кратко и добавьте каплю раствора мудры на клетки, чтобы покрыть всю площадь поверхности 100 мм чашки Петри.
   7. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% CO _{2. После ~ 6 ч изменить среду для роста и поместить обратно в инкубатор.}
   8. Сбора клеток через 24 ч после трансфекции центрифугированием при 1000 х г в течение 3 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант. Клеточные гранулы можно хранить при температуре -80 ° C до тех пор, пока это необходимо.
      Примечание: Выражение обычно достигает пика 24 - 72 ч после трансфекции.
2. Cell Гомогенизация
   1. Подготовьте следующие буферы:
      1. Готовят буфер Со-IP гомогенизацию путем смешивания 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис; доведения рН до 7,4, и хранят при температуре 4 ° С.
      2. Подготовка Сшивка гомогенизацию буфера путем смешивания 5 мМ HEPES, 0,3 М сахарозы; доведения рН до 7,4, и хранят при температуре 4 ° С (фильтр перед использованием, чтобы удалить любые твердые частицы). Дополнение с ингибиторами протеазы перед использованием.
   2. Добавьте 250 мкл стеклянных шариков (425 - 600 мкм) в 1,5 мл пробирку и промывали 500 мкл буфера для гомогенизации. Пелле стеклянные бусы кратким центрифугированиемимпульса (1000 мкг в течение 5 секунд) и удалите супернатант. Повторите этот шаг для стирки еще раз.
   3. Ресуспендируют осадок клеток (от этапа 2.1.8) в 500 мкл охлажденного льдом буфера для гомогенизации и передачи клеточной суспензии в стеклянные шарики, содержащей трубки.
   4. Однородный клетки на льду на 20 проходов через тонкую иглу (23 г, 0,6 х 30 мм), присоединенные к 1 мл шприца. С колпачок трубки закрыт, прокалывают через него с иглой и дисперсных клеточную суспензию энергично через стеклянные шарики.
   5. Центрифуга при 1500 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С для удаления ядер и неразрушенных клеток и отбросить осадок. Сохраните супернатант, представляющий постядерной фракцию и перейти непосредственно к со-IP или сшивания в зависимости от обстоятельств.

3. В пробирке Методы Биохимические

1. Co-иммунопреципитации
   1. Подготовьте следующие буферы:
      1. Готовят буфер Co-IP гомогенизации, как описано в спрогиб 2.2.1.1. Подготовка IP-буфер путем смешивания 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,5% (вес / об) CHAPS, 2 мМ дитиотреитола (необязательно; дитиотреитола могут быть включены, чтобы уменьшить белковые агрегаты, которые могли образоваться из-за окисления воздуха); доведения рН до 7,4, и хранят при температуре 4 ° С.
      2. Приготовьте 2% вес / об CHAPS в буфере со-IP усреднений; Хранить при температуре 4 ° С.
      3. Подготовка белка-загрузочного буфера путем смешивания 60 мМ Трис, 2% вес / об SDS, 10% об / об глицерина, 5 мМ ЭДТА, 0,01% вес / об бромфеноловый синий, 2% об / об β-меркаптоэтанол (по желанию); доведения рН до 6,8 и хранить при комнатной температуре.
   2. Однородный клетки от сливающийся 100 мм чашки Петри (~ 8 × 10 ⁶ клеток , если HEK293, рассчитываемый с использованием гемоцитометра) , как описано в разделе 2.2.
   3. Солюбилизации постядерного субклеточном фракцию с 0,5% CHAPS (с использованием 2% акций) и инкубации в течение ≥2 ч при температуре 4 ° С при постоянном перемешивании. Центрифуга при 20000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С для осаждения нерастворимого материаАль и выбросите осадок. Сохраните супернатант называется клеточный лизат.
      Примечание: Включение моющего средства и удаления нерастворимого материала является абсолютно необходимым, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание. . Промежуточные синтетические моющие средства, например, CHAPS , или Тритон Х-100, при концентрации 0,2 - 1%, наиболее часто используемых.
   4. Приготовьте две отдельные 1,5 мл пробирки и добавляют ~ 20 мкл (в зависимости от связывающей способности IgG) 6 мг / мл протеин-А или белок G-агарозы (или сефарозы) бусинок. Промыть 200 мкл буфера IP.
      Примечание: Выберите соответствующий lg-связывающую смолу в зависимости от вида животных, используемых для повышения антител иммунопреципитации. Белок-G связывает более широкий диапазон Ig подтипы по сравнению с белком-A.
   5. Восстановление бусинки центрифугированием при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Повторите промывание еще раз буфером IP, а затем ресуспендирования бусин в 200 мкл буфера IP.
   6. Добавить 1 мкг (5 нг / мкл) иммунопреципитации антитела или неиммунного IgG (кслужат в качестве отрицательного контроля) в / G пробирки, содержащие два отдельных Протеин-A. Выдержите в течение ≥2 часов при температуре 4 ° С при постоянном перемешивании.
      Примечание: Всегда обрабатывать отрицательный контроль с использованием неиммунного IgG вырос в одних и тех же видов животных, как иммунопреципитации антитело.
   7. Восстановление бусинки центрифугированием при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С и тщательно отбросить супернатант с помощью пипетки.
   8. Перенести 200 мкл клеточного лизата (со стадии 3.1.3) в каждую из двух трубок с антителом и белком-A / G бусин. Выдержите в течение ≥2 часов при температуре 4 ° С при постоянном перемешивании, чтобы обеспечить связывание антиген-антитело.
   9. Восстановление бусинки и промывают 200 мкл буфера IP; инкубировать в течение 10 мин при 4 ° С при перемешивании. Восстановление бусинки и мыть два раза больше (избежать многократных промывок, которые уменьшат как конкретный и неспецифического связывания). Осторожно удалите супернатант с помощью пипетки.
   10. Добавьте 30 мкл белка-загрузочного буфера для элюции immunoprecipitованные белки. Центрифуга при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С, отбросить бусинки и сохранить супернатант, содержащий элюированный образец со-IP.
   11. Для проверки успешного осаждения белка X, загрузите небольшое количество ^(1/10, 3 мкл) образца со-IP на геле SDS-PAGE анализируемый с помощью иммуноблоттинга ¹⁷ с антителом , специфическим для белка X. Включите Аликвоту клеточный лизат, чтобы проверить экспрессию белка X в вашем образце.
   12. Для того, чтобы проверить на наличие соосажденное белка Y, загрузить остальные (9/10 - ^й, 27 мкл) образца со-IP на отдельном геле SDS-PAGE для анализа с помощью иммуноблоттинга ¹⁷ с антителом , специфическим для белка Y. Включите аликвоты клеточного лизата для проверки экспрессии белка Y в вашем образце.
2. Химическое сшивание
   1. Подготовьте следующие буферы:
      1. Сшивка гомогенизацию буфер, как описано в разделе 2.2.1.1.
      2. Приготовьте 5x рrotein-загрузочного буфера путем смешивания 300 мМ Трис, 10% вес / объем SDS, 50% об / об глицерина, 25 мМ ЭДТА, 0,05% вес / об бромфеноловый синий, 10% об / об β-меркаптоэтанол (по желанию); доведения рН до 6,8 и хранить при комнатной температуре; тепло при 50 ° С перед использованием.
   2. Однородный клетки от сливающийся 100 мм чашки Петри (~ 8 × 10 ⁶ клеток , если HEK293, рассчитываемый с использованием гемоцитометра) , как описано в разделе 2.2.
      Примечание: Сахароза (в 0,3М) используется для создания ISO-осмотическое буфер. Соль, например, 120 - 150 мМ NaCl или KCl , могут быть использованы вместо того, чтобы , в зависимости от олигомерных белкового комплекса , представляющего интерес.
   3. Центрифуга постядерного субклеточные фракции при 20000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для осаждения белковых агрегатов и сохранить супернатант. Возьмем восемь аликвоты по 20 мкл каждого из них (как правило ~ 20 мкг белка) в отдельные 0,5 мл пробирки.
   4. Добавить 0,0025% v / v глутаральдегид для всех образцов и запустить таймер. Пусть каждый из восьми образцов реагируют с glutaraldehyde при комнатной температуре: 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 мин.
      Примечание: глутаровый альдегид имеет две альдегидные группы, которые вступают в реакцию со свободными аминами. Избегайте использования буферов рН или другие вещества с первичными аминогруппами, потому что они будут погасить реакцию глутаральдегида.
   5. Остановка реакции глутарового альдегида в указанное время с 2% об / об гидразина и добавить 5 мкл 5х белок-загрузочного буфера для денатурации белков.
   6. Переходим к SDS-PAGE и иммуноблоттинга ^17.

Результаты

В системе Y2H, приманка: жертва взаимодействия первоначально испытания путем селекции дрожжей роста в среде , не содержащей (триптофан, лейцин и гистидин) , а затем оценивали с помощью β-Gal анализов ферментативной активности (рисунок 1). Дрожжи культивировали в среде, не содержащей гистидина имеет медленный темп роста, который зависит от силы приманки: взаимодействие белка добычи. Анализ β-гал проводят в дрожжах (культивируют в среде, не содержащей только триптофан и лейцин) либо растет на твердой подложке (агаром) или в жидкой культуральной среде, с последним урожайных количественных результатов. Мы успешно использовали Y2H для идентификации взаимодействий домена на домен в RyR2, а также новых партнеров белка ^{2-4,12,21,22.} Например, мы провели скрининг серии перекрывающихся конструкций, охватывающих всю длину пептидной последовательности RyR2 для взаимодействия с N-концевого фрагмента (AD4L: RyR2 остатков 1 - 906 слит с GAL4 AD). ³ Colony Подтяжка фильтровальной бумаги β-Gal анализы производятся яркие голубые цвета колоний дрожжей только для BT4L: AD4L пара (рис 2A), показывая , что AD4L взаимодействует с самим собой, а именно BT4L построить (RyR2 остатков 1 - 906 , слитый с GAL4 ДНК-BD). Светло-голубые колонии были обнаружены на BT8: AD4L пара предполагая вторичную слабую связь с крайней С-концевого домена (BT8), в то время как дрожжи котрансформированы с какой-либо другой конструкции, остается белым и, следовательно, негативно для приманки: взаимодействие белка добычи. Количественные результаты, полученные с помощью жидких β-гал анализа (Фигура 2В), показали надежную BT4L: AD4L эквивалентное взаимодействие по силе известной ассоциации между белком р53 (pVA3) и SV40 большой Т - антиген (pTD1), в то время как BT8: взаимодействие AD4L была значительно слабее (<10% по сравнению с контролем).

Мы регулярно проводят совместно IP эксперименты (рисунок 3) пollowing временной экспрессии в клеточной линии млекопитающих (HEK293), в качестве независимого биохимического анализа для усиления Y2H выводы ^{2-4,12-14,21-24.} Для проверки RyR2 N-концевой самовоздействия, два отдельных плазмид, кодирующих RyR2 остатков 1 - 906 помечается либо CMYC или HA пептидный эпитоп (BT4L и AD4L, соответственно), котрансфицируют в клетках HEK293 с использованием метода осаждения фосфата кальция ^3. Постъядерном фракция гомогенизированных клеток солюбилизируют с моющим средством CHAPS, и нерастворимое вещество удаляли центрифугированием с получением клеточного лизата. Клеточный лизат, обрабатывают восстанавливающим агентом дитиотреитола, затем инкубировали с Ab ^HA и протеин-А сефарозы для иммунопреципитации HA-меченый AD4L. Co-IP образцы, элюированные с SDS-содержащий буфер, были загружены на два отдельных SDS-PAGE гелей (1/10 ^м и 9/10 ^й сплит) и анализировали с помощью иммуноблоттинга с Ab ^HA и Ab ^CMYC, гespectively. Успешный прямой IP из AD4L (~ 100 кДа) с помощью Ab ^HA была проверена с помощью иммуноблоттинга, но не в отрицательном контроле с использованием Неимунные кролика IgG (рис 4A). Важно отметить, что CMYC-меченый BT4L (~ 100 кДа) извлекали только в Ab ^HA IP, а не в отрицательном контроле при отсутствии иммуноосажденного AD4L (фиг.4В).

Анализы Y2H и со-IP при условии последовательного доказательства RyR2 N-концевой самовзаимодействия, но они не сообщали о состоянии олигомеризации N-концевого домена, а именно образует ли он только димеры или высшие комплексы. Следует отметить, что комплексы будут диссоциировать и только включающий субъединицы будут обнаружены с помощью SDS-PAGE из-за тепла и SDS-индуцированной денатурации белка отменяя белок-белковых взаимодействий. Чтобы преодолеть это, мы используем сшивку (рисунок 5) , что химически и стабильно соединяется с уже существующей PROTEIN олигомеры, у которых молекулярная масса затем может быть исследована с помощью SDS-PAGE разделения размером ^2-5. Например, НЕК293 клеточный гомогенат экспрессирующих CMYC-BT4L, обрабатывают восстанавливающим агентом дитиотреитола, подвергали взаимодействию с глутаровый альдегид и анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга с использованием Ab ^CMYC (рисунок 6). В дополнение к мономеру (~ 100 кДа), с высокой молекулярной массой белковой полосы ~ 400 кДа была обнаружена во временной зависимым образом, что указывает на RyR2 N-конце образование тетрамера ^3. Примечательно, что тетрамер был преобладающим олигомерные видов, с минимальным димера и тримера полос, наблюдаемых. Для того, чтобы определить его молекулярную массу, олигомер BT4L отделяли через 4 - 15% градиентном ДСН-ПААГ геле ^3. Мы произвели массу / гель стандартной заторможенность кривой молекулярно с использованием стандартов белков с диапазоном 30 - 460 кДа, и мы рассчитали олигомер быть 358 кД 15 (п = 4). Эта кажущаяся молекулярная масса соответствует тетрамера BT4L, расположенными взамкнутой круговой моды, а не в линейной форме, как и следовало ожидать от расположения четырех субъединиц в нативной канала RyR2.

Рисунок 1. Y2H Flowchart. Дрожжи, котрансформируют с приманкой и целевых плазмид, выбран для роста в среде , не содержащей гистидина и / или анализировали на β-Gal ферментативной активности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Y2H Предлагает RyR2 N-концевого домена самовзаимодействия. (А) Схематическое изображением (приманка) серии RyR2 фрагментов перекрывающихся белков человека , испытанных в системе Y2H для взаимодействие с конструкцией RyR2 N-концевого AD4L (добыча). Качественные результаты , полученные колонией Подтяжка фильтровальную бумагу β-Gal анализов указаны в "+" кратные или "-" для отрицательного взаимодействия (B) Количественный жидкие β-Gal анализы , нормированные против положительного контроля (pVA3 кодирует GAL4 ДНК-BD. слитый с белком р53, pTD1 кодирует GAL4 AD слияния с SV40 большого Т-антигена). Измененный ^3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Со-IP - блок - схем. Клетки млекопитающих, котрансфицируемым плазмосодержащие Х и У, гомогенизируют и моюще-солюбилизировали для получения клеточного лизата , используемый в анализе с совместным IP, а затем SDS-PAGE и иммуноблоттинга.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Co-IP Указывает RyR2 N-конец домена самовзаимодействия в клетках млекопитающих. НЕК293 клетки котрансфицируют для переходных коэкспрессией CMYC-меченого (BT4L) и HA-помеченной области (AD4L) RyR2 N-концевой ( остатки 1 - 906). AD4L был иммунопреципитации с Ab ^HA из CHAPS-солюбилизированных и дитиотреитола обработанных HEK293 лизата, в то время , как отрицательные контрольные анализы, совместно IP были проведены с неиммунного кроличьего IgG. Иммунопреципитированные белки нагревали при 85 ° С в течение 5 мин и разрешен при 20 мА в течение 3 ч через отдельные 6% SDS-PAGE гелей , нагруженных ^1/10 или 9/10 ^го образцов IP. После переноса белка при 80 V в течение 2 часов на polyvinylidene дифторида мембрана, иммуноблоттинга анализ проводили с использованием (1: 1000 разведение) Ab ^HA (А) или Ab ^CMYC (В), соответственно, с последующим конъюгированного с пероксидазой хрена анти-мышиного IgG (1: 10000 разбавления) и усовершенствованные функции обнаружения хемилюминесценции (1 мин экспозиции). Аликвоту клеточного лизата, 1/50 ^го объема обработанного в образцах IP, также был включен , чтобы служить в качестве стандарта молекулярной массы. Измененный ^3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Сшивка блок - схемы. Клетки млекопитающих, трансфицированные плазмидой X, гомогенизируют и подвергают реакции с глутаровым альдегидом в сшивающего анализа с последующим SDS-PAGE и иммуноблоттинга. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6. Сшивание Указывает RyR2 N-концевой домен тетрамер Formation НЕК293 трансфицировали для временной экспрессии CMYC-меченый домена (BT4L) RyR2 N-концевой (остатки 1 - 906).. Клеточный гомогенат, обрабатывают восстанавливающим агентом дитиотреитола, инкубировали с глутаральдегида в течение указанных временных точках. Образцы нагревали при 85 ° С в течение 5 мин и решена с помощью SDS-PAGE (6% ПААГ) при 20 мА в течение 3 часов. После переноса белков при 80 В в течение 2 ч на поливинилидендифторидную мембрану, иммуноблоттинга анализ проводили с использованием (1: 1000 разведение) Ab ^CMYC, затем конъюгированного с пероксидазой хрена анти-мышь IgG (1:10000 разведение) и расширение обнаружения хемилюминесценции (1 мин экспозиции). Мономерный (М: ~ 100 кДа) и тетрамерная (Т) формы обозначены стрелками. Измененный ^3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Образование белковых гомо-олигомеров является фундаментальным биологическим процессом , который регулирует активность факторов транскрипции, ферментов, ионных каналов и рецепторов ^25,26. Важно отметить, что белок имеет олигомеризации также патологические последствия , включая нейродегенеративные и аритмогенному болезни сердца ^4,27. Методики, описанные в этой статье, используются для идентификации домена домена взаимодействия, опосредующие белка самоассоциация и олигомеризации. Ниже мы указываем на критические шаги в рамках каждого протокола, и мы обсудим важные соображения, ограничения и устранения неполадок.

Система Y2H может быть использована в первую очередь для скрининга потенциальных партнеров, взаимодействующих белков из-за его относительно высокой скрининга, простота использования и высокой воспроизводимости результатов. Y2H процедуры проводятся в микробиологической лаборатории со стандартной (пластины или шейкере) инкубаторы и помещение удерживающих сооружений. Использование фрeshly подготовленные компетентные клетки (этап 1.1.8) имеет решающее значение для высокой эффективности трансформации дрожжей, в то время как для достижения наилучших результатов в β-Gal анализов, свежевыращенных колоний дрожжей (до 5 дней) следует использовать (этап 1.2.3). Системы, основанные на других, чем GAL4 и / или дополнительных / альтернативных репортерных генов факторов транскрипции доступны, и, следовательно, приманки и добычей плазмид должны быть согласованы с соответствующим напряжением Y2H.

Некоторые штаммы должны быть выращены в присутствии 3-амино-1,2,4-триазола, конкурентный ингибитор белка HIS3, для того , чтобы тушить любые конститутивной экспрессии гена - репортера ^7,8 HIS3. Экспрессия приманки и целевых белков слияния должны быть проверены с помощью иммуноблоттинга ^17. В случае приманки / копытных слитые белки токсичны для дрожжей, ниже допустимых уровней белка может быть достигнуто путем клонирования в различных векторах, где / добыча выражение приманки движет другим промотором. Кроме того, необходимо обеспечить тшляпа слитые приманка / добыча белки не проявляют автономного гена-репортера активности. Автономный репортер активации гена можно спасти путем изменения конструкции, чтобы удалить ответственную область, или путем замены на GAL4 ДНК-BD и слитые AD для двух протестированных белков. Кроме того, трансмембранные домены лучше исключить из приманки / копытных конструкций, поскольку они могут вызвать или неправильного фолдинга mislocalization слитых белков в внутриклеточных мембранных отсеков. Действительно, основным недостатком системы Y2H является то , что приманки и белки - мишени локализованы в ядре дрожжей от их физиологической внутриклеточной локализации и потенциально отсутствуют специфические посттрансляционные модификации, что приводит к ложно-положительных или ложно-отрицательных взаимодействий ^6-9 ,

Млекопитающие гетерологичные системы экспрессии лучше подходят для изучения млекопитающих интегральных мембранных белков с точки зрения конформации, пост-трансляционных модификаций и внутриклеточной локализации.Одним из наиболее широко используемых методов трансфекции клеток является осаждение фосфата кальция, главным образом , из - за минимального оборудования и реагенты ^11,15. Альтернативные методы, а именно электропорации, липосом, катионные липиды и полимеры, могут давать более высокую эффективность трансфекции в зависимости от клеточной линии и используются в качестве конструкции. В целом, основные факторы, влияющие на эффективность трансфекции являются плазмида качества ДНК и клеточного здоровья / жизнеспособности. Наилучшие результаты достигаются, когда плазмидной ДНК высокой чистоты (260 нм / 280 нм, отношение оптической плотности ~ 1,8), а также активно делящиеся клетки используются. Поэтому клетки должны быть трансфицированы на уровне не более 60 - 70% слияния (этап 2.1.2), так как способность поглощать чужеродную ДНК связана с площадью поверхности клетки , контактирующие с измеряемой среды ^11. Кроме того, включение антибиотиков в культуральной среде в течение трансфекции (этап 2.1.3) не рекомендуется из - за повышенной клеточной гибели ^15.

Fили осаждение фосфата кальция, в частности, тщательной подготовки и регулирования рН (7,05 точно) раствора 2x HBS (этап 2.1.1), и собственно образование плазмидной ДНК / кальций / фосфорные комплексы путем интенсивного перемешивания (этап 2.1.5) являются критические шаги для высокой эффективности. трансфекцией Как правило, экспрессия белка с помощью переходных пиков трансфекции в течение 24 - 72 ч.

После того, как клетки собирают, последующие процедуры должны проводиться при температуре 4 ° С, чтобы минимизировать активность протеаз, и рекомендуется добавление ингибиторов протеазы. Сотовый гомогенизацию следует следовать стадия центрифугирования для удаления ядер, потому что хромосомная ДНК может увеличивать вязкость раствора и повышения неспецифического связывания. Таким образом, гомогенизация с помощью механических средств в качестве изо-осмотического буфер является предпочтительным, как правило, в (0,3 М), сахароза или (150 мМ NaCl). В общем случае, буферы на основе сахарозы, как известно, для повышения стабильности белка и уменьшить потенциальную агрегацию неродного белка, но из-за рссылочной гидратация на поверхности белка, электростатические белок-белковые взаимодействия являются предпочтительными. С другой стороны , на основе соли буферы влияют на суммарный заряд заряженных аминокислотных боковых групп на поверхности белка, таким образом , имеющей уклон в сторону более гидрофобных взаимодействий на основе ^28.

Co-IP является наиболее часто используют биохимический анализ для оценки белок-белковых взаимодействий, особенно из нативной ткани. Его главный недостаток является требование высоко специфических антител утвержденных для использования в IP и иммуноблоттинга ^10,16,18. Таким образом, рекомбинантные белки часто помечены с пептидным эпитопом, например., Гемагглютинина гриппа (YPYDVPDYA) или CMYC человек (EQKLISEEDL), для которой имеют высокое сродство специфические антитела , являются коммерчески доступными. При желании, иммунопреципитации антитело может быть химически конъюгирован на протеин-А смолой, чтобы избежать его вымывание и обнаружение во время стадии иммуноблоттинга, которые могут затенить соосажденное прotein ^16; для достижения этой цели, мы успешно использовали химический сшивающий агент 3,3'-дитиобис (sulfosuccinimidylpropionate) ^24. Крайне необходимо, чтобы соответствующее моющее средство входит в буфер IP и нерастворимый материал гомогенизированных клеток удаляют центрифугированием, чтобы свести к минимуму неспецифического связывания (этап 3.1.3). Выбор и концентрация моющего средства имеют большое значение: сильные моющие средства и / или более высокие концентрации, может значительно снизить неспецифическое связывание, но также может отменить X: взаимодействие белка Y, тогда как более низкие концентрации или более мягких моющих средств могут позволить слабое взаимодействие, чтобы наблюдать, но может приводят к большому объему неспецифического связывания. Промежуточные моющие средства прочности являются предпочтительными, например, Тритон Х-100 в 0,5 -. 1% концентрации. Для дальнейшего снижения неспецифического связывания, нейтральный белок (например, альбумин бычьей сыворотки в 100 мкг / мл) могут быть включены в буфер IP, и / или клеточный лизат может быть предварительно Cleareг с предварительной инкубации с использованием только Белково-смола. Число промывок должны быть оптимизированы для X: Y пары испытания, как правило, три 10-минутных промывок IP-буфера (этап 3.1.9). В любом случае, образец совместно с IP-неиммунного IgG в качестве иммунопреципитации антителами всегда должны быть обработаны параллельно, чтобы служить в качестве отрицательного контроля (этап 3.1.6).

Основным преимуществом химического сшивания является то, что он сообщает о стехиометрическом составе белка гомо-олигомер. Глютаральдегид является широко используемым кросс-линкер , так как он не требует специального оборудования и генерирует термически и химически устойчивые поперечные связи между взаимодействующими белками ^19,20. Соединения со свободными аминогруппами, должны быть исключены из анализа буферов (этап 3.2.1), так как они будут тушат химической реакции. Концентрация глутаровый альдегид и время реакции (этап 3.2.4) должен быть оптимизирован для олигомерных белкового комплекса, представляющего интерес. Главный недостаток этого метода, especiсоюзником, когда выполняется на препаратах целых клеток, является неспецифичность химической реакции, которая может принести искусственных белковых агрегатов, которые не имеют биологическое значение.

Альтернатива в естественных условиях (например., Флуоресцентная передача энергии резонанса, би молекулярной флуоресценции или люминесценции комплементационная) и в методах лабораторных условиях (например., Вытеснительной хроматографии, аналитической ультрацентрифугирования, изотермический титрование калориметрии) доступны для определения характеристик белков самоассоциацией и оценки олигомеризации стехиометрии ^29,30. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, и это может быть более подходящим для изучения специфического белка в зависимости от белка очистки / стабильности и доступности оборудования / реагентов. Эти три взаимодополняющие методы, описанные здесь подробно, а именно Y2H, совместно IP и сшиванию, были использованы в комбинации для обеспечения убедительных доказательств для RyR2 гомо-oligomeобразование г в изоляции и внутри живой клетки.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PART 1 yeast two-hybrid
Plate incubator	Hereaus	B6120	Used at 30 °C
Orbital shaker incubator	New Brunswick Scientific	INNOVA 4300	Used at 30 °C with shaking at 230 - 250 rpm
Spectrophotometer	Perkin Elmer	Lambda Bio+	To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay
Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit	Takara Clontech	K1604-1	Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2  and yeast strain Y190
Yeast Nitrogen Base	Sigma-Aldrich	Y0626	To prepare minimal SD growh medium
Dropout supplement lacking leucine and tryptophan	Sigma-Aldrich	Y0750	To prepare minimal SD growh medium
Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine	Sigma-Aldrich	Y2001	To prepare minimal SD growh medium
Herring testes carrier DNA	Takara Clontech	630440	For yeast transformation
Whatman filter paper Grade 5	Sigma-Aldrich	WHA1005070	for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)	Sigma-Aldrich	B4252	for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)	Sigma-Aldrich	N1127	for use in liquid b-Gal assay
PART 2. Protein expression in a mammalian cell line
HEK293 cell line	ATCC	ATCC® CRL-1573™
Humidified incubator (5% CO2, 37 °C)	SANYO	MCO-18AIC	To culture mammalian cells
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium)	Invitrogen (ThermoFisher)	41966	To prepare growth medium for mammalian cells
Fetal Bovine Serum	Invitrogen (ThermoFisher)	10500	To prepare growth medium for mammalian cells
Glass beads	Sigma-Aldrich	G8772	To homogenise cells
Needle 23 G (0.6 x 30 mm)	BD Microlance	300700	To homogenise cells
Protease inhibitor cocktail (Complete)	Roche	11873508001	To prevent proteolysis
PART 3. In vitro biochemical methods
Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system)	Bio-Rad	1658000EDU	For polyacrylamide gel electrophoresis
Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)	Bio-Rad	1703940	For electrophoretic transfer
Compact X-ray film processor	Xograph	X4	For use in immunoblotting
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882	For use in chemical cross-linking
Protein-A sepharose beads	GE Healthcare Life Sciences	17-5280-01	For use in co-IP assay
Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG)	Santa Cruz Biotechnology	sc-805	For use in co-IP assay
Non-immune rabbit IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2027	For use in co-IP assay
Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG)	Santa Cruz Biotechnology	sc-40	For use in immunoblotting
Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG)	Covance	MMS-101P	For use in immunoblotting
Anti-mouse IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	For use in immunoblotting
Hyperfilm ECL	GE Healthcare Life Sciences	28906836	For use in immunoblotting
ECL Western Blotting Substrate	Pierce (ThermoFisher)	32106	For use in immunoblotting