Fabricação de calibre pequeno endopróteses Usando Electrospinning e balão expansíveis Bare Metal Stents

Resumo

In the protocol, we present a method to manufacture a small caliber stent-graft by sandwiching a balloon expandable stent between two electrospun nanofibrous polyurethane layers.

Resumo

Stent-grafts are widely used for the treatment of various conditions such as aortic lesions, aneurysms, emboli due to coronary intervention procedures and perforations in vasculature. Such stent-grafts are manufactured by covering a stent with a polymer membrane. An ideal stent-graft should have a biocompatible stent covered by a porous, thromboresistant, and biocompatible polymer membrane which mimics the extracellular matrix thereby promoting injury site healing. The goal of this protocol is to manufacture a small caliber stent-graft by encapsulating a balloon expandable stent within two layers of electrospun polyurethane nanofibers. Electrospinning of polyurethane has been shown to assist in healing by mimicking native extracellular matrix, thereby promoting endothelialization. Electrospinning polyurethane nanofibers on a slowly rotating mandrel enabled us to precisely control the thickness of the nanofibrous membrane, which is essential to achieve a small caliber balloon expandable stent-graft. Mechanical validation by crimping and expansion of the stent-graft has shown that the nanofibrous polyurethane membrane is sufficiently flexible to crimp and expand while staying patent without showing any signs of tearing or delamination. Furthermore, stent-grafts fabricated using the methods described here are capable of being implanted using a coronary intervention procedure using standard size guide catheters.

Introdução

procedimentos de intervenção coronária causar lesões da parede do vaso significativa devido ao rompimento da parede da placa e navio. Isso resulta em restenose, embolia periférica em enxertos de veias, e descontinuidade de lúmen coronárias ^1-4. Para evitar estas complicações, uma estratégia promissora será para cobrir a superfície vascular no local da angioplastia, o que potencialmente inibir a restenose, reduzir os riscos de descontinuidade do lúmen do vaso, e evitar embolia periférica. Estudos anteriores compararam stents metálicos para endopróteses com resultados positivos para endopróteses ^5. Os pesquisadores utilizaram vários materiais para a fabricação de membranas para cobrir os stents. Isto inclui materiais sintéticos como tetraphthalate de polietileno (PET), politetrafluoroetileno (PTFE), poliuretano (PU), e silício ou tecido de vaso autólogo para a fabricação de próteses cobertas ^6-9. Um material de enxerto ideal utilizada para cobrir a prótese endovascular deve ser tromboresistente, não biodegradable, e deve integrar-se com o tecido nativo sem proliferação excessiva e inflamação ^10. O material de enxerto utilizada para cobrir a prótese endovascular também deve promover a cura do enxerto de stent.

Endopróteses são amplamente utilizados para o tratamento da CoAo, pseudo-aneurismas da artéria carótida, fístulas arteriovenosas, degenerou enxertos venosos, e grande para aneurismas cerebrais gigantes. Mas o desenvolvimento de calibre pequeno extensor-enxertos é limitada pela capacidade de manter baixo perfil e flexibilidade, o que ajuda na implementação dos stent-enxertos ^11-14. PU é um polímero elastomérico com boa resistência mecânica, que é uma característica desejada para alcançar um perfil baixo e uma boa flexibilidade ^15,16. Além de ter boa capacidade de entrega, endopróteses deve também promover a cura rápida e endotelização. PU coberto stent-enxertos demonstraram melhor biocompatibilidade e Endotelização ¹⁷ reforçada. Os investigadores têmanteriormente tentou endothelialize PU coberto endopróteses semeando-los com células endoteliais ^17. Eletrofiação de PU para criar matriz de nanofibras foi demonstrado ser uma técnica valiosa para a produção de enxertos vasculares ^18,19. A existência de nanofibras que imitam a arquitectura de matriz extracelular nativa é também conhecido para promover a proliferação de células endoteliais ^20,21. Eletrofiação também permite o controlo sobre a espessura do material ^22. enxertos vasculares de pequeno diâmetro feito de PU têm sido estudados para promover a cura, utilizando modificações, tais como revestimentos de superfície, anti-coagulantes, e inibidores de proliferação de células. Todas essas modificações são projetados para mediar a aceitação de acolhimento e promover a cura do enxerto ^23.

O nosso grupo tem desenvolvido uma expansível nu metal stent balão, que pode ser implantado em modelos animais ^24-26. A combinação de uma malha electrospun poliuretano e uma esferaoon stent expansível nos permitiu gerar pequeno balão calibre expansíveis endopróteses. A maioria das endopróteses disponíveis actualmente são introduzidos através da artéria femoral durante um procedimento intervencional, mas apenas alguns comerciais stents revestidos pode ser introduzido um tamanho French maior do que a requerida para um balão insuflado ^27-un. Neste estudo, desenvolvemos um pequeno calibre vascular endoprótese através do encapsulamento de um stent balão expansível entre duas camadas de electrospun PU que podem ser entregues a uma artéria coronária usando um 8-9 cateter guia francês padrão em um procedimento intervencionista percutâneo.

Protocolo

1. Electrospinning de poliuretano no Mandril Collector

1. Prepare mandril para electrospinning
   1. Derreter aproximadamente 8 ml de biocompatível, de grau alimentar, material de suporte solúvel em água num cilindro graduado (aproximadamente 9 mm de diâmetro e 110 mm de profundidade) a 155 ° C utilizando um forno.
   2. Mergulhar um mandril 100 milímetros de comprimento em aço inoxidável de diâmetro 3 mm e para se obter um revestimento de material de suporte sobre a superfície do mandril. Antes da imersão, coloca os mandris no forno a 155 ° C durante aproximadamente 15 min para aumentar a temperatura da superfície do mandril, o que ajuda a molhar a superfície com o material de suporte fundida.
   3. Deixe o mandril mergulhados arrefecer até aproximadamente 140 ° C enquanto o material de suporte fundido solidifica formando um revestimento fino uniforme sobre a superfície do mandril. Durante o processo de resfriamento, pendurar o mandril verticalmente, de modo que a gravidade faz com que o excesso de material de apoio para escorrer. Este revestimento permite a fácila remoção do stent-enxerto acabado a partir do mandril.
2. Configuração do colector mandril do sistema de electrospinning (como mostrado na Figura 1)
   1. Alinhar o misturador laboratorial horizontal e ligar uma haste de plástico que irá realizar o mandril de aço inoxidável na extremidade oposta no interior do exaustor de fumos.
   2. Dissolve-se o material de suporte a partir da ponta do mandril, submergindo apenas a ponta do mandril em água para acomodar a haste do suporte de plástico na extremidade do mandril. Apoiar a haste de suporte de plástico na extremidade livre do mandril para auxiliar na rotação uniforme do colector mandril.
   3. Use parafusos de ajuste nas hastes de suporte de plástico para proteger o mandril de aço inoxidável e não escorregar durante eletrofiação.
   4. Aterrar o coletor de mandril, anexando um fio terra em forma de U para o mandril de aço inoxidável. Use de borracha O-rings para segurar o fio de terra para os lados do mandril.
3. Setting-se sistema de extrusão de poliuretano líquido do sistema de electrospinning
   1. Misture dimetilacetamida (DMA) com 25% (m / v) solução de poliuretano (PU) da para se obter 15% (m / v) de PU em DMA solução (por exemplo, adiciona-se 6 ml de DMA a solução PU 9 ml de 25%).
      CUIDADO! Trabalhar dentro de um exaustor com equipamento de protecção individual adequado.
   2. Encha uma seringa de vidro de 5 ml com fim brusco agulha de aço inoxidável (fieira) com uma solução de PU 15%.
   3. Programar a bomba de seringa para extrudir a 0,01 ml / min, com base no diâmetro interno da seringa.
   4. Montar a seringa com fieira na bomba de seringa horizontalmente, com a ponta da agulha aproximadamente 20 cm do colector mandril. Isolar a seringa a partir das partes condutoras da bomba de seringa utilizando folhas de borracha para evitar a formação de arco eléctrico.
   5. Ligue o gerador de alta tensão para a fieira da seringa usando uma pinça.
4. Fazer funcionar a bomba de seringa a 0,01 ml / min e Rotate o mandril com o misturador de laboratório rodando em baixa velocidade (por exemplo, 50 rpm).
5. Aplicar um diferencial de voltagem de 20 kV entre a fieira e o mandril colector. nanofibras PU irá começar a depositar sobre o mandril rotativo e uma camada fina será visível em poucos minutos. Garantir a coifa está desligada e de escape é fechada para evitar a perda de nanofibras electrospun.

2. Electrospinning uma endoprótese

1. nanofibras Electrospin PU sobre um mandril rotativo durante 2 horas para criar um tubo uniforme (tal como explicado no passo 1).
2. Remover o mandril a partir da haste de plástico que está ligado ao misturador de laboratório para instalar o stent metálico. Ligue o exaustor de fumos e gases de escape aberta antes de remover o mandril para assegurar que remanescente vapores de solventes são removidos.
3. Deslize o stent balão expansível ²⁶ de aço inoxidável para o tubo electrospun para um local desejado. Pode ser necessário para expandir ligeiramente a prótese endovascular de modo que Slips sem danificar o tubo electrospun.
4. Crimp o stent para se certificar de que o stent está firmemente fixado no material do tubo sobre o mandril e não solto o suficiente para deslizar. Isto também vai ajudar a evitar a delaminação das camadas interior e exterior.
5. Carregar o mandril com o tubo e stent novamente sobre a haste de plástico misturador de laboratório durante electrospinning a camada exterior do stent-enxerto.
6. nanofibras Electrospin durante 3 horas, tal como explicado no passo 1 para fabricar a camada externa do stent-enxerto.
7. Depois de electrospinning o exterior posterior, de modo circunferencial cortar o material PU cerca de 1 mm em relação às extremidades da prótese endovascular utilizando um bisturi.
8. Embeber o mandril com o stent-enxerto em água desionizada para dissolver o material de suporte do mandril que irá libertar o stent-enxerto do mandril. Substituir com água fresca, conforme necessário para dissolver completamente o material de suporte.
9. Uma vez que o material de suporte é dissolvido, remover suavemente a endoprótese de tele mandril e deixar secar. Considere embeber a endoprótese removido em água deionizada para dissolver qualquer material de apoio permaneçam antes de permitir ao ar seco.

3. Os testes de endopróteses Industrializados

1. Deslize a endoprótese em um balão de três dobras 3 mm.
2. Crimp da endoprótese no balão usando uma mão ferramenta de compressão.
3. Inspecione a endoprótese frisado usando um microscópio para cravar uniforme e quaisquer outros sinais de insuficiência como delaminação ou punção do material de cobertura devido à deformação stent.
4. Expanda a endoprótese ao diâmetro projetado de 3 mm através da pressurização do balão com três dobras com um dispositivo de inflação e água. Mais uma vez, examinar a endoprótese expandida para a expansão uniforme e sinais de falência.

Resultados

A nossa configuração ElectroSpinner (Figura 1) resultou em nanofibras de poliuretano de alta qualidade (Figura 2). Um stent-enxerto é fabricado por electrospinning uma camada interna de poliuretano sobre um mandril, deslizando um stent metálico sobre esta camada, e electrospinning uma segunda camada exterior de poliuretano (Figura 3). nanofibras de poliuretano são electrospun a uma taxa de 50 mm / h, o que resulta em uma camada interna de 100 um e uma camada ...

Discussão

We have developed a fabrication technique for a small caliber stent-graft which can be deployed using a standard percutaneous coronary intervention (PCI) procedure. Stent-grafts currently available are limited in their ability to maintain a low profile and flexibility for deployment. Bare metal stents developed by our group in our previous studies have proven to assist in rapid healing of the stented artery^24,26. Various polymers have been electrospun by other groups and polyurethane has been proven biostable ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass syringe	Air Tite	7.140-33	Syringe for spinneret
Graduated cylinder 5 mL	Fisher Scientific	08-552-4G	5 mL pyrex graduated cylinder about 9mm diameter and 11 cm long
High voltage generator	Bertan Accociates, Inc.	205A-30P	Used to apply voltage difference across spinneret and collector
Laboratory mixer with rpm control	Scilogex	SCI-84010201	Available from various laboratory equipment suppliers
Polyurethane	DSM	BioSpan SPU	Biospan Segmented Polyurethane
Rubber sheet	McMaster Carr	1370N11	Used to insulate syringe during electrospinning
Stainless steel mandrel	N/A	N/A	Manufactured
Stainless steel needle	Hamilton	91018	Used as spinneret in electrospinning
Support material	EnvisionTec	B04-HT-DEMOMAT	Biocompatible water soluble material
Syringe Pump	Harvard Apparatus	55-3333