Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Resumo

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho de um gene CRISPR/Cas9-baseado edição sistema de reparação de mutações pontuais em células de mamíferos. Aqui, usamos uma abordagem combinatória para gene edição com uma estratégia detalhada de follow-on experimental para medir indel formação no local de destino — em essência, analisando o mutagenesis local.

Resumo

Gene combinatória edição usando CRISPR/Cas9 e single-stranded oligonucleotides é uma estratégia eficaz para a correção de mutações pontuais de base única, que muitas vezes são responsáveis por uma variedade de desordens hereditárias humanas. Usando um sistema bem estabelecido modelo baseado na célula, o ponto de mutação de um gene de cópia única mutante eGFP integrado HCT116 células foi reparado usando esta abordagem combinatória. A análise das células corrigidas e não corrigidas revela tanto a precisão do gene de edição e o desenvolvimento de lesões genéticas, quando puntuais são criados em células não corrigidas na sequência de DNA que cercam o local de destino. Aqui, a metodologia específica utilizada para analisar essa abordagem combinatória a edição de gene de uma mutação de ponto, juntamente com uma estratégia detalhada de experimental para medir indel formação no local de destino, é descrita. Este protocolo descreve uma abordagem fundamental e fluxo de trabalho para as investigações que visam o desenvolvimento de tecnologias baseadas em CRISPR/Cas9 gene edição para terapia humana. A conclusão deste trabalho é que o mutagenesis local ocorre como resultado da atividade CRISPR/Cas9 durante o processo de mutação pontual reparação. Este trabalho coloca em lugar de uma metodologia padronizada para identificar o grau de mutagénese, que deve ser um aspecto importante e fundamental de qualquer abordagem destinado para aplicação clínica.

Introdução

Pioneiro de estudos realizados por Mandecki (1986) demonstrou alterações permanentes no DNA do plasmídeo usando oligonucleotídeos transformados em bactérias¹, enquanto Walder e Walder (1986) realizada estudos semelhantes em fermento². Pouco tempo depois, Sherman e colegas publicaram uma série de papéis em que single-stranded oligonucleotídeos foram introduzidos em células de levedura para fazer alterações hereditárias nos genes³. Com base no trabalho seminal nas células microbianas, Kmiec e colegas começaram a desenvolver exclusivos único agente oligonucleotides que dirigiu o único reparo de base em células de mamíferos⁴. Este conceito foi baseado em dados bioquímicos que mostraram que as moléculas do RNA do rolamento ligam mais firmemente para o site de destino do que aqueles composta inteiramente de bases de DNA. Embora houvesse inúmeros relatos de sucesso de gene-edição usando oligonucleotídeos quimérico^5,6,7, os níveis de edição permaneceram altamente variáveis entre experiências e através de célula de destino diferente / combinações.

Doador de single-stranded DNA é preferencial para doador de double-stranded DNA porque é menos provável integrar ao acaso sites dentro do genoma de⁸. No entanto, exogenamente introduzidos single-stranded oligonucleotides são propensos a rápida degradação por nucleases celulares. Várias estratégias para proteger a termini de oligonucleotídeos de degradação têm sido empregadas. Um protegido do exonuclease, single-stranded DNA contendo a sequência desejada foi suficiente para obter uma eficiência de edição no 0.1-1% intervalo⁶. Melhoradas e técnicas de transfecção mais consistentes, juntamente com leituras fenotípicas, permitiu a mais consistentes de edição por várias pesquisas grupos^{8,9,10,11, 12,13}.

Nos últimos 10 anos, tem havido um esforço significativo para fazer células alvo mais receptivos a edição de gene. Uma estratégia emprega a modulação do ciclo celular^14,15,16. Enquanto edição frequências sob condições de reação normal com single-stranded oligonucleotides (ssODNs) introduzido em células de mamíferos cultivadas pairaram entre 0,1% e 1%, as frequências do gene edição quando aumento de 3 a 5 vezes os oligonucleotides foram introduzidos em células durante sua transição da fase S. Em uma série separada de experiências, Brachman e Kmiec (2005) demonstraram que os níveis relativamente elevados de gene precisa editar (3-5%) foram obtidos quando 2'3 ' dideoxycytosine (ddC) foi incubada em células durante 24 h antes da adição do oligonucleotide¹⁷ . ddC reduz a taxa de movimento de garfo de replicação de DNA, sugerindo que gene edição pela ssODNs em replicar células provavelmente envolve a incorporação de ODNs regiões de replicação ativa^11,18. Tomados em conjunto, estes estudos levados ao conceito que DNA dador torna-se incorporada um crescente garfo de replicação como parte do verdadeiro mecanismo de ação do gene de edição, independente se uma pausa de dupla-hélice está presente ou não¹⁹. Assim, a correção de uma mutação de ponto ou a substituição de um segmento de DNA dentro do cromossomo ocorre através de um DNA de emparelhamento e a via de assimilação de single-strand.

Induzir quebras de DNA dupla-hélice aleatórias no cultivo de células com agentes da pequeno-molécula cria um ambiente no qual eventos de replicação de DNA estão parados, como a célula tenta reparar os danos de^20,21. Este abrandamento transitório das forquilhas de replicação permite uma penetração mais eficiente da estrutura da cromatina, single-stranded edição oligonucleotides, melhorando a acessibilidade de alvo¹⁵. A criação de DNA dupla-hélice quebra por medicamentos como VP16, bleomicina, ou^,camptothecin²²,²³, foi mostrado para estimular gene edição níveis por quase 10-fold, até 6-8%. No entanto, quebras de DNA dupla-hélice aleatórias são indesejáveis em um ambiente terapêutico.

Gene edição com oligonucleotides e nucleases programáveis também é estimulado durante a divisão celular^24,25. Quando entrega à base de ácido nucleico foi usada para realizar reparo homologia-dirigido em células de HCT 116 sincronizados, Rivera-Torres e colegas demonstraram o mesmo aumento na atividade de segmentação quando nucleases efetoras como ativador de transcrição (TALENs) foram empregados com single-stranded oligonucleotides, ambos introduzidos em uma replicação celular população^26,27 . Mais recentemente, Bialk e colegas mostraram que a reparação das mutações de base única com single-stranded oligonucleotides e uma matriz de cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições Cas9 (CRISPR/Cas9) moléculas ocorre com maior eficácia Quando a população celular está atravessando fase de S²⁸. A molécula CRISPR é composta de RNA e funções para identificar a região dentro da sequência de DNA que é designada por clivagem de meta. Cas9 é uma enzima bacteriana, cuja função é decompor o DNA dupla-hélice em uma reação de troca de antípodas. Assim, CRISPR posiciona o complexo no genoma alvo e Cas9 nuclease executa a ruptura de dupla-hélice. Lin et al . (2014) também demonstrou a importância do ciclo celular para alcançar altas frequências do gene edição, usando um modificado CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) mediada por complexo sistema de entrega em fibroblastos neonatais primários, células-tronco embrionárias humanas, e outras linhas de célula²⁴. Assim, a relação estabelecida entre o gene edição e progressão do ciclo celular para edição de gene único agente é aplicável a combinatória gene edição usando nucleases programáveis e modelos de DNA do doador. Enquanto a abordagem combinatória para gene edição reuniu uma variedade de parceiros com o modelo de DNA do doador, a maioria dos trabalhadores no campo usam CRISPR/Cas9 para fornecer a função de pausa de dupla-hélice. Esta escolha baseia-se no facilidade de uso esta ferramenta genética particular e a flexibilidade com a qual pode ser empregado para desactivar a função do gene ou para introduzir um estrangeiro pedaço de DNA em um site específico. A geração de um nocaute tecnicamente é mais fácil em comparação com uma substituição do gene, onde a incorporação de "corretas" ou normais cópias de um gene para o site da doença deve ser realizada com precisão. Um número de investigadores está identificando e estudando o uso de medicamentos específicos e reagentes que permitem a correção das bases mutantes e a inserção de sequências genéticas normais na posição apropriada às frequências elevadas²⁹.

Recentemente, Rivera-Torres et al ³⁰ usado combinatória gene edição, aproveitando a atividade de quebra de dupla-hélice de um sistema CRISPR/Cas9 especificamente projetado e a informação genética fornecido por um modelo de DNA do doador do oligonucleotide single-stranded, para reparar um ponto de mutação em umúnica cópia do gene da proteína fluorescente verde reforçada (eGFP) integrados HCT116 células. Os autores aproveitaram esta linha de celular bem caracterizadas modelo para avaliar a especificidade do decote em torno do local de destino. Os dados revelam que a heterogeneidade no local de destino existe, especialmente nas células que não contêm uma mutação de ponto corrigida. Neste manuscrito, vamos detalhar e centrar-se sobre a metodologia utilizada por esses trabalhadores para examinar no local heterogeneidade mutacional criada editando CRISPR/Cas9 gene.

Protocolo

o seguinte protocolo envolve trabalhar com células de mamíferos; familiaridade com a cultura técnica estéril/celular é esperada.

1. linha celular e as condições de cultura

1. fazer 500 mL de meio para a cultura de células de HCT 116: McCoy ' s 5A modificado suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina e 1% penicilina (isto é completo médio).
   Nota: Cresce HCT 116-19 células num balão de T-75 ou T-175 antes do chapeamento. Quando 90% confluente, cada balão T-75 renderá 8,4 x 10 ⁶ células, aproximadamente cinco placas de 10 cm, e cada T-175 renderá 18,4 x 10 ⁶ células, aproximadamente quinze placas de 10 cm.

2. Colheita de células do balão de

1. embora, Aspire o meio, lavar com Dulbecco ' s Phosphate-Buffered salina sem cálcio e magniesium (PBS) (10 mL para T-75 ou 25 mL para T-175) e Aspire.
Tripsina
2. Adicionar gota a gota ao balão com uma pipeta 2 mL (2 mL para T-175 ou 1 mL para T-75). Coloque o frasco em uma incubadora a 37 ° C e 5% CO ₂ por 5 min permitir que as células desanexar.
3. Toque no balão para garantir que todas as células são desalojadas e depois saciar com meio completo por dispersá-lo sobre toda a superfície do balão (8 mL para T-175 ou 4 mL T-75).
4. Pipeta de cima e para baixo várias vezes para separar grupos de célula e transferir as células para um tubo cônico de 15 mL
5. Antes de girar as células abaixo, Pegue 10 µ l da-15ml cónico e combiná-lo com 10 µ l de trypan azul para contar as células. As células de pelotas por fiação durante 5 min à 125 x g e 16 ° C.

3. Contar as células

1. transferir 10 µ l de células misturado com trypan azul para o hemocytometer. Conte as 4 grades do lado de fora (cada grade contém 16 quadrados).
   1. Levar a contagem de células média de cada conjunto de dezesseis quadrados de esquina.
   2. Multiplicar por 10.000 (10 ⁴).
   3. Multiplicar pelo volume total do meio utilizado para colher as células para corrigir a diluição da adição azul trypan.
      Nota: O formato de equação para calcular o volume para Ressuspender as células segue:
      
      

4. Chapeamento de células

1. para cada placa de 10 cm de células a serem sincronizados, adicionar 5 mL de meio completo e 6 µM de aphidicholin (12 µ l de um estoque de 2,5 mM em etanol à prova de 200).
2. Transferir 100 µ l de célula re-suspensa de Pelotas, 2.5 x 10 ⁶ células, para cada placa de 10 cm e redemoinho delicadamente para misturar.
3. Incubar as placas a 37 ° C e 5% CO ₂ para 16-24 h sincronizar pilhas na beira de G1/S.

5. Liberando as células de sincronização do aphidicolin do local

1. 4 h antes da segmentação, Aspire o meio, lave com PBS, aspirar a PBS e adicionar 5 mL de meio completo
2. colocá-lo de volta na incubadora a 37 ° C e 5% de CO ₂ por 4 h

6. Complexantes de RNA

1. Enter a sequência do gene eGFP mutante para o laboratório de Zhang ' s gerador on-line ²⁵ (http:// crispr.mit.edu/) e escolha o guia CRISPR sequências que ligam com proximidade com o local de destino. Obter o guia CRISPR sequências de uma fonte comercial.
2. Armazenar o RNA CRISPR (crRNA), ativando o trans crRNA (tracrRNA) e proteína Cas9 a 20 ° C e use de acordo com as sugestões do fabricante. Tubo de
   1. Mix o RNA em concentrações equimolar, para µ l 45 µM. adicionar 6,75 de um estoque de 200 µM de crRNA e 6,75 µ l de um estoque de 200 µM de tracrRNA para uma centrífuga de 1,5 mL. Adicione 16.50 µ l de tampão TE tornar um volume final de 30 µ l.
3. Calor a 95 ° C por 5 min em um bloco de calor ou máquina PCR.
   Cuidado: Quente!
4. Deixar arrefecer à temperatura ambiente.
   Nota: Se utilizar uma máquina PCR, definir o resfriamento de 0,2 ° C/s.
5. Execute as seguintes etapas para cada amostra.
   1. 2.22 diluir µ l de crRNA:tracrRNA complexas em 2,78 µ l de tampão TE (10 mM Tris, pH 8.0 e 0.1 mM EDTA; pH 8.0) para um volume final de 5 µ l.
   2. 1.67 diluir µ l de Cas9 proteína de um estoque de 60 µM em 3,33 µ l de soro e baixo médio para volume final de 5 µ l.
6. Mix 5 µ l de proteína Cas9 com 5 µ l de RNA complexado

7. Colheita de células para segmentação

1. aspirado o meio, lave com 5 mL de PBS, aspirar a PBS e adicionar 1 mL de tripsina pré-aquecido para cada placa de 10cm. Coloque as placas na incubadora a 37 ° C e 5% de CO ₂ por 5 min.
2. Toque na placa para garantir que todas as células são desalojadas e depois saciar com 4 mL de meio completo por dispersá-lo sobre toda a superfície da placa de 10 cm.
3. Pipeta subindo e descendo várias vezes para separar grupos de célula e transferir as células para um tubo cônico de 15 mL.
4. Antes de girar as células abaixo, Pegue 10 µ l do tubo cônico de 15 mL e combiná-lo com 10 µ l de trypan azul para contar as células. As células de pelotas por fiação durante 5 min à 125 x g e temperatura ambiente.
5. o meio de aspirar e lavar com 5 mL de PBS. As células de pelotas por fiação a 125 x g durante 5 min à temperatura ambiente.

8. Contar as células

1. transferir 10 µ l de células misturado com trypan azul para o hemocytometer. Conte as 4 grades do lado de fora (cada grade contém dezesseis quadrados).
   1. Levar a contagem de células média de cada conjunto de dezesseis quadrados de esquina.
   2. Multiplicar por 10.000 (10 ⁴).
   3. Multiplicar pelo volume total do meio utilizado para colher as células para corrigir a diluição da adição azul trypan.
      Nota: O seguinte é o formato de equação para calcular o volume para Ressuspender as células. Ressuspender o número necessário de células de McCoy isento de soro ' s 5A modificado médio.
      
      

9. segmentação amostras

1. transferir 100 µ L de suspensão de células (5 x 10 ⁵ células) da etapa 8.1 para cada cubeta de 4mm lacuna de eletroporação. Adicione 10 µ l de complexo RNP da etapa 6,7 a 100 µ l de células em uma densidade de células de 5 x 10 ⁵. Adicionar ODN (2 µM) para cada amostra.
   Nota: Para um controlo positivo, adicionar 1 µ l de eGFP em 1 µ g / µ l expressando de shRNA
   1. levar a cremalheira para uma máquina de eletroporação, levemente filme de cada amostra e colocá-los na câmara. Electroporate a 250 V, LV; 2 pulsos, 1 s; 13 ms; pulso de unipolar.
2. Transferir o rack de volta para o bairro. Cada amostra de transferência de um bem contendo 2 mL de meio completo eun uma placa de 6. Incubar a 37 ° C e 5% CO ₂ para 72 h antes de verificar para níveis de correção.

10. Análise do Gene edição células e Transfection eficiência

1. o meio de aspirar e lavar as células com 2 mL de PBS. Aspirar a PBS e adicione 500 µ l de tripsina pré-aquecido a cada poço da placa de 6-poços. Coloque as placas na incubadora a 37 ° C e 5% de CO ₂ por 5 min.
2. Toque a placa para garantir que todas as células são desalojadas e depois saciar com 1 mL de meio completo por dispersá-lo sobre toda a superfície do poço.
3. Passar as células para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e pelota a 5.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
4. , Aspire o meio. Ressuspender o sedimento celular em 500 µ l de tampão de FACS (0,5% BSA, EDTA 2 mM e iodeto de propidium 2 µ g/mL em PBS).
5. Medir a fluorescência da célula (eGFP +) por citometria de fluxo.
   1. Calcular a eficiência de correção como a percentagem das células eGFP positivo totais ao vivo sobre o número total de células vivas em cada amostra, conforme descrito em Rivera Torres et al ³⁰.

11. Análise de sequências de DNA

1. Electroporate o HCT sincronizada e lançado 116-19 células em uma concentração de 5 x 10 ⁵   células/100   µ l, com complexo de 100 pmoles e 72NT RNP ODN em 2,0 µM.
2. Transferir as células para placas 6 boas e permitir-lhes a recuperar por 72 h.
3. Classificar as células individualmente em placas de 96 poços, usando um classificador de FACS com laser (100 mw) 488 nm para eGFP + /-, conforme descrito em Rivera-Torres et al ³⁰.
   Nota: Nem todos os poços crescerá com sucesso.
4. Expandir as células por 6 semanas e colheita conforme descrito na etapa 7.
5. Dos poços que têm crescimento, isolar gDNA celular usando um isolamento de DNA comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais) e amplificar a região circundante o destino base através de PCR (718 bp; encaminhar cartilha 5 '- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ' e reverter a cartilha 5 ' - ACTTGTACAGCTCGTCCATGC - 3 ').
6. Análise de sequenciamento de DNA realizar sobre as amostras.

Resultados

Usamos um sistema modelo para estudar a edição de gene em células de mamíferos, que conta com a correção de uma mutação de ponto incorporada dentro do gene da eGFP integrado como uma única cópia em células HCT116. É importante notar que se trata de um gene de cópia única; assim, uma visão menos complicada de alterações de DNA ou mutagénese pode ser feita. Figura 1A exibe a sequência do gene eGFP mutante com a base específica, a terceira base do codão stop TAG, destacada em vermelho. O oligonucleotide 72-base, que é parcialmente complementares para a vertente não-transcrito do gene da eGFP (72NT) e é projetado para induzir a troca de base de um G para um C, também é ilustrado. Além disso, um CRISPR, designado como 2C, com a sequência de protospacer indicado em uma 5' para 3' orientação, também é retratado na figura 1A. Para realizar esta reação de gene-edição, usamos um ribonucleoprotein (RNP), consistindo o CRISPR (cr) RNA e o RNA tracr (tr), acoplados a proteína purificada de Cas9 (figura 1B), em vez de usar um vetor de expressão mamíferos consistindo do gene Cas9 e o guia específico apropriado sequência de RNA.

Quando a partícula RNP especificamente projetada é entregue com o single-stranded do oligonucleotide em células HCT116 por eletroporação, gene edição, evidenciado a reparação da base única mutação em eGFP, é observado após 72 h de incubação usando um fluxo citômetro. Reparação funcional é observável pelo aparecimento de fluorescência verde em células alvo, que também pode ser separada de toda a população, classificando por causa desta fluorescência. Como mostrado na Figura 2, uma resposta gradual da dose pode ser vista como os níveis coordenados da RNP e 72NT aumento. A relação molecular, picomoles da RNP e concentração micromolar do 72NT, conforme exibido na figura, são baseados em ideais dosagens utilizadas na edição de gene reações que dependem da introdução de Cas9 e guia específico do RNA de expressão transfectada vetores. O baixo-relevo na Figura 2 exibe uma reação gene-edição realizada na ausência da partícula da RNP. Aqui, cerca de 1% das células alvo são corrigidos quando uma 10 vezes maior concentração do oligonucleotide do 72NT é usada na reação de gene-edição de único agente.

A fim de determinar se a heterogeneidade genética existe o efeito local, o chamado mutagenesis no local de destino-decidimos analisar o resultado do gene edição atividade em células individuais. Enquanto muito mais trabalhoso do que examinando a população total, uma medida verdadeira de pegadas genéticas ou lesões pode ser verificado quando o genoma de uma relação clonal expandidos células é examinado. Repetimos o experimento descrito na Figura 2, desta vez usando apenas 100 pmol de complexo RNP e 2,0 µmol do oligonucleotide do 72NT. Como acima, HCT 116 células foram sincronizadas para 24 h com aphidicholine e preso na beira de G1/S. 4h depois, as células foram liberadas e as ferramentas de edição de gene foram introduzidas por eletroporação. 72 horas mais tarde, as células foram analisadas usando FACS e classificados individualmente em placas de 96 poços (o processo experimental é ilustrado na Figura 3). Células exibindo fluorescência verde foram classificadas por citometria de fluxo em poços individuais de uma placa de 96 poços para expansão clonal. Importante, faltando eGFP expressão de células também foram isoladas e classificadas de forma semelhante para expansão nas mesmas condições.

Após 14 dias de crescimento, a maioria dos clones individuais tinha expandido suficientemente para permitir o isolamento do DNA. Como tal, foram selecionados 16 clones das amostras eGFP-positivo, e a integridade genética que cercam o local de destino foi analisada pelo sequenciamento de DNA. Informações que cercam a sequência de DNA de alelos de uma população foi geradas usando Sanger sequenciamento, montada utilizando o software de visualização de sequência para comparar a sequência de um alelo de sua (Figura 4A). O site corte do complexo RNP é indicado por uma seta preta, localizada no green bar (2C crRNA). Como também é mostrado na Figura 4A, 16 todos positivo eGFP células contêm a troca do nucleotídeo previsto no local de destino. O resíduo de C convertido é destacado em vermelho, e o perfil de pico refletindo essa mudança precisa é fornecido sob a sequência eGFP-positivo. De forma semelhante, 15 não-verde clonal Isola, suficientemente expandida para permitir a extração de DNA e sequenciamento, foram analisados para a heterogeneidade no local de destino. Como previsto, em aproximadamente metade das amostras, observou-se sem troca de base de DNA. Isso se reflete na manutenção do resíduo G no local de destino, conforme mostrado na Figura 4B. O restante das expansões clonais examinadas nestas experiências exibida uma população heterogênea de mutações de exclusão, contabilidade, portanto, pela falta de fluorescência verde. O tamanho de exclusão variou entre uma base e 19 bases. É importante notar que examinamos apenas 15 amostras das células eGFP-positivo, e enquanto nós acreditamos que este é bastante representante do tipo de lesões genéticas, deixado para trás por CRISPR/Cas9 atividade, existe a possibilidade de que outros tipos ou formas de puntuais poderiam estar presentes na população alvo.

Tomados em conjunto, os resultados exibidos na Figura 4 confirmaram a leitura fenotípica no eGFP sistema de direcionamento. Conversão do G ao nucleotídeo C permite o aparecimento de fluorescência verde nas células de HCT116 corrigidas. Nenhuma substituição de base em torno do local de destino tem sido observada em clones isolados para este experimento ou em anteriores experiências^27,28. Os dados também demonstram que células falhando submeter-se a edição através de reparação ponto de mutação de genes permanecem não corrigida, mas, em alguns casos, não sem alterações, com uma gama de heterogeneidade genética que cercam o local de destino.

Figura 1. (A) sistema do modelo para a edição de gene do gene mutante eGFP. Os segmentos apropriados da sua e gene mutado eGFP com o codão alvo, localizado no centro da sequência, são exibidos em verde e vermelho, respectivamente. O nucleotídeo direcionado para o exchange está em negrito e sublinhado. Bases o realçado em azul representam a sequência de protospacer CRISPR 2C, e as bases laranja destacam o site PAM. O oligonucleotide usado nesses experimentos é 72 bases de comprimento, tendo ligações phosphorothioate modificado nas três bases de terminais; o mer-72 destinos não-transcrita strand (NT) (72NT). (B) CRISPR/Cas9reação de montagem ribonucleoprotein. crRNA fornece especificidade do alvo (seção 20 bases, vermelho) correspondente para a sequência de protospacer de 2C e um domínio de interação (azul) com o tracrRNA (verde). crRNA e tracrRNA são recozidos em concentrações equimolar. Cas9 proteína (cinza) é adicionada para completar a montagem da RNP. Guia de RNAs (gRNAs) direto e ativar a endonuclease Cas9, que então se fendem o ADN do alvo. A parte inferior da figura mostra a sequência de semente de 2C e a sequência de tracrRNA. Esta figura foi modificada de Rivera-Torres, a. s. et al. (2017). clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Gene de edição é dose-dependente, quando dirigido pela RNP e o ssODN. Sincronizado e lançado HCT 116-19 células foram electroporated com 24-120 pmol de CRISPR/Cas9 RNP e 0.6-3.0 µM de 72mer. Após um período de recuperação de 72 h, edição de gene atividade foi medida usando um citômetro de fluxo. Gene de edição é exibido como a eficiência de correção (%), determinada pelo número de células viáveis de eGFP positivos dividido pelo número total de células viáveis na população. Barras de erro são produzidas a partir de três conjuntos de pontos de dados gerados ao longo de três experimentos separados usando cálculos básicos de erro padrão. Inset: edição de gene único agente. Edição de gene atividade dirigida pelo single-stranded do oligonucleotide (72NT) na ausência de complexos em condições idênticas a RNP é apresentada em função do aumento da concentração. Esta figura foi modificada de Rivera-Torres, a. s. et al. (2017). clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Estratégia experimental para o isolamento de clones de célula única. Células exibindo eGFP expressão foram marcadas como positivo e classificados usando um citômetro de fluxo como células únicas em poços individuais para expansão clonal. Células falta expressão eGFP foram isoladas e ordenadas de forma semelhante e expandiu-se nas mesmas condições. O DNA foi então isolado e o gene eGFP foi amplificado e submetido a Sanger sequenciamento para analisar a atividade do gene-edição em torno do local de destino. Esta figura foi modificada de Rivera-Torres, a. s. et al. (2017). clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. (A) allelic análise de células eGFP positivo expandiu-se como uma população clonal. Uma relação clonal isolada e expandidas eGFP positivo amostras (dezesseis clones) foram analisadas no local em torno da base do alvo e DNA de cada um, colhidas, purificadas, amplificadas e sequenciadas. Análise alélico foi realizada usando Sanger sequenciamento, montada usando o software de visualização de sequência e em comparação com a sequência de um alelo sua, que é ilustrado na parte superior da figura. O site corte do complexo RNP é indicado como uma pequena seta preta localizada no green bar (2C crRNA). (B) Análise alélica de células eGFP negativo expandiu-se como uma população clonal. Quinze amostras individuais, expandidas a partir de clones originários da população não corrigida, foram aleatoriamente selecionadas e analisadas para formação da indel no site cercando o nucleotídeo do alvo. Como acima, análise alélico foi realizada usando Sanger sequenciamento e montados com um software de visualização de sequência. Mais uma vez, a sequência de um alelo sua na parte superior da figura, juntamente com a corte local da RNP, são apresentados. Esta figura foi modificada de Rivera-Torres, a. s. et al. (2017). clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Gene edição surgiu como uma disciplina científica convencional, principalmente por causa do surgimento do sistema CRISPR/Cas9. Este percurso notável, que facilita a imunidade adotiva em células bacterianas, tem sido realocado como uma ferramenta molecular para permitir alteração genômica em cromossomos humanos. A função natural do CRISPR/Cas9 é desativar o DNA viral através da introdução de quebras de DNA dupla-hélice, levando a fragmentação^30,31. Essa atividade resulta na destruição do DNA exógeno a invadir e leva a imunidade procariótica que suprime subsequente infecção pela mesma partícula viral. Surpreendentemente, este sistema apresenta comportamento pneumônico, em que ele pode reativar específico CRISPR gRNA criado por eventos de infecção anterior.

A eficiência e a precisão de disrupção do gene catalisada por CRISPR/Cas9 tem sido usado em inúmeros sistemas genéticos eucarióticos onde o objetivo foi para desativar um funcionamento gene^32,33. Quando reduzido a seu nível basal, o processo consiste em duas etapas fundamentais. A primeira é uma pausa de dupla-hélice, enquanto o segundo se baseia no processo inerente de fim não-homóloga (NHEJ) para completar o nocaute de juntar-se. Na maioria dos casos, os resultados da dupla-hélice pausa na criação sem corte-terminado, desprendida de segmentos cromossômicos e enzimas envolvidas na NHEJ reagem a ruptura cromossômica em agir para conjoin as pontas quebradas. Esse processo às vezes pode envolver a perda de nucleotídeos individuais no local cortado. A perda de até mesmo algumas bases pode causar um frameshift e expressão funcional cessa. O uso de CRISPR/Cas9 para criar o nocaute genético acoplando o processo natural de NHEJ revolucionou eucarióticas genética; a perda de DNA no local de destino é previsível e esperado.

Em contraste com o nocaute do gene, um número de pesquisadores estão envolvido em tentativa de redirecionar e reaproveitar CRISPR/Cas9 atividade para o processo de reparação de homologia-dirigido. O objetivo dos estudos é a correção do gene. Nesta estratégia, CRISPR/Cas9 é combinado com um modelo de DNA doador que fornece a informação genética para reparar um erro inato ou para inserir as mutações em genes saudáveis. Os primeiros relatórios, destacando a capacidade notável do CRISPR/Cas9 para catalisar a homologia-dirigido de reparação indicaram (diretamente ou indiretamente) que o processo ocorreu em uma forma altamente precisos^24,34. Nosso laboratório tem estudado homologia-dirigido reparo ou correção de gene usando oligonucleotídeos single-stranded em uma tentativa para definir o mecanismo e circuitos regulamentares ao redor^{15,17,18 ,23}. Temos focado principalmente no gene edição mutações de ponto única, pois esta é a mutação genética mais básica, conhecida por ser responsável por muitas doenças hereditárias. Nossos conhecimentos fundamentais de gene edição levaram-na questionar a precisão da atividade CRISPR/Cas9 nessas reacções, desde a função CRISPR/Cas9 em resultados de nocaute do gene na formação de puntuais. Usamos um sistema de modelo bem definido, ao invés de um gene não-selecionável ainda clinicamente relevante, para estudar o mutagenesis local de forma reducionista decididamente. Usando um gene alvo simples, mediante a qual gene correção pode ser medida em ambos os níveis genotípicos e fenotípicos, nós raciocinou que heterogeneidade ocorrendo no local de destino pode ser identificada de forma confiável e robusta.

Nossos dados confirmam que o gene bem-estabelecida edição do sistema, consistindo de um mutante eGFP gene integrado HCT116 células, pode fornecer informações fundamentais no que se refere a geração de lesões genéticas e o processo de mutagénese no local. Moléculas de DNA do doador do oligonucleotide CRISPR/Cas9 e single-stranded trabalhando em conjunto podem levar a reparação precisa do ponto de mutação no gene da eGFP. Propomos um novo modelo para a reparação de mutações pontuais, um caminho molecular em que o DNA do doador atua como um modelo de replicação para a reparação da base de mutantes, um processo que tem denominado exatos³⁰. A população-alvo, não exibindo o fenótipo corrigido, exibe uma variedade de células contendo heterogêneos e variando amplamente puntuais de DNA em torno do local de destino. Em aproximadamente metade dos clones isolados da população não corrigida, mutagênese de exclusão foi observada no local de destino. Desde que não anterior relatório indicou que single-stranded oligonucleotides atuando como ferramentas de edição de gene único agente podem induzir puntuais no local de destino, podemos concluir que a atividade CRISPR/Cas9 é responsável por estas mutações.

Neste manuscrito, nós fornecemos uma metodologia detalhada para que a heterogeneidade genética no local de destino pode ser medida de forma confiável e robusta. Enquanto uma enorme quantidade de atenção foi pago para a análise e mapeamento de mutagénese off-site, é provável que uma mutação heterogênea criada no local de destino terá um efeito maior sobre o sucesso ou fracasso do gene edição na área clínica. Tecnologias adicionais ou modificados Cas9 proteínas podem ser necessárias para melhorar a precisão da reparação de erros inatos em células de mamíferos³⁵homologia-dirigido. Algumas dessas tecnologias incluem o uso de oligonucleotídeos auxiliares para atuar como uma ponte, segurando as extremidades cromossômicas juntos e evitando a ação destrutiva de NHEJ. Definir o grau de heterogeneidade no local de destino, como resultado da atividade de edição de gene é e deve ser uma parte importante de qualquer protocolo projetado para a intervenção terapêutica.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy’s 5A Modified medium	ATCC	30-2007
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC	30-2020
L-glutamine	ATCC	30-2214
Penicillin-Streptomycin Solution	ATCC	30-2300
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	ATCC	30-2200	No Calcium or magnesium
Trypsin EDTA Solution	ATCC	30-2101
Aphidicolin 1mg	Thermo Fisher	AC611970010
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol	IDT		No catalog number since its made to your specific gene target.
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol	IDT	1072533
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg	IDT	1074182
IDTE Buffer	IDT	11-01-03-01
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm	VWR	10497-474
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems	BioRad	1652660
Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE)	Sigma	05470-1G
EDTA (0.5 M), pH 8.0	ThermoFisher Scientific	AM9260G
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher Scientific	P3566
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)	Qiagen	69581
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates	VWR	10062-892
Petri Dishes	Fisher	12-565-90
Conical Tubes (15 mL) (racked)	Thermo Fisher	AM12500
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985062