Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

Resumo

Apresentamos um método automatizado para reconstrução tridimensional do germline Caenorhabditis elegans . Nosso método determina o número e a posição de cada núcleo dentro da linha germinativa e distribuição de proteína germline análises e estrutura do citoesqueleto.

Resumo

O germline Caenorhabditis elegans (c. elegans) é usada para estudar vários processos biologicamente importantes, incluindo a dinâmica de desenvolvimento, apoptose e cromossomo de células-tronco. Enquanto o germline é um excelente modelo, a análise é frequentemente duas dimensões devido ao tempo e o trabalho necessário para análise tridimensional. Grandes leituras em tais estudos são a posição/número de núcleos e distribuição da proteína dentro da linha germinativa. Aqui, apresentamos um método para executar a análise automatizada do germline usando microscopia confocal e abordagens computacionais para determinar o número e posição dos núcleos em cada região do germline. Nosso método também analisa a distribuição de proteína germline que permite o exame tridimensional da expressão da proteína em diferentes origens genéticas. Além disso, nosso estudo mostra variações na arquitetura do citoesqueleto em distintas regiões do germline que podem acomodar requisitos específicos de desenvolvimento espaciais. Finalmente, nosso método permite que a contagem automatizada do esperma na espermateca de cada linha germinativa. Tomados em conjunto, nosso método permite a análise fenotípica rápida e reprodutível do germline c. elegans .

Introdução

A conservação de sinalização com mamíferos vias faz c. elegans , um excelente modelo para o estudo de vários processos biológicos^1,2. Em nosso laboratório, usamos o c. elegans germline para estudar o desenvolvimento de células-tronco, apoptose e expressão gênica. Enquanto o germline é uma estrutura tridimensional, muitos estudos são duas dimensões devido à natureza demorada e trabalhosa de análise tridimensional. É altamente provável que a análise bidimensional pode deturpar na vivo eventos no germline. O hermafrodita de adultos de c. elegans tem dois braços da linha germinal, cada um deles abriga uma célula somática ponta distal (DTC) que mantém distais células germinativas num estado indiferenciado^3,4. Estas células germinativas começam a diferenciar como movem-se longe do DTC, escapar de sua influência e tornar-se oócitos e esperma como atingem a extremidade proximal da da linha germinal. Durante este processo, núcleos de células germinativas sofrem mitose, antes de fazer a transição para a meiose^5,6. Produção de espermatozoides é completada pelo estágio larval 4 (L4) do desenvolvimento, após o qual os oócitos são produzidos durante a idade adulta. Os espermatozoides são armazenados na espermateca onde eles fertilizam oócitos para gerar embriões.

Existem vários fatores genéticos e ambientais que podem influenciar o desenvolvimento do germline em c. elegans , resultando em mudanças no número de núcleos, o número de eventos de apoptotic, dinâmica do cromossoma e expressão de proteínas e/ou localização^{7 ,8,9,10,11}. A análise desses eventos requer a identificação de cada etapa de diferenciação com base na distribuição e morfologia nuclear. Para analisar com precisão esses parâmetros manualmente com um tamanho de amostra grande é trabalhosa e demorada. Para contornar estes inconvenientes e permitir a consistência da análise, desenvolvemos um método automatizado para análise tridimensional do c. elegans germline para núcleos contando, distribuição de núcleos, expressão de proteínas e do citoesqueleto estrutura. Combinando a microscopia confocal com renderização tridimensional, geramos parâmetros de tamanho e forma, para a identificação de cada estágio da diferenciação de células germinativas. Além disso, esse método permite a contagem de esperma e de núcleos de células germinativas, mais Pontuação do número de cromossomos em cada oócito.

Uma estrutura crucial do germline é o citoesqueleto, que fornece a estabilidade para o compartimento da linha germinal, SIDA a ciclose e proteção germline núcleos¹². Usando processamento computacional, realizamos a reconstrução tridimensional do citoesqueleto germline e identificado características distintas do citoesqueleto, dentro da linha germinativa. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para ilustrar a análise computacional como combinado com confocal de imagem permite uma análise abrangente do germline c. elegans .

Propomos um método rápido de análise tridimensional de c. elegans germline (Figura 1). Usando a análise tridimensional, é possível estudar a distribuição tridimensional do germline núcleos (Figura 2 e Figura 3), automatizada contagem de células (Figura 2), reconstrução do germline citoesqueleto ( Figura 3), distribuição de proteínas (Figura 4) e marcar o número de espermatozoides na espermateca e cromossomos em oócitos (Figura 5). O método não só permite a quantificação fácil e precisa do germline mas identifica fenótipos fisiologicamente relevantes.

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Protocolo

1. preparação e criação de minhoca

Nota: Consulte a Tabela de materiais para todas as informações do produto.

1. Cultura de Escherichia coli OP50: cultura OP50 bactérias em caldo lisogenia (LB) (triptona 1%, 0,5% de fermento, 0,5% de NaCl, pH 7.0) durante a noite a 37 ° C, sem antibióticos.
2. Semente 400 µ l de bactérias OP50 para placas de mídia (NGM) de crescimento de nematoides (1,5 g de NaCl, 8,5 g de ágar-ágar, 1,25 g de peptona, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1ml de colesterol de 5 mg/mL em etanol, 1ml de 1m MgSO₄ e 25 mL de tampão de₄ de KPO 1 M) e o ar seco as bactérias por 48 h.
3. Pegar vermes nas placas NGM semeadas e incubar a 15 ° C ou 20 ° C.
   1. Para a análise do germline adulto hermafrodita, escolher bem alimentados vermes L4 para o gramado bacteriano e incubar durante uma noite a 20 ° C.
   2. Para marcar o número de espermatozoides em hermafroditas, incube L4 vermes a 20 ° C, durante 12 h até os vermes atinjam o molt L4/adulto. Para sincronizar os vermes para a fase de L4, prepare ovos escolhendo vermes adultos com um monte de ovos em solução de água sanitária (1 M de NaOH e água sanitária na proporção 1:1). Permitir que os ovos eclodem e escolher animais de L4 para o experimento.
4. Prepare lâminas de microscópio de Teflon colocando 25 µ l de solução de poli-L-lisina no slide e espalhar a solução, usando a ponta da pipeta. Depois de retirar o excesso poli-L-lisina com toalha de papel, permitir que os slides secar ao ar e a incubar a 65 ° C por 15-20 min.

2. Germline dissecção e coloração^6,13

1. Spot 10 µ l de tetramisole 0,01% (anestésico) sobre uma lamela de 22 × 22 mm e escolher um dias de idade vermes adultos dentro dele.
2. Dissecar o verme na cauda, como torna-se sedado usando uma seringa (5 mL) e uma agulha (24 "x 1") e certifique-se de que a linha germinativa não está danificada.
   Nota: A dissecação deve ser efectuada antes o verme torna-se totalmente paralisado para que a pressão negativa no verme e o movimento de verme ajuda a ejeção da da linha germinal. Para marcar o esperma, devem ser tomadas precauções para não danificar a espermateca pela agulha durante a dissecção. Evite tocar o germline com a agulha, exceto o ponto de dissecação após a espermateca. Se não há quebra no compartimento do germline ou qualquer descarga do germline é observada, o germline não deve ser usado para análise.
3. Coloca a lamela invertida em um slide revestido de poli-L-lisina, mantendo o germline dissecado no slide.
4. Remova o excesso de líquido sob a lamínula colocando uma torre de papel em um canto da lamela, então lugar o slide em nitrogênio líquido para 1 min. remover rapidamente a lamela usando uma agulha com a germlines no slide.
5. Transferir os slides em metanol de-20 ° C por 30-60 s numa câmara e, em seguida, incube durante 30 min em solução recentemente preparada de fixação (1x tamponado fosfato salino (PBS) contendo 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mM de MgSO₄, 0,8 mM. o glicol de etileno-bis(beta-aminoethyl éter)-N, N, N', N'-tetraacetic ácido (EGTA) e 3,7% paraformaldeído) à temperatura ambiente.
6. Lave as lâminas, colocando em uma câmara contendo 1X PBS, pH 7,4 com 0.1% Tween-20 por 10 min. Repita este passo uma vez.
7. Bloquear o germlines com 30 µ l de solução de bloqueio (30% de soro de cabra preparado pela adição de 900 µ l de soro de cabra em 1700 µ l de água destilada H₂O e 300 µ l de PBS de x 10) em uma câmara húmida preparada colocando toalha de papel molhada em uma caixa de plástico em temperatura ambiente por 30 min.
8. Adicione 50 µ l de solução-anticorpo REC-8 em 30% de soro de cabra em uma proporção 1: 300 para cada amostra. Incubar durante uma noite a 4° C.
9. Lave as lâminas, colocando em uma câmara contendo 1X PBS com 0.1% Tween-20 por 10 min. Repita a etapa uma vez e retire o excesso de líquido, colocando uma toalha de papel no canto do slide.
10. Prepare a solução de anticorpo secundário diluindo fluoróforo verde (488 nm de emissão de onda) anticorpo secundário conjugado (1: 1000), faloidina (mancha de actina, 1:4000) e DAPI (DNA mancha, 1:4000) em 30% de soro de cabra normal.
11. Adicione 50 µ l de solução anticorpo secundário para o slide.
12. Encube por 1h à temperatura ambiente.
13. Lavar as lâminas duas vezes, colocando em uma câmara contendo 1X PBS com 0.1% Tween-20 por 10 min. Limpe o excesso de líquido.
14. Adicionar 30 µ l de reagente para o slide de fixação e coloque um de 12 mm² x 1,5 µm lamela em cima e secar as lâminas a 4 ° C durante a noite.

3. Confocal da microscopia

1. Ligue o microscópio confocal, laser, scanner de ressonância e software microscópio confocal. Coloque os slides com germlines manchado no suporte do slide acima o objetivo X 63.
2. Localize uma linha germinativa, foco na parte superior da linha germinativa e marcá-lo usando o software do microscópio confocal. Da mesma forma, concentrar-se na parte inferior do germline e marcá-lo para estabelecer a espessura total da linha germinal.
3. O germline inteira definindo a espessura de cada fatia até 0,5 µm. Mark o germline completa e iniciar a aquisição de imagem. Digitalizar cada fatia 8 vezes e a média de valores para melhorar a qualidade de imagem. O scanner de ressonância permitirá a verificação rápida para evitar o branqueamento durante a imagem latente. Se o microscópio não tem um scanner de ressonância, reduzir o número de exames a quatro para evitar descoramento.

4. post análise de núcleos de imagem número e distribuição

Nota: Referem-se a complementar a Figura 1 para screenshots do software ferramentas e botões usados.

1. Importe a imagem para hottie 8.4.1 ou versões posteriores do software.
2. Defina região mitótica, zona de transição, região meiótica, região do oócito e espermateca do germline, identificando a morfologia nuclear em cada região.
3. Use o botão de função de superfície (Figura complementar 1A) do software para selecionar a região de interesse.
4. Cancelar o assistente de criação de superfície automática e manualmente, desenhar a região de interesse, o primeiro e o último pedaço da imagem da pilha tridimensional.
5. Clique em criar superfície.
   Nota: O software automaticamente irá desenvolver as pilhas entre a primeira e a última pilha.
6. Máscara de todos os canais exceto DAPI clicando o botão de canal de máscara (Complementar a figura 1B-C).
7. Defina parâmetros de tamanho nuclear usando o botão de ponto de função (complementar figura 1A). Para a região mitótica, defina um diâmetro XY de 2 µm, deixando o diâmetro Z indefinido. Para a zona de transição, defina o diâmetro XY de 2 µm de diâmetro de Z como 1,5 µm. (complementar a Figura 1).
   Nota: Solucione os diâmetros de acordo com a ampliação e especificações do microscópio. Para o protocolo atual, o objetivo utilizado foi 63 X e forneceu um extra de ampliação de 1,70 vezes durante a imagem latente. Se o objetivo for alterado, por exemplo 40 X, os diâmetros devem ser alterados em conformidade. Solução de problemas deve ser realizada com sua germlines para estabelecer os parâmetros corretos. A região mitótica de um braço do germline de tipo selvagem tem aproximadamente 250 núcleos. O diâmetro deve ser modificado para alcançar esse valor. Use pelo menos 15 germlines para determinar o valor ideal para o diâmetro. Uma abordagem semelhante deve ser usada para calibrar a zona de transição (núcleos de 150-170) e a região meiótica (núcleos de 600-700).
8. Limite a detecção de manchas, definindo o limite mínimo (complementar figura 1E). Uso DAPI manchados tipo selvagem germlines para estabelecer o limite mínimo, aumentando o limiar mínimo de renderização tridimensional até que a mancha aparece fora da linha germinativa.
9. Salve a imagem e obter o número de núcleos da tabela gerada automaticamente pelo software. Exporte as imagens como arquivos TIF.

5. publicar a análise de imagem para marcar o esperma e o número de cromossomos

1. Execute a renderização tridimensional, selecionando a espermateca como a região de interesse. Para detectar cada espermatozoide, definir o diâmetro do ponto entre 0,75 - 1,0 µm para X e Y-eixo, enquanto o diâmetro Z permanece indefinido. Use o botão de função de pontos, como mostrado na Figura complementar 1.
2. Subtrair o fundo marcando fundo subtraia caixa e usando valores de correção de fundo calculados pelo software (complementar a Figura 1).
   Nota: O software de hottie escolhe pontos de alta intensidade primeiro, portanto, o efeito de fundo é mínimo, enquanto não há diferença significativa entre a região de interesse e o fundo. Um segundo método é definir a correção de fundo manualmente, se for caso disso, valores pode ser dado para o plano de fundo. Correção de fundo manual será adequada se a intensidade de amostras independentes precisa de comparação.
3. Ajuste o limite de renderização tridimensional para detectar todos os DAPI manchado de esperma na espermateca (complementar figura 1E).
4. Para a contagem de cromossomas, definir o diâmetro do ponto < 0,75 µm para X e Y-eixo antes de desenvolver modelos tridimensionais.
5. Salve a imagem e exportar como arquivo TIF.

6. análise de imagem para a reconstrução do citoesqueleto do Germline de postar

1. Identificar a região de interesse no germline e mascarar todos os canais exceto faloidina clicando botão máscara canais .
2. Defina um detalhes da superfície de 0,25 µm usando o botão de função de superfície (complementar a Figura 1).
   Nota: Isto significa que cada 0,25 µm será processado em modelos tridimensionais. Detalhes da superfície podem ser constante para qualquer região do germline onde um modelo de superfície tridimensional será criado para cada 0,25 µm. No entanto, para a região do oócito, detalhes da superfície podem ser aumentada para 0,35 - 0,5 µm, devido à presença de fibras de actina bem definidas nesta região.
3. Subtrair o fundo marcando fundo subtraia caixa e usando valores de correção de fundo calculados pelo software (complementar a Figura 1).
4. Ajuste o limite de renderização tridimensional dependendo da estrutura que exigem análise (complementar figura 1E).
5. Salve a imagem tridimensional desenvolvida e exportar como um arquivo TIF.

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Resultados

Figura 1 indica o tempo necessário para análise tridimensional da linha germinal. Hermafroditas L4 incubadas a 20 ° C foram dissecadas para isolar germlines e coradas com DAPI, faloidina e anticorpos contra as proteínas da linha germinal. Germlines são fotografadas usando microscopia confocal. Microscopia confocal e coloração requer aproximadamente 24 h. análise computacional para o germline completa exige 10-15 min para contar o número e a posição...

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Discussão

O objetivo do presente protocolo é melhorar a precisão e reduzir o tempo necessário para a análise da linha germinal. Após preparação padrão de germlines dissecado, um modelo tridimensional do germline núcleos é preparado por processamento computacional. Permitindo a observação da distribuição de núcleos germline no espaço, renderização tridimensional calcula o número de núcleos em regiões específicas da da linha germinal. O aspecto crítico do nosso método é uma definição precisa dos parâmetro...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli bacteria	Homemade
Nematode Growth Media (NGM) plates	Homemade
polyclonal rabbit anti-REC-8	SDIX	29470002
Alexa 488 conjugated antibody raised in goat	Thermofisher Scientific	A-21236
Cytoskeletal dye phalloidin	Thermofisher Scientific	A-12380
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P5899
Tetramisol	Sigma Aldrich	P5899
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506
1M HEPES buffer, pH 7.4	Sigma Aldrich	G0887
10X PBS pH 7.4	Thermofisher Scientific	AM9625
Tween-20	Sigma Aldrich	P1389
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
37% Paraformaldehyde solution	Merck Millipore	1040031000
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Fluoroshield fixing reagent	Sigma Aldrich	F6182
Ethanol	Millipore	1009832511
Methanol	Sigma Aldrich	34860
20°C & 25°CIncubator	Any brand
Light microscope	Any brand
Confocal microscope	Any brand (Leica, Zeiss)
Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.	Bitplane
Phospho buffered saline, pH 7.4	Homemade
Teflon microscope slides	Tekdon	941-322-8288