Analisi computazionale della linea germinale Caenorhabditis elegans di studiare la distribuzione dei Nuclei, le proteine ed il citoscheletro

Riepilogo

Presentiamo un metodo automatico per la ricostruzione tridimensionale della linea germinale Caenorhabditis elegans . Il nostro metodo determina il numero e la posizione di ogni nucleo all'interno del germline e la distribuzione di analisi germinale della proteina e la struttura del citoscheletro.

Abstract

La linea germinale Caenorhabditis elegans (c. elegans) è usata per studiare i diversi processi biologicamente importanti tra cui dinamiche di sviluppo, apoptosi e cromosoma della cellula formativa. Mentre la linea germinale è un eccellente modello, l'analisi è spesso due dimensioni a causa del tempo e la manodopera necessaria per l'analisi tridimensionale. Principali letture in tali studi sono il numero/posizione dei nuclei e della distribuzione della proteina all'interno della linea germinale. Qui, presentiamo un metodo per eseguire l'analisi automatica della linea germinale usando microscopia confocale e approcci computazionali per determinare il numero e la posizione dei nuclei in ogni regione della linea germinale. Il nostro metodo analizza anche distribuzione di proteina di germline che consente l'esame tridimensionale dell'espressione proteica in differenti ambiti di provenienza genetici. Ulteriormente, il nostro studio mostra variazioni nell'architettura del citoscheletro in regioni distinte della linea germinale che può ospitare fino a specifiche esigenze di sviluppo spaziale. Infine, il nostro metodo consente un conteggio automatizzato dello sperma nella spermateca di ogni linea germinale. Presi insieme, il nostro metodo permette l'analisi fenotipica rapida e riproducibile della linea germinale di c. elegans .

Introduzione

La conservazione delle vie con i mammiferi di segnalazione rende c. elegans un eccellente modello per studiare più processi biologici^1,2. Nel nostro laboratorio, utilizziamo la linea germinale di c. elegans per studiare lo sviluppo delle cellule staminali, apoptosi e l'espressione genica. Mentre la linea germinale è una struttura tridimensionale, molti studi sono due dimensioni a causa della natura molto tempo e laborioso di analisi tridimensionale. È molto probabile che l'analisi bidimensionale può travisare in vivo gli eventi sulla linea germinale. L'ermafrodita adulto di c. el....

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Protocollo

1. preparazione e allevamento della vite senza fine

Nota: Consultare la Tabella materiali per tutte le informazioni sul prodotto.

1. OP50 Escherichia coli cultura: cultura OP50 batteri in brodo di Lisogenesi (LB) (tryptone di 1%, 0,5% lievito, 0.5% NaCl, pH 7,0) durante la notte a 37 ° C senza antibiotici.
2. 400 µ l di OP50 batteri di cartilagini di accrescimento del nematode media (NGM) (1,5 g di NaCl, 8,5 g di agar, 1,25 g di peptone, 1 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di colesterolo 5 mg/mL in etanolo, 1 mL di 1 M MgSO₄ del seme e 25 mL di buffer di₄ 1m KPO) e asciugare all'a....

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Risultati

Figura 1 indica il tempo necessario per l'analisi tridimensionale di germline. L4 ermafroditi incubate a 20 ° C sono stati sezionati per isolare germlines e macchiati con DAPI, falloidina e anticorpi contro le proteine di germline. Germlines sono imaging usando la microscopia confocal. Microscopia confocale e colorazione richiede circa 24 h. analisi computazionale per la linea germinale completa richiede 10-15 min a contare il numero e la posizione dei nucle.......

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Discussione

L'obiettivo del presente protocollo è quello di migliorare la precisione e ridurre il tempo necessario per l'analisi di germline. Dopo preparazione standard del germlines dissecata, un modello tridimensionale dei nuclei di germline è preparato dal rendering computazionale. Pur consentendo l'osservazione della distribuzione di nuclei di germline nello spazio, rendering tridimensionale calcola il numero dei nuclei alle regioni specifiche della linea germinale. L'aspetto critico del nostro metodo è accurata definizione d.......

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli bacteria	Homemade
Nematode Growth Media (NGM) plates	Homemade
polyclonal rabbit anti-REC-8	SDIX	29470002
Alexa 488 conjugated antibody raised in goat	Thermofisher Scientific	A-21236
Cytoskeletal dye phalloidin	Thermofisher Scientific	A-12380
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P5899
Tetramisol	Sigma Aldrich	P5899
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506
1M HEPES buffer, pH 7.4	Sigma Aldrich	G0887
10X PBS pH 7.4	Thermofisher Scientific	AM9625
Tween-20	Sigma Aldrich	P1389
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
37% Paraformaldehyde solution	Merck Millipore	1040031000
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Fluoroshield fixing reagent	Sigma Aldrich	F6182
Ethanol	Millipore	1009832511
Methanol	Sigma Aldrich	34860
20°C & 25°CIncubator	Any brand
Light microscope	Any brand
Confocal microscope	Any brand (Leica, Zeiss)
Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.	Bitplane
Phospho buffered saline, pH 7.4	Homemade
Teflon microscope slides	Tekdon	941-322-8288