꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

요약

우리 꼬마 선 충 의 생식. 의 3 차원 재구성 자동화 된 방법을 제시합니다 우리의 방법 수와 생식 및 분석 생식 단백질 분포 및 cytoskeletal 구조 내에서 각 핵의 위치를 결정합니다.

초록

꼬마 선 충 (C. 선 충) 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 및 염색체 역학을 포함 하 여 몇몇 생물학으로 중요 한 과정을 공부 하는 데 사용 됩니다. 동안에 생식은 우수한 모델, 분석은 종종 2 시간 및 3 차원 분석에 필요한 노동 차원. 이러한 연구에 주요 정보는 핵 및 단백질 분포는 생식 내 번호/위치. 여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 전산 접근을 사용 하 여 수는 생식의 각 지역에서 핵의 위치를 결정 하는 생식의 자동화 된 분석을 수행 하는 방법을 제시. 우리의 방법은 또한 다른 유전 배경의 단백질 식의 3 차원 검사를 가능 하 게 생식 단백질 분포를 분석 합니다. 또한, 우리의 연구는 특정 공간 발달 요구를 수용할 수 있는 생식의 고유 영역에서 cytoskeletal 건축에 변화를 보여줍니다. 마지막으로, 우리의 메서드는 각 생식의 spermatheca에 정자의 자동화 된 계산 수 있습니다. 함께 찍은, 우리의 메서드는 C. 선 충 생식의 신속 하 고 재현성 phenotypic 분석을 수 있습니다.

서문

포유류와 경로 신호의 보존은 C. 선 충 여러 생물 학적 과정^1,2를 공부 하는 우수한 모델. 우리의 실험실 사용 하 여 선 충 C. 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 유전자 발현 연구. 생식은 3 차원 구조, 많은 학문은 2 차원 3 차원 분석의 시간과 노동 집약적인 특성상. 2 차원 분석 vivo에서 이벤트는 생식에 허위로 수 있습니다 매우 높습니다. C. 선 충 성인 남녀 추 니 두 생식 팔, 각각의 집 체세포 원심 끝 셀 (DTC)는 미 분화 상태^3,4원심 세균 세포를 유지 하는. 이 세균 세포 차별화 영향력, 탈출 DTC에서 이동 하는 시작 되 고 해지고 oocytes 정자로는 생식의 근 위 끝에 도달. 이 과정 동안, 생식 세포 핵 유사 분열, 감수 분열^5,6에 전환 하기 전에 받아야. 정자 생산 후 oocytes는 성인 기 동안 생산 개발의 애벌레 단계 4 (L4)에 의해 완료 된다. 정자는 어디 그들은 비 옥 하 게 배아를 생성 하기 위해 oocytes spermatheca에 저장 됩니다.

핵의 수, apoptotic 이벤트, 염색체 역학, 고 단백질 식 및 지역화^{7 수에 변화 결과로 C. 선 충 에서 생식 개발에 영향을 미칠 수 있는 여러 유전과 환경 요인이 있다 ,,89,,1011}. 이러한 이벤트의 분석 핵 형태와 분포에 따라 차별화의 각 단계의 식별을 해야 합니다. 큰 샘플 크기와 수동으로 이러한 매개 변수를 정확 하 게 분석 이며 노동 집약적인 시간이 걸리는. 이러한 단점을 우회 하 고 분석의 일관성 있도록, 우리 세 핵, 핵 배포, 단백질 표정, 선 충 C. 생식의 3 차원 검사를 위한 자동화 된 방법을 개발 및 cytoskeletal 구조입니다. 3 차원 렌더링 confocal 현미경 검사 법을 결합 하 여 세균 세포 분화의 단계 각의 식별에 대 한 크기와 모양 매개 변수를 생성 했습니다. 또한,이 메서드는 생식 세포 핵과 정자의 세 플러스 각 oocyte에서 염색체 수의 득점 수 있습니다.

1 개의 중요 한 구조는 생식 생식 구획, 에이즈 세포질 스트리밍 및 생식 핵¹²보호 안정성을 제공 하는 골격 이다. 전산 렌더링을 사용 하 여, 우리는 생식 세포 골격의 3 차원 재구성을 수행 하 고 뚜렷한 cytoskeletal는 생식 기능을 식별. 여기, 우리가 어떻게 계산 분석 confocal 이미징 수 있도록 포괄적인 분석 C. 선 충 생식의 결합을 설명 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.

C. 선 충 의 생식 (그림 1)의 3 차원 분석을 위한 빠른 방법을 제안 한다. 3 차원 분석을 사용 하 여, 그것은 셀 (그림 2), 생식 세포 골격 ( 의 개조의 자동화 (그림 2 및 그림 3), 생식 핵의 3 차원 분포 계산 공부 가능 그림 3), 단백질 (그림 4), 그리고 점수는 spermatheca에 정자와 oocytes (그림 5)에서 염색체의 수의. 메서드는 생식의 쉽고 정확한 정량화를 가능 하 게 뿐만 아니라 생리 적으로 관련 된 고기를 식별.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

1. 준비 및 웜 농업

참고: 모든 제품 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.

1. OP50 대장균 문화: Lysogeny 국물 (파운드) (1% tryptone 0.5% 효 모, 0.5 %NaCl, pH 7.0) 항생제 없이 37 ° C에서 하룻밤에 OP50 박테리아 문화.
2. 선 충 류 성장 미디어 (NGM) 판 (1.5 g의 NaCl, 한 천, 펩, 1 M CaCl₂, 에탄올, 1 M MgSO₄ 의 1 mL에에서 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL의 1 mL의 1.25 g의 8.5 g OP50 박테리아의 400 µ L 씨 고 1 M KPO₄ 버퍼의 25 mL)와 공기 건조 48 h에 대 한 박테리아.
3. 시드 NGM 접시에 벌레를 선택 하 고 15 ° C 또는 20 ° C에서 품 어
   1. 성인 자웅 동체 생식의 분석을 위해 잘 먹이 L4 벌레 세균 잔디를 선택 하 고 20 ° c.에서 밤새 품 어
   2. 광고에 나온 것에 정자 수를 점수, 12 h 20 ° C에서 L4 벌레 벌레 L4/성인 탈피에 도달할 때까지 품 어. 동기화 하려면 L4 단계에 벌레, 표 백제 솔루션 (1 M NaOH와 1:1 비율에서 표 백제) 계란의 많은 성인 벌레를 수확 하 여 계란을 준비 합니다. 계란 해치 고 L4 동물 실험에 대 한 선택 수 있습니다.
4. 슬라이드에서 폴 리-L-리 신 솔루션의 25 µ L를 놓고 피 펫 팁을 사용 하 여 솔루션 잘, 확산 테 플 론 현미경 슬라이드를 준비 합니다. 초과 폴 리-L-리 신 종이 타월로 제거 후 건조 한 공기를 품 어 15-20 분 동안 65 ° C에서 슬라이드 슬라이드 수 있습니다.

2. 생식 해 부와 얼룩^6,13

1. 10 µ L 22 × 22mm coverslip에 0.01 %tetramisole (마 취)의 자리 고 그것으로 한-하루 오래 된 성인 벌레를 선택 합니다.
2. (5 mL) 주사기 및 바늘 (24 "x 1")를 사용 하 여 진정 된다 그것으로 꼬리에 벌레를 해 부하 고는 생식 손상 되지 않은 확인 합니다.
   주: 해 부 웜은 웜 및 웜 움직임에 부정적인 압력은 생식의 방출 원조를 마비 완전히 된다 전에 밖으로 실행 되어야 한다. 정자, 득점을 위한 해야 합니다 주의 spermatheca 손상 않기로 바늘에 의해 해 부 동안. spermatheca 후 절 개 포인트를 제외 하 고 바늘으로는 생식을 만지지 마십시오. 생식 구획에 휴식 또는 어떤 방전은 생식에서 관찰, 경우는 생식 분석을 위해 사용할 수 없습니다 한다.
3. 폴 리-L-리 신 코팅된 슬라이드, 슬라이드에 해 부 생식 유지에 거꾸로 coverslip를 놓습니다.
4. 1 분 빠르게 바늘을 사용 하 여 슬라이드에 germlines와 함께 하는 coverslip 제거 위해 액체 질소에 coverslip, 다음 장소 슬라이드의 모서리에 종이 타워를 배치 하 여는 coverslip에서 과잉 액체를 제거 합니다.
5. 슬라이드는 챔버에 30-60 s-20 ° C 메탄올으로 전송 다음 갓된 고정 솔루션 (버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 포함 0.08 M HEPES pH 6.9, 1.6 m m MgSO₄, 0.8 m m 에틸렌 글리콜-bis(beta-aminoethyl x 1에서에서 30 분 동안 품 어 에테르)-N, N, N', N'-tetraacetic (EGTA), 산과 3.7 %paraformaldehyde) 실내 온도에.
6. 1 x PBS, pH 7.4 포함 된 챔버에 배치 하 여 슬라이드를 씻어 0.1 %10 분에 대 한 트윈-20이 단계를 반복이 한 번.
7. 차단 솔루션 차단 30 µ L로 germlines (염소 혈 청의 1700 µ L에서 염소 혈 청의 900 µ L을 추가 하 여 준비의 30 %h 조₂O를 증 류와 10 x PBS의 300 µ L) 30 분 동안 실내 온도에 플라스틱 상자에 젖은 종이 수건을 배치 하 여 준비 하는 습 한 실에.
8. REC-8 항 체 솔루션 각 샘플 비율 1:300에 30% 염소 혈 청에서 준비의 50 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에서 밤새 품 어
9. 슬라이드를 씻어 0.1 %1 x PBS를 포함 하는 챔버에 배치 하 여 10 분에 대 한 트윈-20 단계를 한 번 반복 하 고 슬라이드의 모서리에 종이 타월을 배치 하 여 과잉 액체를 제거.
10. 30% 정상 염소 혈 청에서 녹색 fluorophore (488 nm 방출 파장) 활용된 2 차 항 체 (1:1000), phalloidin (말라 얼룩, 1:4000), 및 (DNA 얼룩, 1:4000) DAPI를 diluting 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다.
11. 슬라이드에 이차 항 체 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.
12. 실 온에서 1 h에 품 어.
13. 슬라이드를 씻어 두 번 0.1 %1 x PBS를 포함 하는 챔버에 배치 하 여 10 분에 대 한 트윈-20 초과 액체 닦아.
14. 고정 슬라이드에 시 약 30 µ L을 추가 하 고 1.5 µ m coverslip x 12 m m² 위에 놓고 하룻밤 4 ° C에서 슬라이드를 건조.

3. confocal 현미경 검사 법

1. Confocal 현미경, 레이저, 공명 스캐너 및 confocal 현미경 소프트웨어 설정. 63 X 목표 위에 슬라이드 홀더에 얼룩진된 germlines와 슬라이드를 놓습니다.
2. 생식, 포커스는 생식 상단 찾아서 confocal 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 표시 합니다. 비슷하게는 생식의 하단에 집중 하 고 총 생식 두께 설정 표시.
3. 0.5 µ m. 마크 완전 한 생식 그리고 시작 인수까지 각 슬라이스의 두께 정의 하 여 전체 생식 이미지. 각 슬라이스 8 번 스캔 하 고 이미지 품질을 개선 하기 위해 값을 평균. 공명 스캐너 이미징 동안 표백 방지 하려면 빠른 검색 허용 됩니다. 만약 현미경 공명 스캐너, 표백을 피하기 위해 4 검사의 수를 줄일 수는 없습니다.

4. 게시물 이미징 분석 핵의 수와 분포

참고: 소프트웨어 도구와 사용 하는 버튼의 스크린샷을 위한 보충 그림 1 을 참조 하십시오.

1. 8.4.1 Imaris 또는 소프트웨어의 이미지를 가져옵니다.
2. 각 지역에서 핵 형태를 식별 하 여 mitotic 지역, 전이 영역, meiotic 지역, oocyte 지역, 그리고 spermatheca는 생식의 정의.
3. 소프트웨어의 표면 기능 버튼 (보충 그림 1A)를 사용 하 여 관심 영역을 선택 합니다.
4. 자동 표면 생성 마법사를 취소 하 고 수동으로 3 차원 스택에서 이미지의 첫 번째 및 마지막 조각에서 관심 영역을 그립니다.
5. 만들기 화면을 클릭 합니다.
   참고: 소프트웨어를 자동으로 첫 번째 및 마지막 스택 간의 스택을 개발할 것입니다.
6. DAPI 제외 하 고 모든 채널 마스크 채널 버튼 (보충 그림 1B-C)를 클릭 하 여 마스크.
7. 자리 기능 버튼 (보충 그림 1A)를 사용 하 여 핵 크기 매개 변수를 정의 합니다. Mitotic 지역에 대 한 Z 직경 정의 하면서 2 µ m의 XY 직경을 정의 합니다. 전환 영역에 대 한로 1.5 µ m. (보충 그림 1D) 2 µ m의 XY 직경 및 Z 직경을 정의 합니다.
   참고: 확대 및 현미경의 사양에 따라 직경을 해결 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 사용 하는 목적은 63 X 되었고 추가 이미징 동안 1.70 배 확대를 제공. 목표 변경, 예를 들어 40 X, 직경 적절 하 게 변경 한다. 올바른 매개 변수를 설정 하려면 wildtype germlines와 문제 해결을 수행 합니다. 야생 유형 생식 팔의 mitotic 지역은 약 250 핵 있다. 지름이이 값을 달성 하도록 수정 한다. 적어도 15 germlines를 사용 하 여 직경에 대 한 최적의 값을 확인 하. 이와 비슷한 방식은 전환 영역 (150-170 핵)와 meiotic 지역 (600-700 핵) 보정을 위해 사용 되어야 한다.
8. 최소 임계값 (보충 그림 1E)를 정의 하 여 관광 명소의 검색을 제한 합니다. DAPI를 사용 하 여 첫 번째 자리는 생식 외부 표시 될 때까지 최소 3 차원 렌더링 임계값을 늘려 최소 임계값을 설정 하는 야생 타입 germlines 스테인드.
9. 이미지를 저장 하 고 소프트웨어에 의해 자동으로 생성 하는 테이블에서 핵의 수를 얻을. TIF 파일로 이미지를 내보냅니다.

5. 게시물 점수 정자 염색체 수에 대 한 분석 영상

1. 관심 영역으로는 spermatheca를 선택 하 여 3 차원 렌더링을 수행 합니다. 각 정자를 감지, 0.75-사이 반점 직경 정의 1.0 µ m x 및 Y 축, Z 지름은 정의 되지 않은 유지 하는 동안. 관광 명소 기능 버튼을 사용 하 여 보충 그림 1에서 보듯이.
2. 백그라운드 체크 함으로써 배경 빼기 빼기 상자 및 배경 보정 값 (보충 그림 1D) 소프트웨어에 의해 계산을 사용 하 여.
   참고: Imaris 소프트웨어 추천 강도 높은 포인트 먼저, 따라서 배경 효과 최소한의 상당한 차이가 관심 영역 및 배경으로. 두 번째 방법은 이다 배경에 대 한 배경 보정을 수동으로 정의 적절 한 값을 지정할 수 있습니다. 수동 배경 교정 독립적인 샘플의 강도 비교를 요구 하는 경우 적절 한 될 것입니다.
3. Spermatheca (보충 그림 1E)에서 모든 DAPI 스테인드 정자를 검출 하기 위하여 3 차원 렌더링 임계값을 조정 합니다.
4. 염색체, 계산에 대 한 정의 자리 직경 < x 0.75 µ m 및 Y-축 3 차원 모델을 개발 하기 전에.
5. 이미지를 저장 하 고 TIF 파일로 내보내기.

6. 포스트는 생식의 Cytoskeletal 재건에 대 한 분석 영상

1. 생식에 관심 영역을 식별 하 고 phalloidin 제외 하 고 모든 채널을 채널 마스크 버튼을 클릭 하 여 마스크.
2. 표면 기능 버튼 (보충 그림 1)를 사용 하 여 0.25 µ m의 표면 세부 정보를 정의 합니다.
   참고:이 모든 0.25 µ m으로 3 차원 모델 렌더링 됩니다 의미 합니다. 표면 디테일 3 차원 표면 모델 마다 0.25 µ m에 대 한 생성 하는 것입니다 어디는 생식의 모든 지역에 대 한 일정 수 있습니다. 그러나, oocyte 지역에 대 한 표면 세부 수 수 증가 0.35-0.5 µ m이이 지역에서 잘 정의 된 걸 섬유의 존재 때문.
3. 백그라운드 체크 함으로써 배경 빼기 빼기 상자 및 배경 보정 값 (보충 그림 1D) 소프트웨어에 의해 계산을 사용 하 여.
4. 분석 (보충 그림 1E)을 필요로 하는 구조에 따라 3 차원 렌더링 임계값을 조정 합니다.
5. 개발 된 3 차원 이미지를 저장 하 고는 TIF 파일로 내보내기.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

그림 1 3 차원 생식 분석에 필요한 시간을 나타냅니다. 20 ° C에서 incubated L4 광고에 나온 것 germlines를 분리 해 부 되었고 DAPI, phalloidin, 및 생식 단백질에 대 한 항 체와 스테인드. Germlines는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 얼룩 그리고 confocal 현미경 검사 법 완전 한 생식 필요 수 핵의 위치를 계산, 단백질 분포를 식별, 분석 cytoskeletal 구조?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

이 프로토콜의 목표는 정확도 개선 하 고 생식 분석에 필요한 시간을 줄일 것입니다. 준비 후에 표준 해 부 germlines의, 생식 핵의 3 차원 모델 렌더링 계산에 의해 준비 된다. 공간에 생식 핵 분포의 관찰 하면서 3 차원 렌더링은 생식의 특정 지역에서 핵의 수를 계산 합니다. 우리의 방법의 중요 한 측면 핵의 크기와 모양 매개 변수의 정확한 정의 이다. 이 얼룩이 지 고 사용 확대의 선명도에 따라 이...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli bacteria	Homemade
Nematode Growth Media (NGM) plates	Homemade
polyclonal rabbit anti-REC-8	SDIX	29470002
Alexa 488 conjugated antibody raised in goat	Thermofisher Scientific	A-21236
Cytoskeletal dye phalloidin	Thermofisher Scientific	A-12380
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P5899
Tetramisol	Sigma Aldrich	P5899
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506
1M HEPES buffer, pH 7.4	Sigma Aldrich	G0887
10X PBS pH 7.4	Thermofisher Scientific	AM9625
Tween-20	Sigma Aldrich	P1389
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
37% Paraformaldehyde solution	Merck Millipore	1040031000
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Fluoroshield fixing reagent	Sigma Aldrich	F6182
Ethanol	Millipore	1009832511
Methanol	Sigma Aldrich	34860
20°C & 25°CIncubator	Any brand
Light microscope	Any brand
Confocal microscope	Any brand (Leica, Zeiss)
Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.	Bitplane
Phospho buffered saline, pH 7.4	Homemade
Teflon microscope slides	Tekdon	941-322-8288