JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем автоматизированный метод для трехмерной реконструкции Caenorhabditis elegans микрофлорой. Наш метод определяет количество и положение каждого ядра в микрофлорой и анализ распределения белка микрофлорой и цитоскелета структуру.

Аннотация

Caenorhabditis elegans (C. elegans) микрофлорой используется для изучения нескольких биологически важные процессы, включая динамики развития, апоптоз и хромосомы стволовых клеток. В то время как микрофлорой является прекрасной моделью, анализ часто является двух измерениях благодаря времени и труда, необходимых для трехмерного анализа. Основные надписи в такие исследования являются положение/число ядер и белка распределения в рамках микрофлорой. Здесь мы представляем метод для выполнения автоматизированного анализа микрофлорой, используя confocal микроскопии и вычислительных подходов для определения количество и положение ядер в каждом регионе микрофлорой. Наш метод также анализирует распределение белка микрофлорой, который позволяет трехмерной изучение экспрессии белков в различных генетических стола. Кроме того наше исследование показывает вариации в цитоскелета архитектуры в отдельных регионах микрофлорой, который может вместить требованиями пространственного развития. Наконец наш метод позволяет автоматического подсчета спермы в сперматека каждого микрофлорой. Взятые вместе, наш метод позволяет быстрое и воспроизводимые фенотипические анализ C. elegans микрофлорой.

Введение

Сохранению сигнальные пути с mammals делает C. elegans отличную модель для изучения нескольких биологических процессов1,2. В нашей лаборатории мы используем микрофлорой C. elegans для изучения развития стволовых клеток, апоптоз и экспрессии генов. В то время как микрофлорой трехмерную структуру, многие исследования являются двумя размерные связи с длительным и трудоемким характером трехмерного анализа. Это весьма вероятно, что двумерный анализ может искажать в vivo события в микрофлорой. Взрослый гермафродита C. elegans имеет две руки микрофлорой, каждая из которых дома соматических дистального наконечника клеток (DTC), которая поддерживает дистальной клетки семенозачатка в недифференцированных государства3,4. Эти клетки семенозачатка начинают различать как они движутся от MS DTC, избежать его влияния и стать яйцеклеток и сперматозоидов, как они достигают проксимальный конец микрофлорой. В ходе этого процесса ядра зародышевых клеток проходят митоз, перед переходом к мейоз5,6. Производство спермы дополняется личиночной стадии 4 (L4) разработки, после чего ооциты производятся во взрослом возрасте. Сперматозоиды хранятся в сперматека, где они оплодотворить яйцеклетки для создания эмбрионов.

Существует несколько генетических и экологических факторов, которые могут влиять на развитие микрофлорой в C. elegans повлекло изменения в количество ядер, количество apoptotic события, хромосома динамики и выражение протеина или локализации7 ,8,9,10,11. Анализ этих событий требует идентификации каждого этапа дифференциация, основанная на ядерное Словотолкование и распределения. Чтобы точно анализировать эти параметры вручную с большой выборки является трудоемким и длительным. Чтобы обойти эти недостатки и включить последовательность анализа, мы разработали автоматизированный метод для трехмерных экспертизы микрофлорой C. elegans для подсчета ядер, распределение ядер, выражение протеина и цитоскелета структура. Объединив конфокальная микроскопия с трехмерной визуализации, мы создали параметры размера и формы для идентификации каждой стадии дифференцировки клеток зародыша. Кроме того этот метод позволяет подсчета ядра зародышевых клеток и спермы плюс озвучивание число хромосом в каждой ооцитов.

Один из важнейших структура в микрофлорой является цитоскелета, который обеспечивает стабильность микрофлорой отсека, СПИД цитоплазматических потокового и защиту микрофлорой ядер12. Использование компьютерной визуализации, мы выступали трехмерной реконструкции цитоскелета микрофлорой и выявленных особенностей цитоскелета внутри микрофлорой. Здесь мы опишем пошаговое протокол для иллюстрации как Вычислительный анализ в сочетании с конфокальный изображений включает всесторонний анализ C. elegans микрофлорой.

Мы предлагаем быстрый метод для трехмерного анализа C. elegans микрофлорой (рис. 1). Использование трехмерного анализа, это возможно для изучения трехмерной распределение ядер микрофлорой (рис. 2 и рис. 3), автоматизированные подсчет клеток (рис. 2), реконструкция микрофлорой цитоскелета ( Рисунок 3), распределение белков (рис. 4) и забил количество спермы в сперматека и хромосом яйцеклетки (рис. 5). Метод не только позволяет легко и точная количественная оценка микрофлорой, но идентифицирует физиологически соответствующих фенотипов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка и червь животноводства

Примечание: Приведена Таблица материалов для сведения о продукте.

  1. ОР50 Escherichia coli Культура: культура бактерий ОР50 в бульоне (LB) (1% Триптон, 0,5% дрожжей, 0,5% NaCl, рН 7,0) Lysogeny на ночь при 37 ° C без антибиотиков.
  2. Семя 400 мкл ОР50 бактерий к нематоде роста СМИ (НГМ) пластины (1,5 г NaCl, 8,5 г агара, 1,25 г Пептон, 1 мл 1 М CaCl2, 1 мл 5 мг/мл холестерина в этаноле, 1 мл 1 М MgSO4 и 25 мл 1 М КПО4 буфера) и высушите на воздухе бактерии в течение 48 часов.
  3. Выберите червей в сеяный NGM пластины и Инкубируйте на 15 ° С или 20 ° C.
    1. Для анализа взрослых Гермафродит микрофлорой выбрать сытых L4 червей на бактериальных газон и инкубировать на ночь при 20 ° C.
    2. Для озвучивания число сперматозоидов в гермафродитки, Инкубируйте L4 червей при 20 ° C в течение 12 ч до линьки L4/взрослых червей. Для синхронизации червей на сцену L4, готовить яйца, выбирая взрослых червей с большим количеством яиц в раствор отбеливателя (1 M NaOH и отбеливатель в соотношении 1:1). Разрешить яйца люк и выбрать L4 животных для эксперимента.
  4. Подготовьте тефлон Микроскоп слайды, поместив 25 мкл раствора поли L-лизин на слайде и распространяя решение, с помощью кончика пипетки. После удаления избыточных поли L-лизин с бумажным полотенцем, позволяют слайды в воздух сухой и инкубировать слайды при температуре 65 ° C для 15-20 мин.

2. микрофлорой диссекции и окрашивание6,13

  1. Spot 10 мкл 0,01% Тэтрамизол (обезболивающий) на coverslip 22 × 22 мм и выбрать один - день-старый взрослых червей в нее.
  2. Вскрыть червя на хвост, как он становится седативные, с помощью шприца (5 мл) и иглы (24 "x 1") и убедитесь, что микрофлорой не поврежден.
    Примечание: Анатомирование должна осуществляться до того, как червь становится полностью парализована, так что отрицательное давление в червь и червь движение помощи отстрела микрофлорой. Для озвучивания спермы, должны приниматься меры предосторожности чтобы не повредить сперматека иглой во время вскрытия. Не прикасайтесь микрофлорой с иглой, за исключением точки рассечение после сперматека. Если разбить в отсеке микрофлорой или наблюдается каких-либо выделений из микрофлорой, микрофлорой не должны использоваться для анализа.
  3. Перевернутый coverslip место на слайде с покрытием поли L-лизин, сохраняя расчлененных микрофлорой на слайде.
  4. Удалите лишнюю жидкость под coverslip, поместив бумага башня на углу coverslip, а затем место слайда в жидком азоте, за 1 мин быстро удалить coverslip, с помощью иглы с germlines на слайде.
  5. Перенести слайды в метанол-20 ° C за 30-60 s в камере, а затем Инкубируйте 30 мин в свежеприготовленные Фиксирующий раствор (1 x фосфатного буфера физиологический (PBS) содержащий 0,08 М HEPES рН 6,9, 1,6 мм MgSO4, этиленгликоля 0,8 мм-bis(beta-aminoethyl эфир)-N, N, N', N'-tetraacetic кислота (EGTA) и 3,7% параформальдегида) при комнатной температуре.
  6. Вымойте слайды, поместив в камере, содержащей ПБС, рН 7,4 с 0,1% Tween-20 за 10 мин повторить этот шаг один раз.
  7. Блок germlines с 30 мкл преграждая разрешение (30% козьего сыворотки, подготовленного добавления 900 мкл козьего сыворотки в 1700 мкл дистиллированной H2O и 300 мкл 10 x PBS) в камере влажный, подготовленный размещения влажной салфеткой в пластиковой коробке при комнатной температуре за 30 мин.
  8. Добавьте 50 мкл раствор антител REC-8, подготовленный в 30% козьего сыворотки в соотношении 1: 300 для каждого образца. Инкубируйте на ночь при 4° C.
  9. Вымойте слайды, поместив в камере, содержащей ПБС с 0.1% Tween-20 за 10 минут повторите шаг один раз и Удалите лишнюю жидкость, поместив бумажным полотенцем на углу слайда.
  10. Готовят раствор вторичные антитела путем разбавления конъюгированных вторичное антитело зеленый Флюорофор (длина волны излучения 488 нм) (1: 1000), Фаллоидин (актина пятно, 1: 4000) и DAPI (ДНК пятно, 1: 4000) в сыворотке нормальный коза 30%.
  11. Добавьте 50 мкл раствора вторичного антитела к слайду.
  12. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре.
  13. Вымойте слайды дважды, поместив в камере, содержащей ПБС с 0.1% Tween-20 за 10 мин стереть избыток жидкости.
  14. 30 мкл фиксации реагента на слайд и место 12 мм2 x 1,5 мкм coverslip на вершине и сухой слайды при температуре 4 ° C на ночь.

3. конфокальная микроскопия

  1. Включите конфокального микроскопа, лазеры, резонансные сканера и программного обеспечения конфокального микроскопа. Поместите слайды с окрашенных germlines слайд держатель выше 63 X цель.
  2. Найдите микрофлорой, фокус на вершине микрофлорой и пометить его с помощью программного обеспечения конфокального микроскопа. Аналогичным образом сосредоточить внимание на нижней части микрофлорой и пометить его чтобы установить толщину всего микрофлорой.
  3. Изображение всей микрофлорой, определив толщину каждого фрагмента до 0,5 мкм. Марк полный микрофлорой и начать приобретение. Проверять каждый ломтик 8 раз и средние значения для улучшения качества изображения. Резонансный сканер позволит быстрого сканирования во избежание обесцвечивания во время визуализации. Если микроскоп имеет резонансный сканер, уменьшить количество сканов до четырех во избежание обесцвечивания.

4. пост изображений анализ ядер количество и распределение

Примечание: Обратитесь дополнительное рисунок 1 скриншоты программных инструментов и кнопок.

  1. Импорт изображения Imaris 8.4.1 или более поздних версий программного обеспечения.
  2. Определите митотическая, переходная зона, meiotic региона, регионом ооцитов и сперматека микрофлорой путем выявления Ядерное словотолкование в каждом регионе.
  3. Используйте кнопку поверхности функции (Дополнительные рис. 1A) программного обеспечения для выбора региона интерес.
  4. Отмените мастер автоматического создания поверхности и вручную рисовать области интереса в первый и последний фрагмент изображения из трехмерного стека.
  5. Нажмите кнопку создать поверхность.
    Примечание: Программное обеспечение будет автоматически развивать стеки между первым и последним стека.
  6. Все каналы за исключением DAPI маски, нажав кнопку канал маски (Дополнительный Рисунок 1B-C).
  7. Определите параметры ядерных размер, используя кнопку пятно функции (Дополнительные рис. 1A). Митотическая региона Определите диаметр XY 2 мкм оставляя Z диаметр неопределенные. Для переходной зоне определите XY 2 мкм и Z диаметром 1,5 мкм. (дополнительная цифра 1 d).
    Примечание: Устранение диаметров согласно масштаб и характеристики микроскопа. Для текущего протокола цель используется был 63 X и предоставляет дополнительную 1,70 кратном во время визуализации. Если цель изменения, например 40 X, диаметры следует изменить соответственно. Устранение неполадок следует выполнять с wildtype germlines установить правильные параметры. Митотическая регион руку микрофлорой дикого типа имеет около 250 ядер. Диаметр должен быть изменен для достижения этого значения. Используйте по крайней мере 15 germlines чтобы определить оптимальное значение для диаметра. Аналогичный подход должен использоваться для калибровки переходной зоны (150-170 ядер) и meiotic региона (600-700 ядер).
  8. Ограничьте обнаружения пятен, определив минимальный порог (дополнительная цифра 1E). Использование DAPI витражи дикого типа germlines для установления минимального порога, увеличив минимальный трехмерного рендеринга порог до тех пор, пока первый пятно появляется за пределами микрофлорой.
  9. Сохраните изображение и получить количество ядер из таблицы автоматически генерируемых программного обеспечения. Экспорт изображения как TIF файлов.

5. размещать изображения анализ для озвучивания спермы и число хромосом

  1. Выполните трехмерные визуализации, выбрав сперматека как области интереса. Чтобы обнаружить каждый спермы, определить диаметр пятна между 0,75 - 1,0 мкм для X и Y-оси, в то время как Z диаметр остается неопределенным. Используйте кнопку функции пятна, как показано на рисунке 1 дополнительный.
  2. Вычитание фона путем тикать фон вычесть коробке и с использованием фоновых значений коррекции рассчитывается путем программного обеспечения (дополнительная цифра 1 d).
    Примечание: Imaris программного обеспечения сначала выбирает высокой интенсивности точек, поэтому эффект фон минимально, пока существует значительная разница между области интереса и фон. Второй метод — вручную определить коррекция фона, где соответствующие значения могут быть предоставлены для фона. Ручной фоновая поправка будет целесообразно, если интенсивность независимых выборок сравнения.
  3. Отрегулируйте порог трехмерного рендеринга для выявления всех DAPI окрашенных спермы в сперматека (дополнительная цифра 1E).
  4. Для подсчета хромосомы, определить диаметр пятна < 0,75 мкм для X и Y-оси до разработки трехмерных моделей.
  5. Сохраните изображение и экспортировать в формате TIF.

6. пост изображений анализ цитоскелета реконструкции микрофлорой

  1. Определить области интереса в микрофлорой и маскировать все каналы за исключением Фаллоидин, нажав кнопку Скрыть каналы .
  2. Определите детали поверхности 0,25 мкм, используя кнопку поверхности функции (Дополнительные рис. 1).
    Примечание: Это означает, что каждый 0,25 мкм будет оказываться в трехмерных моделей. Детали поверхности может быть постоянными для любого региона микрофлорой, где модель трехмерной поверхности будет создаваться для каждого 0,25 мкм. Однако, для региона ооцитов, детали поверхности может быть увеличена до 0,35 - 0,5 мкм из-за наличия четко определенных актина волокон в этом регионе.
  3. Вычитание фона путем тикать фон вычесть коробке и с использованием фоновых значений коррекции рассчитывается путем программного обеспечения (дополнительная цифра 1 d).
  4. Настройка порога трехмерной визуализации в зависимости от структуры, требующих анализа (дополнительная цифра 1E).
  5. Сохранить развитых трехмерное изображение и экспортировать в формате TIF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Рисунок 1 показывает время, необходимое для анализа трехмерных микрофлорой. Гермафродитки L4, инкубировали при 20 ° C были расчленены изолировать germlines и витражи с DAPI, Фаллоидин и антитела против белков микрофлорой. Germlines отражаются с помощью конфокальной...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Цель настоящего Протокола заключается в улучшить точность и сократить время, необходимое для анализа микрофлорой. После стандартной подготовки расчлененных germlines трехмерную модель микрофлорой ядер подготовленный компьютерной визуализации. Позволяя наблюдения пространственного ра?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Monash Microimaging за их техническую поддержку. Некоторые штаммы были предоставлены центром генетики Caenorhabditis , который финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Эта работа была поддержана Монаш Университета биомедицины Discovery Стипендия, Грант проекта NHMRC (GNT1105374), NHMRC старший стипендий (GNT1137645) и Вески инноваций стипендий: 23 ВИФ-Роджер Покок.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli bacteriaHomemade
Nematode Growth Media (NGM) platesHomemade
polyclonal rabbit anti-REC-8 SDIX29470002
Alexa 488 conjugated antibody raised in goatThermofisher ScientificA-21236
Cytoskeletal dye phalloidin Thermofisher ScientificA-12380
DAPI Thermofisher Scientific 62248
Poly-L-lysine Sigma AldrichP5899
Tetramisol Sigma AldrichP5899
MgSO4Sigma AldrichM7506
1M HEPES buffer, pH 7.4 Sigma AldrichG0887
10X PBS pH 7.4 Thermofisher ScientificAM9625
Tween-20 Sigma AldrichP1389
EGTASigma AldrichE3889
37% Paraformaldehyde solutionMerck Millipore1040031000
Normal goat serumSigma AldrichG9023
Fluoroshield fixing reagent Sigma AldrichF6182
Ethanol Millipore 1009832511
MethanolSigma Aldrich34860
20°C & 25°CIncubator Any brand
Light microscopeAny brand
Confocal microscope  Any brand (Leica, Zeiss)
Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.Bitplane
Phospho buffered saline, pH 7.4Homemade
Teflon microscope slides Tekdon  941-322-8288

Ссылки

  1. Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
  2. Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
  3. Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
  4. Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372(2014).
  5. Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
  6. Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
  7. Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
  8. Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).
  9. Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
  10. McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338(2012).
  11. Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
  12. Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
  13. Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
  14. Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
  15. Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
  16. Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
  17. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).
  18. Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
  19. Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
  20. Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
  21. Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

134C elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены