Medição de temperatura de corpo do mouse usando o termômetro infravermelho durante passiva anafilaxia sistêmica e avaliação de alergia alimentar

Resumo

Aqui nós apresentamos um novo método para medir com precisão as diferenças de temperatura de corpo em anafilaxia sistêmica passiva (PSA) e modelos de rato de alergia alimentar usando um termômetro infravermelho. Este procedimento tem sido duplicado com precisão em resultados anteriores de PSA.

Resumo

Medição de temperatura de corpo do mouse é de suma importância para a investigação de alergias e sintomas de choque anafiláticas. Sondas retais para leituras de temperatura é comum, e eles têm provados ser precisos e inestimável a este respeito. No entanto, este método de medição da temperatura requer os ratos a ser anestesiada para inserir a sonda sem prejuízo para o animal. Isso limita a capacidade de observar outros fenótipos do mouse simultaneamente. A fim de investigar outros fenótipos durante a medição de temperaturas, sondas retais não são ideais, e um outro método é desejado. Aqui, apresentamos um método não invasivo de medição de temperatura que incorra a exigência de anestesia do mouse, mantendo a confiabilidade igual a sondas retais em medir a temperatura do corpo. Nós usamos um termômetro infravermelho que detecta as temperaturas de superfície de corpo em intervalos entre 2 e 150 mm. Este método de medição de temperatura do corpo é bem sucedido em confiantemente, replicando as tendências de mudança de temperatura durante experimentos de anafilaxia sistema passivo em camundongos. Nós mostramos que as temperaturas de superfície do corpo são aproximadamente 2,0 ° C inferior a medições da sonda retal, mas o grau de queda de temperatura segue a mesma tendência. Além disso, podemos usar a mesma técnica para observar ratos em um modelo de alergia alimentar para avaliar os níveis de temperatura e atividade simultaneamente.

Introdução

Medição da temperatura corporal tem sido uma parte essencial de monitorar os efeitos dos sintomas de choque anafiláticas em animal modelos^1,2. Diferenças de temperatura tem sido tradicionalmente medidas pelo termômetros retal em ratos^3,4. Com estas medidas, investigadores confiantemente tem retratado as diferenças de temperatura entre variáveis; no entanto, esse método é um procedimento demorado e faz com que a aflição de ratos, que podem aumentar a temperatura do corpo. Sondagem retal também pode causar na mucosa rasgando e infecção³. Além disso, os ratos devem ser anestesiados para humanamente inserir a sonda rectal para medir a temperatura³. Este é um processo lento, e proíbe a medição das temperaturas sucessivas dentro de um curto período de tempo. Além disso, fenótipos de atividade de ratos não podem ser observados durante esse tempo, até que o anestésico é completamente desgastado, que é outro processo demorado. Mais recentemente, outros métodos confiáveis para medir a temperatura do corpo tem usado implantado subcutaneamente transmissor infravermelho passivo tags ou transmissores de rádio que incluem uma temperatura sensor^3,5,6. Embora eles são aceitos como a prática ideal por alguns pesquisadores, esses métodos não são amplamente utilizados por causa de altos custos iniciais e angústia aos ratos, devido a implantação cirúrgica de um sensor de temperatura sob a pele ou outra parte do corpo.

Para demonstrar que uma diferença de temperatura é um reflexo preciso de sintomas em um modelo de doença^1,2, ratos devem ser acordado durante a medição de temperatura e ser capaz de voltar à sua atividade normal fenotípica imediatamente antes e após a medição. Nesse sentido, buscamos um método pelo qual isto poderia ser alcançado.

Nosso objetivo era exatamente e barata medir a temperatura do corpo do mouse, sem a necessidade de anestesia e sem restrições à atividade, para permitir a observação dos fenótipos comportamentais durante e após o tempo de medição de temperatura. Para atingir este objetivo, era evidente que uma técnica menos invasiva do que a temperatura retal padrão sondas foi necessária. Termometros infravermelho têm sido utilizados há décadas na medicina clínica, especialmente em pediatria, para obter leituras precisas da temperatura. Tem sido um método alternativo que permitiu que os clínicos com rapidez e precisão obter medições de temperatura em bebês e crianças exigentes que são ativamente móveis. Estamos implementado essa mesma técnica em ratos e desenvolveu um método bem sucedido para obter temperaturas sem anestesia. Importante, mostramos que esse método é capaz de replicar os resultados de anafilaxia sistêmica passiva bem estabelecida em relação a mudanças de temperatura, enquanto também ser capaz de observar a atividade do mouse durante a medição. Além disso, nós usamos o mesmo método para avaliar a temperatura do corpo dos ratos alimento-alérgica, enquanto simultaneamente investiga outros sintomas, para demonstrar que a temperatura do corpo é de fato um reflexo preciso do nível de atividade e fenótipo geral da rato.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo cuidado Animal e Comissão de utilização do Instituto de La Jolla para alergia e Imunologia.

1. medição de temperatura de corpo Mouse durante Anesthetization

1. Coloque o mouse em uma caixa de indução de anestesia. ANESTHETIZE usando fluxo de 1 L/min de oxigênio com 5% de isoflurano.
   Nota: Anesthetization é confirmada quando o mouse deixa o movimento voluntário e tem estado parado por mais de 30 s. Alternativamente, frequência respiratória de monitor, e uma vez que os ratos estão respirando em 1 respiração por cada 2 s ou mais, anesthetization é confirmada.
2. Segure o mouse pela nuca do pescoço com um dedo indicador e polegar e segurar a cauda com um dedo mindinho para expor a parte inferior do abdome.
3. Coloque o sensor do termômetro infravermelho abaixo do abdômen inferior, mantendo o mouse com o seu corpo paralelo ao chão.
   Nota: A superfície plana externa do termômetro (não a superfície do sensor) deve ser aproximadamente de 2 a 5 mm afastada da superfície do abdômen. Este replicar resultados das temperaturas medidos enquanto ratos não são anestesiados (descrito na secção 2). É importante determinar o local de destino do abdômen. Com o objetivo entre dois bocais superiores permite resultados consistentes.
4. Segure o gatilho para medir a temperatura. Assegure a exploração estável do mouse e termômetro.

2. medição de temperatura de corpo Mouse sem anestesia

1. Pega o mouse no meio da cauda.
2. Expor o abdômen do mouse.
   1. Permitir que o mouse se agarrar a uma superfície de borda reta, tais como o lábio de uma gaiola aberta ou gaiola-top com suas dianteiras.
      Nota: Isto permite que o mouse esticar seu corpo superior e expor o abdome.
   2. Alternativamente, permitir que o mouse segurar a borda reta superior do termómetro e fez com que o rato sente-se sobre a superfície plana exterior do termómetro com seu abdômen apenas sobre o sensor infravermelho.
      Nota: Qualquer tempo que as patas traseiras estão descansando sobre a superfície do termómetro, certifique-se que os pés não estão obstruindo o sensor da superfície abdominal. Termômetros com obstrução de pé vão medir uma temperatura menor do que no abdômen.
3. Segure o gatilho para medir a temperatura.
   Nota: Os ratos tendem a mover-se; Cuide-se em medir o mesmo local do corpo consistentemente por medições de temperatura quando os ratos são relativamente menos móveis.

3. passivo anafilaxia sistêmica⁷

1. Dia 0: Sensibilizar com imunoglobulina E (IgE).
   1. Prepare-se 200 µ l (por rato) de IgE anti-dinitrophenyl (DNP) na concentração de 100 µ g/mL de PBS.
   2. Intraperitonealmente injetar 200 µ l de IgE anti-dinitrophenyl (DNP), preparado na etapa 3.1.1 ou PBS apenas (somente PBS é o controle negativo). Use uma agulha 26G para injeção. Realize as injeções apenas lateral à linha média, aproximadamente entre os dois mamilos mais inferiores.
2. Dia 1: Induzi anafilaxia com DNP-HSA.
   1. Prepare-se 100 µ l (por rato) de DNP-HSA em uma concentração de 10 mg/mL em 0,9% NaCl.
   2. Conforme descrito na etapa 1.1, anestesia os ratos.
   3. Medir a temperatura do corpo, usando a técnica descrita na etapa 1.
   4. Injete por via intravenosa 100 µ l de DNP-HSA preparado no passo 3.2.1. Use uma agulha 30G para injeção. Realize as injeções no seio venoso retroorbital. Introduza a agulha no lado medial do olho em um ângulo raso, visando atrás do olho.
   5. Após a injeção, coloque os ratinhos em gaiolas individuais. Certifique-se de que os ratos se recuperar da anestesia. Observe que eles despertam e se tornam voluntariamente móveis.
   6. Medir a temperatura do corpo com o termômetro infravermelho e observar sua atividade a cada 10min para 70 min.

4. Mouse modelo de alimentos alergia^8,9

Nota: O diagrama esquemático é mostrado na Figura 2.

1. Dia 0: Sensibilizar os ratos com OVA/alum.
   1. Prepare-se 100 µ l (por rato) de óvulos (0,5 mg/mL) e alúmen (10 mg/mL) em PBS. Vórtice na configuração baixa por 30 min.
   2. Conforme descrito na etapa 1.1, anestesia os ratos.
   3. Usando uma agulha 26G, intraperitonealmente injete cada rato com 100 µ l da mistura preparada na etapa 4.1.1 OVA/alum.
      Nota: Vortex novamente, a mistura de OVA/alum brevemente antes de cada injecção, para melhor garantir uma mistura homogeneizada. Consulte a etapa 3.1.3 para obter detalhes sobre o local da injeção.
   4. Após a injeção, coloca ratos em jaulas originais. Certifique-se de que os ratos se recuperar da anestesia. Observe que eles despertam e se tornam voluntariamente móveis.
2. Dia 14: Realize uma segunda sensibilização com OVA/alum.
   1. Repita as etapas 4.1.1, 4.1.2 e 4.1.3.
3. Dias 28-46: desafiar os ratos com óvulos todos os dias.
   1. Prepare-se 100 µ l (por rato) de óvulos em uma concentração de 250 mg/mL em PBS.
      Nota: A mistura deve ser feita pelo agite-o suavemente para frente e para trás com a mão, em vez de com um vortex para minimizar a formação de bolhas.
      1. Se usando inibidores de alergia alimentar, prepare os inibidores⁹. Prepare-se 100 µ l (por rato) de inibidor em uma concentração de 1 mg/mL em PBS. Isto permite uma entrega de 100 µ g de inibidor para cada rato.
         Nota: Não exceda 100 µ l de inibidor por rato, como os ratos só são capazes de lidar com 200 µ l de volume total gavage durante o dia de um desafio. Como 100 µ l são necessários para o desafio de óvulos também, 100 µ l é o máximo recomendado volume para uso de inibidor.
   2. Conforme descrito na etapa 1.1, anestesia os ratos.
   3. Oralmente, gavage cada mouse com 100 µ l da solução de óvulos (25 mg de óvulos em 100 µ l de PBS gavaged por rato) que foi preparado no passo 4.3.1.
      1. Se usando inibidores, utilizam as mesmas técnicas descritas nas etapas a seguir para a gavagem de inibidor (ou controle de PBS) preparado na etapa 4.3.1.1 30 minutos antes do desafio de óvulos. Depois de 30 min, passar para a próxima etapa.
      2. Use uma agulha de gavagem com uma seringa de 1 mL. Ocupam-se 100 µ l de óvulos para a seringa.
      3. Insira a agulha na boca; em seguida, apontando a agulha para o lado esquerdo ou direito da garganta, deslize suavemente a agulha através do esôfago. Injete 100 µ l de óvulos.
         Nota: Para assegurar que a agulha não é na traqueia, observe ativo de respiração antes de injetar os óvulos. A inserção da agulha também ser resistida cedo se tenha formulado a traqueia ao invés do esôfago.
   4. Coloque os ratinhos em gaiolas individuais. Para fácil observação da qualidade do tamborete, use gaiolas sem fundamento.
   5. Garantir a recuperação da anestesia. Observe que os ratos despertam e tornar-se voluntariamente móveis.
   6. Medir a temperatura do corpo dos ratos em momentos de 10, 20, 40 e 60 min usando a técnica descrita na secção 2.

Resultados

Anafilaxia sistêmica passiva: 10 semana para injeção iv, velhos camundongos BALB/c fêmeas foram anestesiados. Antes da injeção, medimos a temperatura do corpo (Video 1) conforme descrito na etapa 1. A Figura 1 mostra a tendência de temperatura de ambas as populações após injeção iv. O rato sensibilizados por IgE, mostrou uma queda de temperatura máxima de 3,0 ° C durante 20 min, enquanto o mouse de controle de PBS teve uma queda...

Discussão

O protocolo descrito foi criado com o objetivo de medir a temperatura do corpo sem o uso de anestesia. Apesar de sua relativa facilidade com que temperatura leituras podem ser obtidas, existem várias advertências que acomodar esta técnica, além dos efeitos mais óbvios como lidar com stress e temperaturas ambientes diferentes.

Primeiro, a fim de manter as leituras de temperatura consistente durante todo o experimento, o local onde a temperatura está sendo medida deve ser predeterminado us...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Non-contact infrared thermometer	SinoPie	DT-8861
Anti-dinitrophenyl (DNP) IgE	Sigma Aldrich	D8406-.2MG
PrecisionGlide 30 G needle	BD	305128
PrecisionGlide 26 G needle	BD	305111
1 mL syringe	BD	309659
Dinitrophenyl - human serum albumin	Biosearch Technologies	D-5059-10
Ovalbumin from chicken egg white	Sigma Aldrich	A5503-50G
Imject Alum	ThermoFisher Scientific	77161
Animal Feeding Needles, disposable	Fisher Scientific	01-208-87