Usando o Clicker formação e observação Social para ensinar ratos para mudar voluntariamente gaiolas

Resumo

Este protocolo introduz um método de mudança de gaiola para ratos através do clicker formação. Ratos aprendem o comportamento desejado, não só pela formação direta, mas também pela aprendizagem observacional. A implementação do presente protocolo de fácil e rápido pode ajudar a melhorar o bem-estar e higiene nas instalações de roedores.

Resumo

Gaiola de limpeza é um procedimento de criação rotineiramente realizada e é conhecida por induzir o estresse em ratos de laboratório. Como o estresse pode ter um impacto negativo sobre o bem-estar e pode afectar a comparabilidade e a reprodutibilidade dos resultados de pesquisa, a quantidade de stress experimentado por animais de laboratório deve ser minimizada e evitada quando possível. Além disso, o contato direto entre o rato e animal caseiro durante a mudança de gaiola carrega riscos de higiene e, portanto, possivelmente negativamente afeta o bem-estar dos ratos e a qualidade da pesquisa.

Nosso protocolo visa melhorar a gaiola rotineiramente realizada, alterando o procedimento. Por este motivo, apresentamos um protocolo viável que permite ratos aprender via clicker formação e observação para mudar voluntariamente para uma gaiola limpa. Esta formação ajuda a reduzir o estresse causado pela perturbação física e manipulação associada a gaiola muda e simultaneamente permite uma redução no contato direto entre o zelador de animal e animal depois de concluída a fase de formação.

A implementação do clicker formação para ratos é rápido e fácil. Ratos são geralmente interessados na formação e aprendem com eficiência o comportamento desejado, o que implica mudanças gaiolas através de uma tubulação. Mesmo sem formação, os ratos aprendem a executar o comportamento desejado pela observação, como 80% do grupo de aprendizagem observacional alterado com êxito gaiolas quando testados. O treinamento mais ajuda para estabelecer uma relação de confiança entre o treinador e o animal. Como higiene e o bem-estar são ambos muito importantes em experiências com animais, este protocolo também pode ajudar a melhorar a pesquisa de alta qualidade.

Introdução

Procedimentos de rotina podem causar estresse no laboratório animais^1,2,3,4. Ficou demonstrado que a mudança de gaiola aumentar parâmetros cardiovasculares e atividade geral em ratos^4,5,6. Tais respostas de estresse podem pelo menos ser parcialmente devido à perturbação física e manipulação associada com gaiola alterar procedimentos em vez do novo ambiente desconhecido^2,4. De particular importância é o efeito negativo do estresse sobre o bem-estar dos animais considerados⁷. Além disso, estresse induz mudanças no comportamento e em outros parâmetros do corpo, incluindo o sistema nervoso autônomo, o sistema neuroendócrino e o sistema imunológico. Portanto, o stress é muitas vezes referida como uma possível fonte de desvios inesperados através das experiências com animais e devem ser evitado tanto quanto possível em pesquisa animal de alta qualidade^7,8. Uma maneira de reduzir o estresse em animais de laboratório é por formação. Animais de treinamento geralmente pode ser uma ferramenta muito útil para a gestão de animais de laboratório e é, na verdade, exigida pela UE Directiva 2010/63/UE⁹. Treinamento pode servir como uma forma de enriquecimento e ajuda a preparar os animais para experiências; assim, a formação contribui para sustentar e melhorar o bem-estar no laboratório configurações^10,11,12. Um método de treinamento possível é treinamento de reforço positivo (PRT). PRT é uma forma de condicionamento operante, onde uma recompensa (por exemplo, uma recompensa de comida), está relacionada com um comportamento desejado¹³. Esta forma de treinamento já normalmente é usada em ambientes de laboratório para primatas não-humanos a fim de reduzir o stress e aumentar o bem-estar e ganhou popularidade em várias outras espécies animais^{10,13, 14}de^15,,16. Treinamento de movimento voluntário é também frequentemente usado para refinação pecuária gestão^17,18,19. PRT não é apenas uma ferramenta útil para a cooperação ao trabalhar com animais; da mesma forma é geralmente benéfica para o bem-estar dos animais, independentemente de se o comportamento treinado diretamente usados²⁰. O protocolo de treinamento de reforço positivo aqui descrita visa evitar qualquer forma de estresse durante as mudanças realizadas rotineiramente gaiola dando o rato a oportunidade de participar voluntariamente no procedimento.

Além do possível estresse para os animais, processos de trabalho em instalações animais sempre oferecem armadilhas para a manutenção do estado de higiene, especialmente como o contacto directo entre animais de laboratório e cuidadores de animais suporta o risco de higiene contaminação. Em instalações animais, especializado em roedores, a transferência dos animais de sujo em gaiolas limpas fornece uma carga de trabalho elevada e regular. Este procedimento geralmente inclui o contacto directo entre animais e seres humanos e, portanto, representa um factor de risco de higiene devido à possível transferência de patógenos estabeleceu-se sobre a pele humana²¹. Além de transferência de outros vetores animais, organismos patogênicos e não-patogênicas invadir instalações animais mais frequentemente através de seres humanos^22,23. Como saúde reduzido é associado com reduzida bem-estar, mesmo subclínica infecções podem ser uma causa para nonreproducible resultados experimentais, e isto deve ser claramente evitado^24,25. Nesta conta, treinamento de animais para gaiolas de alteração voluntária mais permite que a condução da mudança gaiola após o treinamento com quase nenhum contacto directo entre o zelador animal e animal, reduzindo, assim, um risco potencial de higiene durante a execução procedimentos experimentais.

Nosso protocolo para ratos de treinamento mudar voluntariamente gaiolas pode ser uma ferramenta útil para a gestão de rato de laboratório, como links a formação como uma forma de enriquecimento cognitivo com o desempenho do trabalho rotineiro. Nesse sentido, nosso protocolo é um procedimento de animal-amigável que ajuda a aumentar o bem-estar dos ratos em instalações de animais de laboratório. Como a mudança de gaiola após a fase de treinamento pode ser realizada com quase nenhum contacto directo entre o zelador de animal e animal, além disso pode ajudar a manter a higiene de alto nível e, portanto, melhorar ainda mais a pesquisa animal.

Protocolo

A manipulação dos ratos e os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com as orientações europeias, nacionais e institucionais para cuidados com animais.

1. a aclimatação e habituação

Nota: Se ratos não foram transportados, o tempo de aclimatação e habituação pode ser reduzido. Para identificação de não-invasiva, cor da cauda com marcador de pele-amigável.

1. Semana 1: aclimatação
   Nota: Duas sessões devem ser executadas durante a primeira semana, no dia da chegada e segundo um 2 dias depois da chegada.
   1. No dia da chegada dos ratos:
      1. Transferi os ratos em pares de dois para sua gaiola em casa nova. Transferi alguns do aninhamento velho e fundamento material, bem como algumas de suas pelotas de alimento familiar para facilitar a habituação ao novo ambiente.
      2. Evite levantar o rato por sua cauda. Se possível, coloque uma mão sob a barriga ou em torno do peito e a outra apoiando as pernas traseiras dos ratos para levá-los (Figura 1)²⁶.
   2. Dois dias depois do dia de chegada:
   3. Abra a gaiola casa dos ratos e colocar a mão na gaiola. Deixe os ratos sniff e explorar a mão. Se os ratos estão tentando sair da jaula, dificultar-lhes, suavemente, pressionando-os volta na gaiola. Continue com este procedimento nos próximos quatro minutos.
   4. Se os ratos têm medo e não começar a explorar seu ambiente, repita o procedimento uma vez por dia até que os ratos começam a explorar. Neste caso, uma habituação para o clicker pode ser necessária.
      Nota: Ratos explorar coisas novas, com todos os seus sentidos, então depois de algum tempo, eles reconhecerão o mesmo experimentador como sendo familiar. Pode acontecer que o rato faz orais explorações das mãos, mas não deve ser de forma invasiva. Se esta situação ocorrer, a mão deve ser tomada lentamente para garantir que as luvas não são destruídas.
   5. Adicione pequenas partes da recompensa de utilização alimentar da gaiola em casa.
      Nota: A recompensa de comida deve estar em conformidade com os requisitos para a nutrição de animais de laboratório. Neste protocolo, o chocolate branco é usado (realizada no final de uma seringa), mas outros alimentos, como frutas secas, frutas frescas ou cereais, é possível. Se os requisitos de higiene de instalações animais exigem condições especiais, existem vários fornecedores para deleites para animais de laboratório. A opção mais saudável é preferível, mas uma mistura de açúcar elevado de gordura e alto pode dar os animais uma maior motivação para participar.
2. Semana 2: Habituação para o cientista e a recompensa de comida
   1. Continue com a habitação para a mão e a recompensa de comida começado na semana anterior. Limite o tempo de interação a dois minutos por dia.
   2. Em casos em que o rato é muito ansioso, habituação para o clicker pode ser necessária.
      1. Para avaliar esse comportamento, clique uma vez a cada cinco segundos após a sessão no dia 1. Se o rato reage com um comportamento de medo, o clicker deve estar habituado.
      2. Para habituação para o controle remoto, clique em cinco vezes, enquanto o rato consome a recompensa que é colocada na gaiola, após a sessão. A habituação para o clicker é concluída assim que o rato já não mostra qualquer comportamento relacionados com medo.
3. Semana 3: Habituação para manipulação intensa
   1. Em dias de um a três, começar com elevação ou acariciando o rato durante vários segundos e lentamente, estender o tempo (máx. 2 minutos por rato). Pare se o rato mostra sinais contrário como congelamento, esquivando-se ou esconder.
   2. Nos dias 4 e 5, acabar com a manipulação em cócegas, conforme descrito em Cloutier et al (2012). ²⁷
      Nota: Indicadores para uma bem sucedida habituação são, por exemplo, o rato, tendo a recompensa de comida que lhe é oferecido com a mão ou os ratos perto da mão, explorá-la, ou tocá-lo.

2. clicker formação

Nota: Uma sessão de treinamento leva quatro minutos e consiste em intervalos de 30 segundos de treino seguido por 15 segundos de pausa. Remova qualquer material adicionado durante a pausa. O observador é livre para fazer o que quer e é permitido a participar e a consumir a recompensa, mas o foco é exclusivamente no outro rato. Todos os ratos foram cócegas em um dia e cinco dias. Para o sucesso do treinamento, é fundamental que o experimentador presta atenção ao comportamento dos animais e está agindo de forma calma. A formação depende fortemente de habilidades do experimentador de sincronismo e poder de observação. Nenhum feedback verbal ocorre no treinamento e comunicação verbal com os animais só pode ocorrer fora das sessões. Um indicador para a aprendizagem do comportamento desejado é a repetição do comportamento.

1. Preparação
   1. Prepare o material necessário, como a recompensa, a combinação de vara de controle remoto/alvo, um temporizador, uma gaiola limpa, o tubo de metal e qualquer outro material de formação específica.
   2. Transferi a gaiola em casa para um lugar sossegado.
   3. Remova todos os itens da gaiola. Apenas os dois ratos (treinados e observador) e o material da cama deve permanecer na gaiola.
2. Dia de treinamento 1: estabelecer uma conexão entre o reforçador primário e secundário
   1. Coloque um túnel curto na gaiola em casa, de preferência um rato é familiar com.
   2. Aguarde até que o rato senta-se no túnel e depois alimentar o rato com a recompensa.
      Nota: Se o rato não está alimentando as circunstâncias a situação de treinamento, a fase de habituação deve ser estendida ou ajustada.
   3. Assim que o rato mostra interesse na recompensa e vai começar a mordiscar a recompensa, clique e deixe o rato alimentam a recompensa. Para garantir que o emparelhamento dos dois reforça é bem sucedido, repita clicando e gratificante em seguida por 15 segundos. Faça isso pelo menos duas vezes durante esta primeira sessão de treinamento.
   4. Se o rato participar, verifique se há sinais do estabelecimento de uma conexão entre o primário e o secundário reforçador. O principal critério para esta classificação é a estimativa da recompensa de comida, que é mostrada pelo rato cheirar, olhar ao redor e para a mão que apresenta a recompensa de comida ou elevando para seus membros posteriores a fim de procurar a recompensa (Figura 2). Se isso ocorrer, seguir em frente com a próxima parte; caso contrário, repetir o "Dia de treinamento 1"
3. Dias 2 a 5 de formação: passando através de um túnel curto
   Nota: Uma sessão de treinamento consiste em fases alternadas de 30 segundos de treino e 15 segundos de pausa para quatro minutos.
   1. Coloque um curto túnel do mesmo material da original/usado primeiro túnel que vai ligar as duas gaiolas na gaiola em casa.
   2. Iniciar o cronômetro e começar imediatamente com os primeiros 30 segundos de treinamento.
      1. A primeira vez que o rato entra no túnel, apresente a recompensa no fim do túnel. Assim que o rato entra no túnel, clique e deixe o rato comer a recompensa.
      2. Tirar a recompensa de comida e esperar até que o rato mostra interesse para o túnel mais uma vez. Clique quando o rato entra no túnel e apresentar a recompensa no fim do túnel (Figura 3).
      3. Após 30 segundos de treino, adicione um intervalo de 15 segundo (remover o túnel).
   3. Repetir os 30 segundos de treino com um segundo 15 subsequente quebrar por quatro minutos.
   4. Se o rato mostra o comportamento desejado, mais de quatro vezes por minuto, clicando em parar e justa recompensa com o reforçador primário.
   5. Pare logo aos quatro minutos.
4. Semana de formação 2: tocando uma vara de destino
   1. Iniciar o cronômetro e começar imediatamente com os primeiros 30 segundos de treinamento. Adicionar uma pausa a cada 15 segundos e depois continuar com o treinamento.
   2. Coloque o globo da vara de destino perto do rato.
   3. Assim que o rato mostra interesse no globo, clique e recompense o rato. Repita este procedimento várias vezes.
   4. Se o rato mostra interesse na globo mais de quatro vezes por minuto, o seguinte comportamento para reforçar é "tocar o mundo com o nariz".
   5. Se o rato repete esse comportamento para mais de quatro vezes por minuto, pare de recompensa clicando e apenas com o reforçador primário.
   6. Pare logo aos quatro minutos.
5. Semana 3 (cinco dias) e 4 (três dias) de formação: mudando a gaiola através de um túnel
   Nota: Aqui, apenas passando através do túnel em direção a gaiola limpa é reforçado. O treinamento na semana 4 foi reduzido para três dias de treinamento. Desta vez já é suficiente para o sucesso do treinamento e dá a oportunidade para um dia adicional para avaliação ou registro de dados para novas experiências.
   1. Construa uma conexão entre a gaiola em casa e uma nova gaiola limpa por um túnel através da inserção de uma versão mais longa do túnel já familiarizado com o rato.
   2. No primeiro dia, não realizar nenhum treinamento e só deixar os ratos inspecionar o túnel. Há uma boa chance que eles sequer irão transferir a ele por conta própria.
   3. No segundo dia, o rato dá dois minutos para transferir através do túnel, por conta própria, do sujo para o lado limpo. Se o rato transfere-se livremente através do túnel, pule para a etapa 2.5.8.
   4. Caso contrário, começa o segundo 30 primeiro sessão (alternar entre 30 segundos de treino e um intervalo de 15 segundo) por quatro minutos de treino.
   5. Clique e recompense o rato quando ele mostra interesse no túnel.
   6. Vá para clicar e recompensar a entrada para o túnel.
   7. Vá para clique e recompensa se o rato vai mais fundo no túnel.
   8. Continue da mesma forma até o rato percorre o túnel inteiro. Assim como o rato começa a espreitar para fora no fim do túnel a gaiola limpa, apresente o globo da vara de destino, clique e recompensa para tocar o mundo.
   9. Finalmente, guia o rato para sair do túnel. Para este processo, use o globo da vara de destino. Apresentar o globo na frente do túnel e clique e recompense o rato assim pisa na nova gaiola e está tocando o globo.
   10. Transferi o rato volta para a jaula "suja" em casa. Coloca uma mão sob a barriga ou em torno do peito e a outra apoiando as pernas traseiras dos ratos para levá-los (Figura 1). Apresente o globo da vara de destino no centro da gaiola limpa. Clique e recompensa como o rato percorre o túnel e está tocando o pau do alvo (Figura 4).
   11. Se o rato repete o comportamento para mais de quatro vezes por minuto, pare de recompensa clicando e apenas com o reforçador primário.
   12. Pare logo aos quatro minutos.

Resultados

O treinamento foi realizado em uma coorte de dez ratos fêmeas de Lister encapuzado (LD). Dez destreinadas mas gentilmente manipuladas LD ratas serviram como um grupo de controle. Manipulação suave significa que os ratos eram só levantados pelo seu corpo e não levantados na base da cauda. Para avaliar a aprendizagem por observação, nós adicionamos um grupo de mais de 10 ratos LD femininos, que não foram treinados, mas foram companheiros de gaiola dos ratos treinados e foram capaze...

Discussão

O protocolo descrito acima é uma útil aplicação do nosso protocolo de treinamento do clicker descrito anteriormente para ratos de laboratório¹⁰. A aplicação requer apenas alguns minutos por dia ao longo de um total de sete semanas, incluindo a aclimatação, habituação e clicker formação. Para viabilidade, este protocolo foi limitado aos dias de semana, com sessões de cerca de dez minutos por par de ratos. O protocolo pode aparecer para ser demorado para estabelecer colônias de rato g...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Target Stick with Clicker	Trixie	2282
Metal Pipe (Alu Flexrohr nw 100)	Rotheigner		available in construction marktes
White Chocolate/ white chocolate cream			Company doesn't matter, preferable organic quality
Prism Version 6.0 for Mac	GraphPad Software