Amostragem Microbiopsy absorvente e extração do RNA para sangue minimamente invasiva, simultânea e análise de pele

Resumo

Neste artigo, vamos demonstrar como a técnica de microbiopsy absorvente é executada e como a amostra pode ser usada para a extração de RNA para amostragem simples e simultânea de pele e sangue, de forma minimamente invasiva.

Resumo

Biópsia de pele convencional limita a pesquisa clínica que envolve áreas cosmeticamente sensíveis ou pediátricas aplicações devido a sua capacidade de invasão. Aqui, descrevemos o protocolo de utilização de um dispositivo baseado em microneedle absorvente, absorvente, microbiopsy, para amostragem minimamente invasiva da mistura de pele e sangue. Nosso objetivo é ajudar a facilitar o rápido progresso na pesquisa clínica, o estabelecimento de biomarcadores para doenças de pele e reduzindo o risco para os participantes da pesquisa clínica. Em contraste com as técnicas de biópsia de pele convencional, o absorvente microbiopsy pode ser executada em poucos segundos e não requer treinamento intensivo devido ao seu design simples. Neste relatório, nós descrevemos o uso de absorvente microbiopsy, incluindo carregamento e aplicação, em um voluntário. Em seguida, mostramos como isolar o RNA da amostra absorvida. Finalmente, vamos mostrar o uso de quantitativo transcrição reversa PCR (RT-qPCR) para quantificar os níveis de expressão de RNAm de sangue (CD3E e CD19) e pele (KRT14 e TYR). Os métodos que descrevemos utilizam fora da prateleira kits e reagentes. Este protocolo oferece uma abordagem minimamente invasiva para a amostragem simultânea de pele e sangue, dentro da mesma matriz microbiopsy absorvente. Encontramos comités de ética humana, clínicos e voluntários para apoiar esta abordagem de pesquisa dermatológica.

Introdução

Biópsia de pele é uma das técnicas mais essenciais em Dermatologia para amostragem de pele e posterior diagnóstico de doenças de pele, através da avaliação histopatológica. A técnica de biópsia envolve um profissional médico, usando uma lâmina ou um punção biópsia para remover a lesão suspeita na pele do paciente para exame¹. Embora a técnica seja eficaz, é altamente invasivo e limita a pesquisa clínica, como o ponto de extremidade geralmente envolve técnicas de biologia molecular^2,3. Análise molecular de doenças de pele tem o potencial de fornecer informações biológicas altamente específicas que não a análise histopatológica, facilitando assim a droga descoberta e doença diagnóstico^4,5. Além disso, a demanda de amostra em técnicas moleculares mais é comparativamente pequena e pode levar a uma redução no uso de animais e permitir um maior número de repetições. Portanto, há uma clara necessidade de uma técnica alternativa que permite a análise molecular em pesquisa clínica e diminui o risco para os participantes.

Para atender a essa necessidade no campo, nosso grupo desenvolveu uma plataforma de diagnóstica baseados em microneedle romance, microbiopsy absorvente, que possibilita a coleta de uma pequena quantidade de pele misturada com sangue de uma forma simples e minimamente invasiva⁶. O propósito desta publicação é descrever o absorvente microbiopsy como uma ferramenta de amostragem para facilitar a análise molecular através da extração do RNA em pesquisa clínica.

Anteriormente, descrevemos a primeira versão do microbiopsy, pele microbiopsy, que consiste de um microneedle feito de um design de três camadas de chapa de aço para extrair pequenos pedaços de tecidos de pele⁷. A novidade deste dispositivo vem de múltiplos pontos de contacto de microneedle que permite a extração de tecido eficiente³. Em contraste, uma biópsia do perfurador de pele circular fornece apenas um ponto de contacto e simplesmente rasga a pele sem captura qualquer amostra em alguns casos. Com base no microbiopsy a pele, recentemente desenvolvemos o microbiopsy absorvente que tem tanto sangue e pele capacidades de amostragem. O dispositivo tem demonstrado ser viável para uso em áreas de poucos recursos em um recente estudo epidemiológico⁶.

Devido ao seu design simples, o microbiopsy absorvente pode ser realizada em poucos segundos e não requer treinamento extensivo. Além disso, anestésico local não é necessária, e o local de aplicação não provoca cicatrizes. O presente protocolo permite a pesquisadores ou profissionais médicos sem amostragem pertinente de treinamento para obter dados de pele direcionados para análise molecular. Esperamos microsampling dispositivos para se tornar rotina na investigação de pele no futuro.

Embora o microbiopsy tem sido relatada em outros estudos de doença de pele que envolveu técnicas de diagnóstico molecular^6,8,9,10, como o vírus do papiloma humano deteção do ADN, este protocolo é o primeiro a demonstrar os detalhes das técnicas de extração e processamento de amostra para o microbiopsy absorvente. Além disso, este é o primeiro relatório descrevendo o perfil de expressão de gene relativo da pele e células do sangue em amostras de microbiopsy.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Metro Sul humano Comitê de ética de pesquisa e a Universidade de Queensland humano pesquisa Comitê de ética (HREC-13-QPAH-551 e UQ2013001551) e Universidade de South Austrália humana Comitê de ética (200607).

1. absorvente Microbiopsy fabricação

1. Corte a laser microneedle partes de 50 µm folha de aço inoxidável de grau médico e camada absorvente (papel de filtro), respectivamente (Figura 1).
   Nota: Outras partes, incluindo o êmbolo e o caso, do dispositivo são fabricadas com as técnicas de prototipagem rápida, como a impressão 3D.
2. Aproveite todas as peças, exceto a camada absorvente, em 70% etanol (EtOH) por 5 min e ar secá-las por 30 min depois.
3. Monte o microneedle da três-camada, com a camada absorvente no meio (Figura 1a).
4. Inserir o microneedle montado na fenda do êmbolo.
5. Colocar a mola e insira o êmbolo na caixa (Figura 1C). Evite o microneedle tocar em nada no processo de montagem para garantir a qualidade da agulha.
6. Sele o microbiopsy absorvente montado em um pacote para a esterilização de radiação-γ antes de usar.

2. a amostragem com o absorvente Microbiopsy

1. Usar luvas descartáveis e mãos de pulverizador e ferramentas, tais como fórceps, com 70% EtOH.
2. Higienizar o local de aplicação com uma compressa com álcool.
3. Remova o microbiopsy do pacote esterilizado γ-radiação sem tocar o microneedle no processo.
4. Carrega o aparelho puxando o êmbolo para comprimir a mola até que haja um 'clique' som e os bloqueios de êmbolo no lugar.
5. Aponte o dispositivo na pele a amostra, garantindo que a área de amostragem está em uma posição fixa.
6. Certifique-se de que o dispositivo é aproximadamente perpendicular à pele e, em seguida, aplicar ≥ 1 kg de força para o dispositivo sobre a pele.
   Nota: Aplicando força para baixo na pele é necessário para assegurar uma penetração suficiente do microneedle.
7. Pressione o gatilho e segure o dispositivo no lugar por um período mínimo de 10 s para a amostra de sangue ser absorvido.
   Nota: Se o dispositivo for liberado antes de 10 s, há menos amostra capturada.

3. extração do RNA

Nota: Os procedimentos de extração de RNA foram modificados de protocolo dos fabricantes para isolamento ideal do RNA da amostra de microbiopsied. Todos os reagentes e coluna usada na extração do RNA estão incluídos no kit, salvo indicação em contrário.

1. Puxe o êmbolo e microneedle absorvente do caso pelas mãos suavemente. Certifique-se de que a ponta do microneedle não entra em contacto com alguma coisa durante a remoção.
2. Remova o absorvente microneedle o êmbolo. Segure os dois furos no microneedle com um par de Pinças esterilizadas e retirá-lo.
3. Coloque o microneedle intacto em um tubo de microcentrifugadora de 2 mL (não do kit de isolamento de RNA; ver Tabela de materiais) preenchido com 50 µ l de tampão de extração, com o lado da agulha virado para baixo, para baixo. Para minimizar a perda de amostra, deixe o tubo de gelo seco por 5 min antes de processar a amostra.
4. Vórtice brevemente (3-5 s) para remover alguns dos materiais incluídos na amostra da ponta.
5. Incubar o microneedle no tubo em uma cadeira de balanço para o minuto 30 a 42 ° C.
   Nota: A solução-tampão será absorvida na camada absorvente imediatamente.
6. Coloque a parte superior do nível microneedle (lado oposto da agulha) na parte superior do tubo de microcentrífuga 2 mL, usando Pinças esterilizadas.
7. Feche a tampa do tubo, tal que o topo do microneedle é mantido no lugar entre o PAC e o tubo.
8. Girar o tubo em 16.000 x g ou à velocidade máxima de 30 s para remover os materiais incluídos na amostra da camada absorvente do dispositivo.
9. Remova o microneedle cuidadosamente com a pinça sem volta mergulhando a solução-tampão. Mantenha o tubo e descartar o microneedle.
10. Centrifugar as amostras a 3.000 x g por 2 min. Pipetar o sobrenadante contendo o RNA extraído cuidadosamente em um tubo de microcentrifugadora novo.
11. Adicionar 250 µ l de tampão de condicionamento para a membrana de filtro de coluna de purificação e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
12. Centrifugue a coluna no tubo de coleta em 16.000 x g ou a velocidade máxima durante 1 min.
13. Adicionar 50 µ l de 70% EtOH para a amostra coletada do passo 3.9. Misture bem delicadamente pipetagem para cima e para baixo.
14. Transfira a mistura (~ 100 µ l) na coluna de purificação instintiva.
15. Centrífuga para 2 min em 100g x imediatamente, seguida por uma centrifugação a 16.000 x g, durante 30 s para remover o escoamento.
16. Adicione 100 µ l de tampão de lavagem 1 (W1) na coluna de purificação e centrifugar por 1 min a 8.000 x g.
17. Prepare a solução de DNase adicionando 5 µ l de DNase eu solução estoque a 35 µ l de Buffer RDD numa microcentrifuga separada do tubo para cada amostra. Misturar por inversão suavemente.
    Nota: O tratamento de DNase é para ser realizado na coluna de purificação, em vez de na placa do PCR depois, por causa da quantidade da amostra.
18. Adicione 40 µ l de mistura de incubação DNase diretamente na membrana de coluna de purificação. Incube a temperatura ambiente por 15 min.
19. Adicione 40 µ l de W1 para a membrana de coluna de purificação. Centrifugar a 8.000 x g por 15 s.
20. Pipete 100 µ l de tampão de lavagem 2 (W2) para a coluna de purificação após o tratamento de DNase e centrifugar por 1 min a 8.000 x g.
21. Adicionar outro 100 µ l de W2 na coluna de purificação e centrifugar por 2 min em 16.000 x. g. verificação da coluna de purificação para qualquer tampão de lavagem residual. Re-centrifugar a 16.000 x g por 1 min, se permanece qualquer tampão de lavagem.
22. Transferi a coluna de purificação para um novo tubo de microcentrifuga de 0,5 mL, fornecido no kit.
23. Pipete 11 µ l de RNase-água livre (não fornecido no kit de isolamento do RNA), em vez de tampão de eluição (EB), directamente sobre a membrana da coluna de purificação. Toca suavemente a ponta da pipeta na superfície da membrana durante o fornecimento da água livre de RNase para garantir a máxima absorção de água livre de RNase para a membrana. Incube a temperatura ambiente por 2 min.
24. Centrifugue a coluna por 1 min a 1.000 x g para distribuir a água livre de RNase na coluna e, em seguida, centrifugar para 16.000 x g em 1 min para Eluir o RNA.
    Nota: Quantificação de RNA não é recomendada devido a pequena quantidade da amostra.
25. Parar o ponto #1: armazenar a amostra de RNA total a-80 ° C, se a síntese do cDNA não é executada imediatamente.
    Nota: Evite congelar se não for necessário dada a baixa concentração de amostra de RNA.

4. síntese de cDNA

1. Descongele a amostra congelada no gelo (da etapa 3,25).
2. Sintetiza o cDNA de RNA total com kit de síntese do cDNA de acordo com o procedimento abaixo.
3. Preparar a mistura de reação: 11 µ l de RNA total, 4 µ l de 5 x TransAmp Buffer, 1 µ l de transcriptase reversa, 4 µ l de água DNase/RNase-livre. Misture suavemente pipetando.
4. Executar a transcrição reversa em um aparelho termociclador: 25 ° C por 10 min, 42 ° C por 15 min, seguido por uma etapa de inactivação final transcriptase reversa a 85 ° C por 5 min.
5. Parar o ponto #2: armazenar a amostra transcrita reversa a-80 ° C até o uso.

5. reação de qPCR e análise de dados

Nota: Os primers para qPCR reações foram projetados para span intrão os limites para evitar a amplificação de DNA genômico, usando Primer de NCBI BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). O gene de referência utilizado neste estudo é RPLP0 (consulte a seção de discussão para obter mais informações).

1. Descongele a amostra congelada no gelo (da etapa 4.5).
2. Execute qPCR com o kit de mistura mestre qPCR de acordo com o procedimento abaixo.
3. Preparem-se mestre mistura contendo os followings por reação: 5 µ l da mistura de reação de x qPCR 2, 0,4 µ l de cartilha para a frente de 10 µM, 0,4 µ l de primer reverso de 10 µM, 2,2 µ l de água livre de DNase. Misture suavemente pipetando. Configure as amostras em triplica.
4. Pipete 8 µ l do mix mestre em cada poço de uma 384-bem PCR placa primeiro e depois 2 µ l do cDNA de cada amostra (de um total de 10 µ l por alvéolo).
   Nota: Nenhum modelo de controle (NTC) e nenhum controle de transcriptase reversa (-RT) estão incluídos como controles negativos.
5. A placa com a película adesiva do selo e centrifugar brevemente.
6. Executar a reação de amplificação em um termociclador em tempo real: 95 ° C por 2 min (ativação da polimerase), seguida de 40 ciclos de 95 ° C por 5 s (desnaturação), 60 ° C durante 10 s (recozimento) e 72 ° C, durante 10 s (extensão).
7. Calcule a concentração de RNA de amostras por interpolação de uma curva padrão preparada a partir de modelos com concentrações conhecidas.
   1. Crie uma Nova experiência no software.
   2. Clique em definir e definir padrões de cima para configurar diluição serial para placas.
   3. Selecionar e organizar os poços de padrões e amostras. Clique em aplicar.
   4. Clique em analisar na aba resultado para avaliar a curva de calibração. Confirmar a inclinação, o valor de R² , erro e eficiência de amplificação atendem aos critérios experimentais.
   5. Controlar as quantidades das amostras desconhecidas visualmente na curva padrão com base em seus valores de Ct.
      Nota: A construção da curva padrão, incluindo a escolha do factor de diluição é realizada de acordo com protocolos publicados^11,12,13.
8. Execute análise de expressão do gene do mRNA usando o método ΔCt (Ct é normalizada a um gene refence).
   1. Subtrai o valor de Ct do gene alvo do valor de Ct do gene de referência para obter o valor de ΔCt.
   2. Replica de média e os valores ΔCt da técnica.
   3. Plotar e analisar a expressão de gene com estatísticas software^11,14 (ver Tabela de materiais).
      Nota: Como alternativa, a análise de expressão do gene é realizada de acordo com protocolos publicados¹³.

Resultados

Informamos anteriormente que o microneedle da microbiopsy a pele penetra a pele aproximadamente 500 µm profunda⁷. O projeto de microneedle da pele microbiopsy é altamente similar ao que microbiopsy absorvente (Figura 2a). Enquanto o absorvente microbiopsy consistia de uma camada absorvente no meio para absorção de sangue, a pele microbiopsy continha um canal para capturar mecânica dos tecidos da pele. O uso da camada absorvente também levou a uma ligeira diferença na dimensão de microneedle (absorvente: 1,50 x 0,50 x 0,21 mm vs pele: 1,50 x 0,50 x 0,15 mm).

Figura 2b mostra os locais de aplicação 5 min depois absorvente e microbiopsies de pele foram aplicadas no braço esquerdo volar do voluntário masculino. Devido à semelhança entre os dois projetos de microneedle, os locais de aplicação de ambos os dispositivos eram comparáveis, com eritema menor. Ambos os sites de aplicativo não eram perceptíveis após 48 h com nenhuma cicatriz à esquerda atrás. Isto suporta a hipótese de que este dispositivo minimamente invasivo tem o potencial para ajudar a vários sites de aplicativo de tela ou para ser executada em uma base regular.

C da Figura 2 mostra uma imagem representativa da camada absorvente do microbiopsy absorvente após ser aplicado para o volar do braço de um homem voluntário. Como mostrado na figura, alguns pequenos pedaços de pele foram capturados perto da ponta do microneedle, e um pouco de sangue foi absorvido o papel de filtro. Isso indica que o dispositivo penetrou na pele e capturado tanto pele e sangue simultaneamente dentro da mesma matriz de microbiopsy absorvente. Figura 2d mostra uma pós-amostragem pele microbiopsy, a geração anterior de microbiopsy, para comparação. O canal de microbiopsy a pele capturou um pequeno pedaço de pele, mas a quantidade de sangue sobre o microneedle era pequena em comparação com o absorvente microbiopsy. Ambos os sites de aplicativo não eram perceptíveis dentro de 48 h. No experimento, o absorvente microbiopsy foi aplicado com um tempo de armazenagem de 10-s pós aplicação, enquanto a pele microbiopsy foi lançado imediatamente após a aplicação devido à diferença no projeto.

Como mostrado na Figura 3a, dois grupos de absorvente microbiopsy estavam envolvidos neste experimento baseado no protocolo de aplicação: 'Libertação imediata' e exploração de 10-s'. Para o grupo de 'Libertação', o dispositivo foi aplicado usando o protocolo de microbiopsy de pele original mesmo, com o dispositivo que está sendo removido do local do aplicativo imediatamente após a aplicação. Para a realização de 10-s' grupo, o dispositivo foi mantido no lugar após o pedido de 10 s para melhorar a coleta de amostra. Os dois grupos de absorvente microbiopsy foram criados para demonstrar como a abordagem de aplicativo pode afetar a quantidade de amostra. O tempo de armazenagem de 10-s foi escolhido como um tempo clinicamente razoável para demonstrar que o tempo de aplicação afeta a quantidade de amostra recuperável.

A quantidade de RNA se recuperou os dois grupos de absorvente microbiopsy foram 0,33 ± 0,39 ng 'Libertação imediata' e 1,43 ± 0,88 ng para exploração de 10-s' (Figura 3a, n = 20), sugerindo um aumento de 4-fold com o tempo extra. Isto indica que aplicar o dispositivo absorvente com o tempo de armazenagem de 10-s resultou em mais RNA extraído. A diferença pode ser devido à presença de amostra sanguínea aumentada na camada absorvente (Figura 3C). Com efeito, o grupo de 'Libertação' (Figura 3b) conseguiu coletar uma quantidade semelhante de sangue com a camada absorvente em comparação com a realização de 10-s' grupo (Figura 3C). Também deve ser notado que mais imediatamente lançados microbiopsies estavam perto do eixo x, sugerindo que eles eram eventos negativos ou exibido uma quantidade muito baixa de RNA. Portanto, o resultado validado a hipótese de que o tempo de armazenagem teria um impacto sobre o desempenho do dispositivo, como isso pode levar tempo para o sangue ser absorvido pela camada absorvente.

Desde que o dispositivo foi projetado para sangue e amostras de pele, qPCR foi usado para detectar a expressão de pele e sangue biomarcadores para ambos os dispositivos para comparação. Usamos a tirosinase, TYR, como um biomarcador para os melanócitos e KRT14 como um biomarcador para queratinócitos na epiderme viável. Pele microbiopsy amostras foram incluídas no experimento para comparação. Como mostrado na Figura 4, embora a pele e o absorvente microbiopsies foram aplicadas de forma diferente devido à diferença no design, a expressão níveis para ambos pele biomarcadores TYR e KRT14 foram comparáveis para ambos os dispositivos conforme indicado pelo dados. Biomarcadores de células brancas do sangue (CD3E, células T e CD19, células B) foram encontrados para ser mais prevalente em amostras de microbiopsy absorvente do que nas amostras de pele microbiopsy. Este resultado sugere que o absorvente microbiopsy um melhor desempenho na coleta de sangue, mas ainda mantém a capacidade de captura de pele em comparação com o microbiopsy de pele (n = 5).

Figura 1. Fabricação de absorvente microbiopsy. (a) o microneedle da três-camada. (b) todas as partes do dispositivo. (c) o microbiopsy absorvente montado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. O absorvente microbiopsy foi capaz de capturar amostras de pele e sangue simultaneamente sem deixar uma cicatriz no braço esquerdo volar do voluntário masculino. uma comparação entre as microagulhas de absorvente e pele microbiopsies. (b) a aplicação sites esquerda por absorvente e pele microbiopsies 5 min após a aplicação. (c, d) Microagulhas de microbiopsies absorvente e da pele após a aplicação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. O absorvente microbiopsy capturado mais sangue e amostra de RNA quando aplicado para 10-s. (a) o tempo de armazenagem pós-aplicação de 10-s resultou em uma maior quantidade de RNA que liberando o dispositivo imediatamente (n = 20). Barras de erro representam S.D. da média (* * *p< 0,0001). (b, c) Fotos representativas do microbiopsies absorvente após aplicação com 'Liberação imediata' e exploração de 10-s' abordagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. A comparação dos níveis de expressão do mRNA entre a pele e o absorvente microbiopsies (n = 5). a expressão de gene tinha sido normalizada com gene de referência RPLP0. Barras de erro representam S.D. da média (*p< 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Estes resultados demonstram que o absorvente microbiopsy pode ser usado como uma ferramenta para amostragem simples e minimamente invasiva da pele e sangue mistura para caracterização molecular. Aplicativo de dispositivo em conformidade com o protocolo é essencial para a obtenção de resultados fiáveis como mostrado pela diferença na quantidade de RNA recuperada com os protocolos de aplicação diferentes (Figura 3). Uma vez que a amostra é extraída, a amostra subsequente processamento passo para extração do RNA é altamente similar a protocolos estabelecidos^15,16. Além disso, desde os passos iniciais na extração de RNA que são modificados para o absorvente microbiopsy, outra mudança chave é a utilização de água livre de RNase para melhorar os resultados para aplicações a jusante. Além disso, vale mencionar que o gene de referência utilizado neste estudo é RPLP0. RPLP0, cuja função é conhecida por diferentes células e tecidos tipos¹⁷, tem sido relatado como um gene de referência adequado para uso em cânceres de pele não-melanoma e lesões pré-cancerosas¹⁸.

Uma das principais limitações do dispositivo é a remoção do microbiopsy do dispositivo, que é demorado e potencialmente aumenta a chance de perda de amostra, especialmente para amostras sensíveis como o RNA. No entanto, o problema pode ser superado por pré-resfriamento todas as ferramentas de processamento estéril, tais como os tubos de microcentrifuga de 2ml, em gelo seco.

O uso de microbiopsy o absorvente é simples e não requer treinamento intensivo. Biópsia convencional não é necessária, como microbiopsy permite a caracterização molecular com técnicas de diagnóstico molecular estabelecido, como RT-qPCR. Para ainda mais quantificar e demonstrar a capacidade de amostragem de absorvente microbiopsy, foi investigada a literatura anterior que envolveu a extração do RNA do tecido da pele humana. De uma típico 3.0 ou 4.0 mm da pele soco biópsia, três estudos relataram as quantidades de RNA extraídas variou de 50 a 200 ng por mg de pele tecido^19,20,21. Comparando com a 1,43 ng do RNA que foi recuperado o absorvente microbiopsy em média (Figura 3), o peso dos tecidos da pele amostrados é esperado a gama de 0,29-115 µ g baseia-se a mesma proporção de RNA-de-tecido de estudos de biópsia da pele soco.

Este protocolo não é sem armadilhas potenciais, embora alguns dos problemas podem ser facilmente superados. Por exemplo, os dados de extração de RNA sugeriam uma considerável variação mesmo com o tempo de armazenagem de 10-s (Figura 3). Para resolver o problema, uma solução potencial envolve otimizando o protocolo de aplicação. Parâmetros como a força aplicada sobre a pele e tempo de armazenagem deve ser testado e otimizado para reduzir as variações na extração da amostra. O outro problema potencial é a remoção de microbiopsy do dispositivo, que possa afetar a integridade da amostra e a recuperação. Apesar de remover o microbiopsy para extração do RNA é uma abordagem eficaz, todo o procedimento é tedioso, e a amostra pode ser exposta a contaminação no processo. Portanto, a modificação do protocolo de processamento de amostra é altamente desejada a fim de garantir a integridade da amostra e evitar a perda de amostra.

Uma vez que as duas questões acima são abordadas, espera-se que o dispositivo se torne uma ferramenta padrão para pesquisa clínica. É importante notar que o dispositivo capta a pele e o sangue amostra simultaneamente, e isto deve ser tida em conta quando se analisa dados da expressão do gene. Em conclusão, este protocolo descreve os detalhes do absorvente microbiopsy se apresentar como uma ferramenta fácil e minimamente invasiva para pele combinada e recolha de amostras de sangue e a amostra subsequente processamento para perfil de expressão de gene relativo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling
Absorbent Microbiopsy	Trajan Scientific and Medical	N/A	https://www.trajanscimed.com/
Whatman filter paper, Grade 1	Sigma Aldrich	WHA1001325	N/A
RNA extraction
PicoPure RNA Isolation Kit	ThermoFisher	KIT0214	Including all buffer soltuions described in protocol
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	ThermoFisher	10977015	Improving RNA quality in RNA elution step
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile	Thomas Scientific	1226S74	N/A
Microcentrifuge 5415R	Eppendorf	Z605212	N/A
cDNA synthesis
SensiFAST cDNA Synthesis Kit	Bioline	BIO-65053	N/A
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855196	N/A
qPCR reaction and data analysis
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit	Bioline	BIO-94005	Including reagents described in qPCR reaction steps
MicroAmp Optical Adhesive Film	ThermoFisher Scinentific	4311971	N/A
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate	ThermoFisher Scinentific	4343370	N/A
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	ThermoFisher Scinentific	4485694	N/A
GraphPad Prism (v6.04)	GraphPad	N/A; Windows version	Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps
PCR primers
RPLP0 F	Sigma Aldrich	N/A	ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC
RPLP0 R	Sigma Aldrich	N/A	CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG
TYR F	Sigma Aldrich	N/A	TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA
TYR R	Sigma Aldrich	N/A	AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC
KRT14 F	Sigma Aldrich	N/A	CCT CCT CCC AGT TCT CCT
KRT14 R	Sigma Aldrich	N/A	ACA CCA CCT TGC CAT CG
CD3E F	Sigma Aldrich	N/A	CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG
CD3E R	Sigma Aldrich	N/A	GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG
CD19 F	Sigma Aldrich	N/A	TTC TGC CTG TGT TCC CTT G
CD19 R	Sigma Aldrich	N/A	GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T