Um modelo de conflito de comportamento de busca de recompensa em ratos machos

Resumo

Este modelo de conflito é usado para medir a deficiência de controle inibitório após exposição à drogas que viciam, ou outros fatores que podem influenciar o controle inibitório. Um estímulo sexual e um obstáculo aversive são apresentados simultaneamente, assim, ratos machos têm de conquistar o obstáculo para aproximar a recompensa sexual.

Resumo

O presente protocolo descreve uma tarefa de conflito do romance como um modelo de controle inibitório em ratos. Neste modelo, um estímulo gratificante natural (estímulo sexual) que representa uma alto valor recompensa e os contrário estímulos (pinos), são apresentados simultaneamente. Os ratos masculinos tem que subir ou saltar sobre o obstáculo cheio de alfinetes para abordar e investigar o parceiro sexual. Se o animal persistir no seu comportamento se aproxima independentemente dos estímulos contrário, considera-se como um comportamento de busca de recompensa mal-adaptativos ou arriscado. A tarefa do conflito permite a avaliação do déficit no controle inibitório, resultantes da exposição a drogas abusadas, como a morfina, ou um evento estressante.

A principal vantagem desse modelo é que ele fornece uma maneira simples e rápida de descobrir o déficit no controle inibitório após exposição à drogas opiáceas ou outros eventos estressantes. Além de opiáceos, este modelo comportamental também seria útil para descobrir rapidamente os défices de controle inibitório induzidos por outras drogas que viciam. No entanto, a limitação é que o desempenho dos ratos masculinos pode estar sujeitas a exercer efeitos com testes repetidos sob esta tarefa de conflito. No futuro, podemos esperar que os indivíduos com o fenótipo compulsivo de comportamento de busca de recompensa após exposição a opiáceos será identificada com base em modificar esse modelo de conflito.

Introdução

Da toxicodependência é uma doença cerebral crônica que se caracteriza pela droga impulsiva e compulsiva, buscando e levando¹. Estas características-chave do vício têm ambos foi a hipótese de resultam a capacidade prejudicada de controle inibitório^2,3, ou seja, falhando em inibir a busca imediata da gratificante estímulos e desenvolvendo adaptativos padrões de comportamento⁴.

A tarefa de avançar/não avançar e sinal de paragem de tarefa são as tarefas protótipos usadas para medir a capacidade de resposta inibição^2,5. Estes dois paradigmas experimentais avaliam a capacidade de suprimir as ações que são inadequadas, por contrastando infrequentes respostas inibitórias contra um implícito ir de base^6,7. A inibição de resposta exibida nestas tarefas foi mostrada para ser prejudicada em usuários de cocaína^8,9, viciados em ópio¹⁰e nicotina usuários¹¹. Outra duas tarefas — aprendizagem de reversão e várias tarefas de série de tempo de reação de escolha — também fornecer medidas de inibição de resposta/inibitório controlam^12,13. No entanto, a maioria desses paradigmas realizado em roedores não só requer treinamento a longo prazo para que os sujeitos podem distinguir os requisitos de resposta representados por sinais diferentes, mas também as diferenças individuais na velocidade de aprendizagem e efeitos de aprendizagem pode interferir com os resultados de teste inibitório subsequentes¹¹.

Neste trabalho, apresentamos uma tarefa de conflito romance que pode ser usada para medir a deficiência de controle inibitório após exposição à drogas que viciam. Nesta tarefa, um estímulo gratificante natural (estímulo sexual) que representa um alto valor de recompensa¹⁴e os estímulos aversive (pinos) que ratos machos têm de conquistar, são apresentados simultaneamente. Os ratos masculinos tem que subir ou saltar sobre o obstáculo cheio de alfinetes para abordar e investigar o parceiro sexual. Se o animal persistir no seu comportamento se aproxima independentemente dos estímulos contrário, considera-se como um comportamento de busca de recompensa mal-adaptativos ou arriscado. Dentre as justificativas para o estabelecimento desta tarefa é que é conceitualmente simples e não impõe exigências pesadas em processos executivos como fazer outras tarefas. Comparado a outras tarefas que medem a inibição de resposta, esta tarefa de conflito é baseada no comportamento natural e ratos com função sexual normal e experiência sexual pode ser testada diretamente, sem um processo de aprendizagem. Outra razão é que um conflito apresentado nesta tarefa entre aproximando-se a recompensa e evitando os contrário estímulos (ou o risco de ser picado) pode ter uma validade melhor, como ele imita o que ocorre nos viciados que muitas vezes se colocam em semelhante em conflito, mas persistentemente perseguir a recompensa de drogas, independentemente do risco de consequências negativas na vida real¹⁵.

Portanto, a aplicação deste modelo de conflito é uma maneira rápida e sensível para descobrir o déficit no controle inibitório após exposição à drogas que viciam, ou outros fatores que podem influenciar a capacidade de controle inibitório, tais como estresse. Ele também fornece uma estratégia comportamental romance para investigação de mecanismos neurais subjacentes déficits no controle inibitório. Além disso, modificações alternativas podem ser adicionadas para essa tarefa. Por exemplo, alterando a relação custo/benefício, substituindo o estímulo sexual com o estímulo social pode revelar mais significados comportamentais.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo International Review Board (IRB), do Instituto de psicologia, da Academia Chinesa de Ciências, e todos os experimentos são realizados em conformidade com o guia de institutos nacionais de saúde (EUA) para (cuidados e uso de animais de laboratório 2011).

1. materiais e configuração para o modelo de conflito

1. Casa quatro ratos por gaiola (50 cm comprimento x 22,5 cm largura x 30 cm de altura) em quartos de colônia com temperatura controlada (22 – 25 ° C) e um ciclo de luz/escuridão invertida h 12/12 h (luzes acesas às 21:00) pelo menos 10 dias.
   Nota: Pesando 330 – 400 e 230 – 250 g, no início dos experimentos, ratos Sprague-Dawley machos e fêmeas, respectivamente, foram usados.
2. Execute todos os testes sob iluminação fraca, durante a fase de escura.
3. Usamos as caixas opacas (37 cm comprimento x 26 cm largura x 18 cm de altura) com pinho fundamento de rapagem de madeira para transportar ratos de gaiolas em casa para testes quartos.
4. Lidar com ratos 3 min por dia durante 5 dias antes de começar os experimentos.
5. Prepare 120 mL de morfina para todo o experimento. Dissolver o cloridrato de morfina em 0,9% NaCl (soro fisiológico) em uma concentração final de 20 mg/mL. Armazenar em temperatura ambiente (RT).
6. Prepare-se 10 mL da solução de pentobarbital de sódio para a cirurgia. Dissolver o pentobarbital de sódio em 0,9% NaCl na concentração de 1 g/mL. Loja a 4 ° C.
7. Prepare-se 10 mL de benzoato de estradiol (EB) e 10 mL de progesterona para indução artificial de estro. Dissolva o benzoato de estradiol e progesterona em óleo de gergelim em concentrações de 0,125 mg/mL e 5 mg/mL, respectivamente.
   Nota: Incube a suspensão de óleo do EB ou progesterona em um banho de água (55-60 ° C) pelo menos 1 h e então completamente agitá-lo. Certifique-se de que o EB ou progesterona é completamente dissolvida. Loja em RT.
8. Para o arriscado busca recompensa comportamento de teste, use as câmaras do campo aberto recompensa-proximidade de vidro acrílico preto. Em uma das extremidades da arena campo aberto (85 cm comprimento x 35 cm largura x 50 cm de altura) montar uma gaiola de estímulo de tela de arame (15 cm comprimento x 25 cm largura x 25 cm de altura). Instale a placa com pinos no chão na frente da gaiola de estímulo, com cerca de 20 cm.
   Nota: Os pinos são fixos na 34,5 cm comprimento x placas de largura de 13 cm (Figura 1). As placas com três tipos de pinos são usadas por sua vez, durante o teste (tabela 2).

2. indução de cio nas fêmeas e acasalamento de triagem em machos

1. Ovariectomia bilateral em ratos fêmeas
   Nota: Os instrumentos cirúrgicos e outros itens usados na cirurgia são estéreis. E a cirurgia é realizada utilizando a técnica asséptica.
   1. Preparar os instrumentos cirúrgicos e materiais como bisturis, lâminas cirúrgicas, pinça hemostática, pinças, tesouras oftálmicas, gaze, cotonetes de algodão, agulhas de sutura e suturas de seda com antecedência, assim como 75% de álcool, iodo, sódio pentobarbital, 0,9% NaCl, sódio de penicilina.
   2. Intraperitonealmente injete pentobarbital de sódio (55 mg/kg), à espera de anestesia completa de ratos fêmeas. Ratos Regalarsi suavemente e não reagir a pitada da cauda.
      Nota: A ovariectomia é executada somente quando o peso do rato fêmea atinge pelo menos 240 g.
   3. Coloque o rato fêmea em posição prona, raspar o pelo nas costas e desinfectar a pele exposta com Iodofor. Use um bisturi para fazer uma incisão vertical média (cerca de 2 cm de comprimento) na parte traseira (1 cm abaixo da borda da caixa torácica).
   4. Puxar a pele para o lado esquerdo, e blunt dissecar o tecido subcutâneo com pinça hemostática para expor os músculos lombares. Corte a camada muscular (incisão de 1 cm) na cavidade abdominal, até atingir o tecido adiposo.
   5. Puxe o tecido adiposo com uma pinça curvada e localize o ovário, que é um tecido de carne-de-rosa (cerca de 0,5 cm x 0,4 x 0,3 cm) rodeado por tecido adiposo com o entrelaçamento de Falópio na superfície.
   6. Fixar o tubo de Falópio com fórceps e ligate-lo e, em seguida, cortar o ovário juntamente com o tecido adiposo.
   7. Volte a colocar o tubo de Falopio residual e tecido adiposo na cavidade abdominal após assegurar sem sangramento e a camada muscular da sutura.
   8. Remover o ovário do outro lado com o mesmo procedimento e em seguida de sutura a incisão da pele.
   9. Coloque o rato sobre um cobertor aquecido até despertar e então colocá-lo de volta na gaiola em casa.
   10. Após pelo menos duas semanas de recuperação, use os ratos fêmeas como uma ferramenta para triagem e testes comportamentais de acasalamento.
       Nota: Preste atenção ao estado do rato fêmea após a cirurgia e fornecer alimentação e água adequada. Manter os ratos ovariectomizados único abrigados por uma semana e então a casa quatro por gaiola.
2. Indução de estro em ratos fêmeas ovariectomizados
   1. Lidar com ratos fêmeas ovariectomizados tudo três vezes (3 min/dia) antes de usá-los para triagem de acasalamento.
      1. Delicadamente pegar um rato da caixa de transporte com a mão esquerda e segure nos braços por alguns segundos. Então o rato na caixa e repetir estas operações por 3 min.
   2. Injectar por via subcutânea benzoato de estradiol (25 μg/rato) cerca de 48 – 52 h antes acasalamento triagem ou o teste de conflito.
   3. Por via subcutânea injetar progesterona (1 mg/rato) cerca de 4-6 h antes acasalamento triagem ou o teste de conflito.
      Nota: As hormonas estrogénicas são injetadas por via subcutânea na parte de trás do pescoço. Desde que um ciclo de estro dura ~4\u20125 dias, os ratos fêmeas são usados uma vez por semana.
3. Rastreio de ratos machos para acasalamento desempenho
   Nota: Triagem é conduzida sob luz fraca durante a fase escura do ciclo claro/escuro na sala de habitação.
   1. Coloque um rato masculino individualmente na caixa (60 cm comprimento x 50cm largura x 40 cm de altura) com pinho fundamento do corte de madeira e deixe-o se habituar por 5 min.
   2. Introduza um rato fêmea estral os comportamentos copuladores masculinos caixa e monitor (por observadores experientes).
   3. Coloque os ratos para gaiolas em casa depois de ratos machos completar sua primeira ejaculação dentro de 30 min ou não exibir intromissão dentro de 15min ou ejaculação dentro de 30 min.
   4. Atribua os ratos machos que passam a triagem (ejaculação bem sucedida durante três dias consecutivos) aleatoriamente em diferentes grupos (tais como os grupos tratados de solução salina e morfina).

3. pré-tratamento em ratos machos antes do teste de conflito

1. Tratamento de compulsão, como morfina
   Nota: Ratos machos são injetados intraperitonealmente com solução salina ou morfina entregue em um regime de compulsão, como¹⁴ (tabela 1).
   1. Os ratos masculinos de pesar e calcular o volume de injeção para cada rato com base no peso do corpo (ver tabela 1).
   2. Prepare as seringas com morfina ou solução salina soluções.
   3. Injetar um rato em um momento intraperitonealmente e imediatamente, coloque-a suavemente no ringue em casa (4 ratos/gaiola).
   4. Depois de pelo menos 6 h, dar ratos masculinos a segunda injeção da mesma forma.
2. Estresse agudo
   Nota: Choques de pé são entregues antes de cada teste de conflito nas quatro câmaras idênticas montados com quatro geradores de choque e controladas pelo profissional software instalado em um computador.
   1. No dia do teste de conflito, leve os ratos masculinos para outro quarto diferente do conflito do quarto de teste.
   2. Coloque os ratos machos em câmaras de (30,5 cm comprimento x 25,4 cm de largura x 30,5 cm de altura) para se habituar por 1 min.
   3. Configure o programa de software com antecedência. O programa inclui os choques intermitentes pé entregados dentro de 10 min (0,5 mA x 0,5 s x 10 min; significa inter choque intervalo 40 s, escala s 10-70).
   4. Digite animal IDs e escolher se quer ligar os geradores de choque de acordo com o agrupamento (o grupo de choque e o grupo de controle). Em seguida, pressione o botão Iniciar .
   5. Quando for concluído o procedimento de stress, traga os ratos imediatamente para a sala de teste de conflito nas caixas de transporte; um rato por caixa.

4. o teste de conflito

Nota: O teste é realizado sob luz fraca durante a fase escura do ciclo claro/escuro na sala de teste de conflito.

1. No dia antes do teste, trazer todos os ratos para a sala de teste de conflito e permitir que se habituar a câmara de campo aberto recompensa-proximidade (sem qualquer obstáculo, Figura 1) por 15 min.
2. No dia do teste, coloque o rato masculino na câmara, permitindo a exploração livre por 10 min (sob a mesma condição que o dia antes do teste).
3. Coloque um rato fêmea estral na gaiola-estímulo como incentivo e permitem que o macho sujeitas a abordagem livremente e investigar o rato incentivo por 5 min.
   Nota: O rato masculino aleatoriamente é exposto a uma fêmea estral, e esta fêmea não é um rato familiar.
4. Após 5 min livre abordagem, mudar o assunto masculino da jaula de estímulo para a outra extremidade da arena, coloque um obstáculo (um 14 cm de largura placa grossa com pinos) e em seguida, iniciar o primeiro julgamento do teste.
   Nota: O nível de dificuldade dos obstáculos é variado entre baseados em tipos de pinos e a altura da placa. O sistema de classificação é mostrado na tabela 2.
5. Mova o rato macho longe o estímulo-gaiola 15 – 20 s após cada vez que supera o obstáculo.
6. Fim de um julgamento se o sujeito masculino sobe ou pula sobre o obstáculo 3 vezes dentro de 4 min e imediatamente começar o próximo julgamento com o aumento da dificuldade do obstáculo.
7. Se um assunto masculino supera o obstáculo a menos de três vezes dentro de 4 min, terminar o teste e registrar os tempos que supera o obstáculo.
8. Trazer o rato macho volta para a gaiola em casa e esfregar a câmara de campo aberto com 0,05% de ácido acético glacial.
9. Pontuação cada ultrapassar (ou aproximando) conforme tabela 2. Use a soma das pontuações para todos os surmountings como uma pontuação total para um assunto masculino neste teste de conflito.

5. análise estatística

1. Apresente os dados como média ± SEM ou pontos de dados únicos. No caso é desafiada a homogeneidade da variância ou distribuição normal de conjuntos de dados, log-transformar os conjuntos de dados.
2. Analisar os efeitos do tratamento prévio de morfina no comportamento de busca de recompensa, exibido no dia 7 e 17 da retirada (Wd7 e Wd17) usando t-testes com "pré-tratamento" como um fator entre sujeitos (morfina versus solução salina, Figura 2).
3. Analisar os efeitos do tratamento prévio de morfina no comportamento de busca de recompensa após repetidas testes usando análise de variância da repetido-medida (ANOVA) com "tempo da retirada" (Wd7 contra Wd14) como o fator de dentro-temas e "pré-tratamento" (morfina versus salina) como um fator entre indivíduos.
4. Além disso, use a correlação de Pearson para analisar a correlação entre as pontuações que assuntos masculinos adquiridos nos dias 7 e 14 de abstinência (Wd7 e Wd14, Figura 3).
   Nota: Após a conversão logarítmica dos dados originais, são realizadas análises estatísticas.
5. Analisar o efeito do estresse agudo sobre o comportamento de busca de recompensa em drogas-ingênuo ratos usando o teste-t com o estresse como um fator entre sujeitos (choque versus controle, Figura 4)

Resultados

Para explorar se este modelo de conflito pode revelar o comportamento de busca de recompensa mal-adaptativos/risco induzido por opiáceos, os comportamentos de busca de recompensa exibidos pelos grupos de solução salina e morfina-pré-tratados foram comparados pelo testes t após a curto prazo (Wd7) e a longo prazo (Wd17) a retirada da morfina respectivamente (Figura 2). Os resultados mostram que, no dia 7 e dia 17 de retirada, os ratos pré-tratados de mor...

Discussão

Os défices de controle inibitório causados por drogas de abuso¹⁸ desempenham um papel fundamental na promoção de drogas compulsiva buscando/tendo comportamentos e recaída^19,20. O modelo de conflito apresentado aqui oferece uma nova abordagem para explorar as mudanças no controle inibitório dos indivíduos expostos a drogas que viciam.

Existem vários passos críticos no protocolo. Em primeiro lugar, os su...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Beijing Tongguangjingxi Chemical company	CN No.81601	CH3COOH
Benzypenicillin sodium for Injection	Huabei Pharmaceutical	F7072109	C16H17N2NaO4S
Cotton swabs	Wan Xin, Shandong, China	8 cm
β-estradiol benzoate	SIGMA-ALDRICH	E8515-200MG	estradiol benzoate
Gauze	Wan Xin, Shandong, China	21s × 21s 110×100
Hemostatic forceps	Beijing Zhong Sheng Wanda Biotechnology Co.,Ltd.
Morphine hydrochloride	Qinghai Pharmaceutical Co. Ltd	20100105	Morphine hydrochloride
Ophthalmic scissors	Beijing Zhong Sheng Wanda Biotechnology Co.,Ltd.
Pentobarbital Sodium	Sigma		C11H17O3N2Na
Precision animal shocker	Coulbourn
Progesterone	SIGMA-ALDRICH	V900699-5G	progesterone
Sesama oil	Fengyi trading company ltd.		Sesama oil
Sodium chloride injection	HuaLu Pharmaceutical	H17092107	NaCl
Scalpels	Gillette	96797241
Surgical blades	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd
Suture needles	Han Qin, Shanghai, China	Δ1/2 6×14
Silk sutures	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd
Sprague-Dawley rats	Vital River Animal Center, Beijing, China	Sprague-Dawley	animal strain
Syringe	WeiGao Group Medical Polymer Co.Ltd	1 mL, 2 mL
Tweezers	Beijing Zhong Sheng Wanda Biotechnology Co.,Ltd.