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Resumo

Aqui nós apresentamos um método para preparar organotypic fatia de culturas de cerebelo de rato e bainha de mielina coloração por IHQ apropriado para investigar mecanismos de mielinização e como no sistema nervoso central.

Resumo

No sistema nervoso, mielina é uma estrutura complexa membrana gerada pela microambiental glial cells, que ensheathes de axônios e facilita a condução elétrica rápido. Alteração da mielina foi mostrada para ocorrer em várias doenças neurológicas, onde é associado com déficits funcionais. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um ex vivo modelo consiste em fatias cerebelar organotypic do mouse, que podem ser mantidas em cultura por várias semanas e ainda mais ser rotulado para visualizar a mielina.

Introdução

Os neurônios são células altamente polarizadas, que compõem um compartimento somato-dendríticas que recebe entradas do seu ambiente e um axônio que garante a geração e a propagação de impulsos elétricos para outras células. Propagação rápida e entrega oportuna de informações é essencial para o bom funcionamento do sistema nervoso. Nos vertebrados, isto é facilitado pela mielinização, que permite aumentar a velocidade de condução axonal1. Mielina é uma estrutura especializada, formada por camadas compactadas de membrana de plasma gerada pela microambiental glia, nomeadamente oligodendrócitos no sistema nervoso central (SNC) e células de Schwann no sistema nervoso periférico (SNP). Tanto no SNC e o SNP, interações axoglial conduzir a formação de domínios axonal especializados: os nós de Ranvier e sua envolvente domínios, paranodes e juxtaparanodes2. Os segmentos axonal isolados por mielina, ou entrenós, alternadas com os nós de Ranvier, que correspondem a pequenos domínios amielínicas enriquecidos em canais de sódio voltagem-dependentes (atv). A alta concentração e ativação rápida de canais dev at aos nós de Ranvier permitir a regeneração dos potenciais de ação e em conjunto com as propriedades de isolamento das bainhas de mielina, assegurar a condução eficiente e rápido insulada do impulso nervoso ao longo do axônio3.

Além de seu papel em acelerar a velocidade de condução do impulso nervoso, microambiental glia fornece suporte metabólico para o axônio, preservando sua integridade a longo prazo e participando de sua sobrevivência4,5. Além disso, é evidente em anos recentes que a mielina é modulada dinamicamente ao longo da vida, assim, presumivelmente participando de regulamento e plasticidade das várias funções do sistema nervoso. Ajustes da distribuição, número, comprimento e espessura das bainhas de mielina ao longo do axónio, portanto, podem representar uma nova maneira para ajustar finamente várias redes6,7,8. Portanto, a aquisição evolutiva de mielina é um processo chave para funções sensoriais, motoras e cognitivas e a perturbação da interação entre axônios e glia é cada vez mais considerada como contribuindo para o desenvolvimento ou adquirida neurológica doenças9.

Composição de mielina tem sido caracterizada, com a característica específica de uma elevada percentagem de lípidos (70%) em comparação com as proteínas (30%) em contraste com outras membranas celulares10. No entanto, ao contrário de lipídios de mielina, a maioria das proteínas da mielina é específica para mielina, incluindo a proteína básica da mielina (MBP), proteína proteolipid (PLP), 2', glicoproteína de 3'-fosfodiesterase (CNP), associada a mielina de nucleotídeos 3'-cíclico (MAG), glicoproteína mielina-oligodendrocyte (MOG), PMP-22 e P010. Histológicos existem vários métodos para manchar a mielina com base na sua composição de lipídios, tais como Luxol rápido azul11, Sudão negro B12, Baker hematina ácida método13, bem como prata coloração de14. No entanto, essas abordagens não sempre permite um contraste adequado e resolução para visualizar as fibras individuais. Uma abordagem alternativa para detectar mielina é através de imuno-histoquímica dirigido contra as proteínas da mielina. Vários anticorpos antígenos específicos de mielina de destino com uma alta especificidade e podem ser usados rotineiramente para detectar estruturas mielinizadas. A interação antígeno-anticorpo pode ser revelada ainda mais usar um anticorpo secundário acoplado a um fluoróforo dirigido contra o anticorpo primário e visualizado com microscopia de fluorescência adequada. Aqui, descrevemos um protocolo imunoquímico para manchar a mielina em ex vivo cerebelar fatias, um modelo que permite uma boa preservação da arquitetura do tecido nervoso. Além disso, a organização e o tamanho das células de Purkinje (o único neurônio mielinizada do cerebelo) torná-los um modelo clássico para Estudos eletrofisiológicos e eles são da mesma forma ideais para realizar estudos fixos ou imagens ao vivo.

As fatias Cerebelares são geradas a partir de ratos P9-P10, um tempo correspondente do início da célula de Purkinje mielinização, um processo que é principalmente alcançado por uma semana ex vivo (6-7 dias in-vitro, DIV)15. Além disso, este modelo é adaptado para investigar distúrbios desmielinizantes como esclerose múltipla (MS), como uma desmielinização extensa pode ser induzida em fatias Cerebelares usando o myelinotoxic composto lysophosphatidylcholine (ou lysolecithin, LPC), Qual é seguida por um espontâneo como16,17. Como endógeno ocorre dois dias após a remoção de LPC, meio de cultura e é quase completo de um tratamento de post da semana.

A conclusão do presente protocolo leva cerca de 3 semanas, incluindo a metade de um dia para a preparação de culturas cerebelar fatia, uma semana para obter fatias totalmente mielinizadas, seguidas por 2 dias para atingir o pico de desmielinização e mais uma semana para seu pleno mielinogênese. Além disso, a imuno-histoquímica pode ser concluído em 2 dias. O protocolo descrito aqui é adaptado um padrão ninhada de 6 filhotes de ratos e precisa ser adaptado em relação ao número de animais utilizados para o experimento planejado.

Protocolo

Todos os trabalhos que envolvam animais respeitadas condições institucionais e orientações estabelecidas pela UPMC, INSERM e o francês e Europeu directiva comunitária 86/609/CEE.

1. preparação do meio de cultura e cultura insere (hands-on tempo ≈ 10 – 15 min)

Nota: Execute esta etapa em uma capa de cultura de fluxo sob condições estéreis

  1. Prepare-se 40 mL do meio de cultura, que consiste em 50% BME, equilibrada solução 25% do Hank salina (1x), soro, suplementado com derivado de glutamina 2 mM, 100 UI/mL penicilina-estreptomicina e 4,5 mg/mL, D-glicose 25% inactivadas pelo calor do cavalo. Ajuste o pH para 7,4.
  2. Filtro-esterilize o meio através de 0,22 μm filtro adaptado em uma seringa de plástico de 50 mL.
    Nota: Meio de cultura podem ser armazenado a 4 ° C pelo menos uma semana.
  3. Para uma padrão ninhada de 6 filhotes, use duas placas de alvéolos 6 estéril. Para cada prato, remova a tampa e adicione 1 mL de meio de cultura por bem.
  4. Inserção de uma cultura local em cada poço individual, segurando a borda plástica com Pinças esterilizadas. Coloque a tampa da placa.
    Nota: As fatias Cerebelares coletadas de um filhote (6-8) podem ser expedidas em duas membranas (3-4 fatias Cerebelares por inserção de membrana).

2. preparação de dissecação médio (hands-on tempo ≈ 5 min)

Nota: Execute esta etapa em uma capa de cultura de fluxo sob condições estéreis

  1. Prepare 100 mL de meio de dissecação, que consiste solução do Gey salina balanceada suplementado com 4,5 mg/mL x D-glicose e 1 penicilina – estreptomicina (100 UI/mL cada).
  2. Filtro-esterilize o meio através de uma unidade de filtro 0.22 μm.
    Nota: O meio de dissecação pode ser armazenado a 4 ° C durante pelo menos um mês.
  3. Adicione 5 mL de meio de dissecação frio em pratos de cultura de células de 60 mm. Prepare um prato de cultura celular de 60 mm para cada filhote para serem dissecados.
  4. Mantenha os pratos de dissecação no gelo até o uso.

3. preparação do material de dissecação (hands-on tempo ≈ 15 min)

  1. Limpe o banco com 100% de etanol.
  2. Esterilize todos os instrumentos de dissecação, uma lâmina de barbear e plataforma de plástico do helicóptero tecido com 100% de etanol.
  3. Fixar a lâmina de barbear e a plataforma de plástico no helicóptero do tecido e ajustar a espessura de corte de 300 µm.
  4. Certifique-se de que todo o etanol evaporou-se antes de iniciar a dissecação.

4. CerebellumDissection e preparação de secções (hands-on tempo ≈ 15 – 20 min por animal)

  1. Coloque um dos pratos de cultura 60mm célula contendo o meio de dissecação gelada sob o microscópio binocular e remover a placa superior.
  2. Limpe a pele da cabeça com etanol a 70% (com cuidado, evitando tocar os olhos do animal) e decapitar o animal com uma tesoura afiada grande, de acordo com o procedimento aprovado.
    Nota: As fatias Cerebelares são geradas a partir de P9-P10 ratos sem sexo específico ou tensão de polarização.
  3. Use tesoura pequena para cortar a pele ao longo da linha mediana da cabeça a partir do pescoço e indo até o focinho do rato.
  4. Para agarrar a cabeça e expor o crânio, dobre a pele ventralmente sob a cabeça e aperte as duas dobras da pele entre os dedos.
  5. Inserir suavemente a tesoura pequena o foramen magnum e cortar o crânio, tornando um lateral incisão para o lado e em seguida, corte ao redor do cabeça crânio. Mantenha a ponta da tesoura como paralelo e perto do crânio quanto possível durante o corte, para não danificar o tecido cerebral.
  6. Recupere a parte dorsal do crânio usando pinça fina-em linha reta. Simultaneamente, levante cuidadosamente a parte dorsal do crânio, cortar as meninges aderente (membrana irrigada translúcida em torno do tecido cerebral) se necessário com uma tesoura pequena para não danificar o tecido cerebral.
  7. Introduzir cuidadosamente bem reta pinça (ou alternativamente, usar uma espátula) entre o cérebro e o crânio ventral, delicadamente pirar o cérebro e corte a óptica e nervos trigêmeo com uma tesoura pequena.
  8. Ajuda o cérebro a cair por gravidade para o prato de cultura celular 60 mm contendo meio de dissecação gelada, girando a cabeça de cabeça para baixo logo acima do prato e liberação das aderências ontem com tesouras pequenas se necessário.
  9. Usando a pinça fina, Oriente o cérebro com o lado dorsal, virado para o pesquisador e o lado ventral deitado no fundo do prato.
  10. Sob o microscópio binocular, use a pinça fina reta para imobilizar o cérebro do lado do prosencéfalo e evite tocar o rombencéfalo, como ele pode ficar danificado. Separar o rombencéfalo do resto do cérebro (frente - e mesencéfalo, ver esquema na Figura 1Aa), usando a pinça fina-em linha reta. Para separar o cerebelo do resto do rombencéfalo, use a pinça fina para cortar os pedúnculos cerebelares por baixo do cerebelo (ver esquema na 1Aa figura ').
  11. Uma vez que o cerebelo é isolado, cuidadosamente rasgar as meninges usando pinça fina-reto (ver esquema na 1Aa figura ').
  12. Mantenha o cerebelo suavemente com a pinça curva bem e coloque-a com o lado dorsal acima sobre a plataforma plástica perpendicularmente para a lâmina de barbear de helicóptero (ver esquema na Figura 1Bb).
  13. Aspire o excesso de meio de dissecação em torno do cerebelo usando uma ponteira de pipeta estéril de ponta fina, adaptada em um 1 mL pipeta (ver esquema na Figura 1Bb).
  14. Certifique-se que o cerebelo estabelece plana, mas não esticada, uma vez colocado na plataforma para obter fatias sagitais ideais durante o corte (ver esquema na Figura 1Bb).
  15. Fatia de 300 μm de espessura seções sagitais do cerebelo com o helicóptero do tecido (ver esquema na Figura 1Bb'). A força e a velocidade da lâmina tem que ser otimizado no site.
  16. Delicadamente adicione uma gota de meio de dissecação para o cerebelo fatiado. Usando uma ponta de pipeta de largo diâmetro colocada uma pipeta de 1 mL, lentamente, Aspire o cerebelo fatiado e transferi-lo de volta para o prato de cultura de células de 60 mm contendo meio de dissecação gelada (ver esquema na Figura 1Bb ').
  17. Limpe a plataforma de plástico do helicóptero tecido com 100% de etanol entre cada corte do cerebelo. Deixe o etanol evaporar antes de colocar o cerebelo próximo à plataforma.
  18. Use duas belas reta pinça (ou alternativamente agulhas de titânio) para separar as fatias individuais e selecione o vermis 6-8 fatias (ver esquema na Figura 1Cc e 1Cc').
  19. Pegue uma placa de 6 com inserções de cultura e transferir até 4 fatias selecionadas para inserir uma cultura junto com algum meio de dissecação, usando uma ponta de pipeta de largo diâmetro adaptada em uma pipeta de 1 mL (ver esquema na Figura 1Cc').
  20. Coloque as fatias no meio de inserção da cultura usando a dissecação médio ou fórceps para empurrar e puxá-los delicadamente no local certo, evitá-los para estar em contacto com os outros (ver esquema na Figura 1Cc').
  21. Remova qualquer excesso de meio de dissecação em torno as fatias com uma ponta de uma pipeta de ponta fina. Certifique-se de que as fatias deitado na membrana (ver esquema na Figura 1Cc').
  22. Coloque a placa de 6-poços em incubadora imediatamente após ter adicionado as fatias na membrana.

5. fatias de cultura e desmielinização (hands-on tempo ≈ 15 – 20 min)

Nota: Execute esta etapa em uma capa de cultura de fluxo sob condições estéreis

  1. Substitua o meio de cultura com 1 mL por bem de meio de cultura fresco pré-aquecido e tamponado em 3 dias após a preparação da fatia.
  2. De desmielinização, remover todos os meio de cultura abaixo a cultura insere após 6 dias in vitro (DIV) e substituí-lo com 1 mL por bem de meio de cultura fresco pré-aquecido contendo 0,5 mg/mL LPC. Incube por 15-17 h a 37 ° C, 5% de CO2.
  3. Após a incubação, lave as inserções, colocando-os em um prato de petri de 25 mm contendo 1 mL de meio de cultura previamente aquecido.
    Nota: As pastilhas devem estar em contacto com o meio, mas não por ela abrangidos.
  4. Transferi imediatamente as inserções de cultura em uma nova 6 placa contendo meio de cultura fresco pré-aquecido.
  5. Substitua o meio de cultura com 1 mL de meio de cultura fresco pré-aquecido a cada 2-3 dias até fatias de fixação.

6. imuno-histoquímica (hands-on tempo ≈ 01:30 – 2 h)

Nota: Realize as etapas 6.1. a 6.3. sob uma coifa. Evitar a exposição ao paraformaldeído (PFA) e consulte a ficha técnica de segurança do produto para a manipulação adequada e proteção.

  1. Uso de fórceps para levantar cada cultura insere segurando a borda do plástica e remove o meio de cultura sob as inserções de membrana de cada poço.
  2. Corrigir as fatias Cerebelares por 30 min, adicionando 2 mL de 4% PFA em 1 x pH PBS 7.4 para as inserções de membrana.
    Nota: Ponto de fixação de tempo depende do estágio de mielinização estudada: DIV 4 corresponde ao aparecimento de mielinização, 7 DIV para fatias totalmente mielinizadas. Em caso de tratamento de LPC, DIV 9 corresponde ao pico de desmielinização, 11 DIV ao aparecimento de mielinogênese e 14 DIV para fatias de remyelinated totalmente.
  3. Lave as inserções com as fatias de três vezes com 2 mL 1X PBS para 10 min.
  4. Separe as fatias as inserções de membrana sob o microscópio binocular usando um x 25 para ampliação de 30x, empurrando suavemente-los usando um bisturi ou um pincel. Como alternativa, para evitar o risco de danificar as fatias enquanto eles desanexação da membrana, use um bisturi para cortar a membrana com as fatias ainda ligadas.
  5. Transferi as fatias flutuantes para os poços de uma placa 4 contendo 1X PBS, usando um pincel.
  6. Aspirar a PBS de cada poço e incubar as fatias em pre-cooled etanol 100% a-20 ° C por 15 a 20 min. Este passo facilita a penetração de anticorpo em fibras mielinizadas.
  7. Aspirar o etanol 100% e lave uma vez brevemente com 1 x PBS, em seguida, duas vezes em PBS 1x durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  8. Aspirar a PBS e incubar as fatias por 30 a 45 min com uma solução contendo 1X PBS, 5% NGS, 0,3% de detergente não-iônico em temperatura ambiente para bloquear sites de fixação do anticorpo específico.
  9. Aspire a solução do bloqueio. A lavagem não é necessária.
  10. Incubar as fatias durante a noite com os anticorpos primários diluídos no bloqueio de solução a 4 ° C. Para visualizar a mielina em fatias organotypic cerebelar, use MBP (frango, 1/150 ou Mouse IGg2b, Smi99, 1/200) ou PLP (rato, hibridoma, 1/5 a 1/10) anticorpos.
    Nota: Para revelar a expressão de mais de um antígeno na mesma fatia, executar um duplo ou triplo que mancham o procedimento (veja a Figura 1 como um exemplo). Para realizar a incubação simultaneamente, certifique-se de anticorpos primários são produzidos em diferentes espécies. Em seguida, use seus anticorpos correspondentes secundários acoplados ao diferente fluorophores (ver Tabela de materiais para nodal e paranodal marcador18 anticorpos).
  11. No segundo dia, lave as fatias três vezes em PBS 1x por 10 min.
  12. Incube durante 3h com os anticorpos secundários diluídos em solução (diluição de 1/500) no escuro à temperatura de bloqueio.
    Nota: Otimização do tempo de diluição e incubação do anticorpo pode ser necessária ao usar outros anticorpos do que os descritos aqui.
  13. Lave as fatias três vezes em PBS 1x por 10 min no escuro.
  14. Sob um microscópio binocular, monte as fatias numa lâmina de vidro. Coloque 100 µ l de PBS 1x no slide e transfira as fatias para a PBS, usando um pincel. Desdobrar as fatias se necessário e achate-os no slide. Remova qualquer excesso de PBS. No caso do immunolabeling é realizada com as fatias ainda ligadas às membranas, monte com as fatias enfrentando a lamela, com a membrana sobre a lâmina de vidro.
  15. Coloque uma gota de meio de montagem diretamente no sentido do lamela de vidro e cubra delicadamente as fatias. Slides montados podem ser armazenadas por vários meses a 4 ° C, no escuro.

Resultados

Exemplos de mielina representante immunostainings em organotypic cerebelar fatias obtidas P9 P10 C57black6 tipo selvagem (WT) (Figura 2A), bem como ratos transgénicos PLP-GFP (Figura 2B), juntamente com células de Purkinje coloração. Myelinate de substância branca Cerebelares fatias faixas região das fatias em direção a periferia da folia e mielinização das células de Purkinje é principalmente alcançada depois de 6 a...

Discussão

Aqui, detalhamos um protocolo para gerar um ex vivo modelo correspondente para as culturas de fatia de rato organotypic cerebelar, adaptado de anteriormente métodos publicados15,16,19 e a mielina subsequente immunostaining dessas preparações. Esta estratégia oferece a possibilidade de visualizar os componentes da mielina com uma alta resolução em Estados saudáveis e patológicos.

Organotypic ce...

Divulgações

Nenhum dos autores tem interesses concorrentes ou interesses conflitantes.

Agradecimentos

Agradecemos o Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon e Dr. Thomas Roux por valiosos comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo INSERM, ICM, ARSEP subsídios R13123DD, R17127DD ANR (a D.C.) e comunhão FRM, SPF20110421435 (a A.D.), FDT20170437332 (para M.T.). Agradecemos a estrutura de cultura de células CELIS e o icm. Plataforma de imagem Quant.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
BME mediumThermoFisher Scientific41010026
Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS)ThermoFisher Scientific14180046
GlutaMAX (100x)ThermoFisher Scientific35050038
Heat-inactivated Horse SerumThermoFisher Scientific26050088
Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Gey’s Balanced Salt SolutionSigma AldrichG9779-500ML
D-Glucose Solution (45%)Sigma AldrichG8769-100ML
Lysophosphatidylcholine (LPC)Sigma AldrichL4129-100MG
Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15714
Absolute ethanol (100% ethanol)VWR Chemicals20821.330Cooled at -20°C
Triton® X-100Sigma AldrichX100-500ML
10% Normal Goat Serum (NGS)ThermoFisher Scientific500622
Phosphate Buffer SolutionEuroMEDEXET330-ApH 7.4
Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)Merck Millipore06-896Dilution 1/300
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)Merck MilliporeAB9348Dilution 1/150
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)Merck MilliporeNE1019Dilution 1/200
Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, JapanDilution 1/5 to 1/10
Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)Sigma AldrichS8809Dilution 1/150
Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)Abcamab34151Dilution 1/500
Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405ThermoFisher ScientificDilution 1/500
FluoromountSouthernBiotech0100-20
Tissue chopperMcIlwain
Razor blades
Large scissorsF.S.T14101-14
Small scissorsF.S.T91500-09
Fine-straight forcepsF.S.T91150-20
Curved-fine forcepsF.S.T11297-00
Cell culture dishes (60 mm and 100 mm)TPP
4-, 6-well culture platesTPP
Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter)Merck MilliporePICM0RG50
Cell culture incubator37°C, 5% CO2
Fine-end pipette tipsDutscher134000CL
Wide-bore pipette tipsThermoFisher Scientific2079G
Sterile syringeTerumo Europe20 or 50 mL
Sterile syringe filtersTerumo Europe0.22 µm
ScalpelSwann-Morton0510
Brush
Microscope slidesRS France76 mm x 26 mm x 1.1 mm
Glass coverslipsRS France22 mm x 22 mm
Kimtech Sciences Tissue WipersKimberly-Clark Professional5511
Binocular microscope

Referências

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