준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

요약

여기 우리 organotypic 슬라이스 문화 마우스 소 뇌 및 myelination와 중앙 신 경계에 remyelination의 메커니즘을 조사 적합 immunohistochemistry에 의해 얼룩 myelin 칼 집에서 준비 하는 방법을 제시.

초록

신 경계에서 수 초 이며 glial myelinating에 의해 생성 된 복잡 한 막 구조 세포, 어떤 ensheathes 축 삭 빠른 전기 전도 용이 하 게. Myelin 변경 어디 기능적인 적자와 관련 된 다양 한 신경 질환에 표시 되었습니다. 여기, 우리는 전직에 대 한 자세한 설명을 제공 vivo 모델 마우스 organotypic 소 뇌 조각, 여러 주 및 추가 표시 myelin를 시각화를 위한 문화에서 유지 될 수 있는 구성 된.

서문

신경 세포는 그것의 환경 및 생성 및 다른 세포에 전기 자극의 전파를 보장 하는 축 삭에서 입력을 받는 somato 수지상 구획을 구성 하는 매우 편광된 세포 이다. 빠른 전파와 정보의 적시 납품은 신경 시스템의 적절 한 작동에 대 한 필수적입니다. 척추 동물, 그것은 myelination axonal 전도 속도¹증가 수에 의해 촉진 된다. Myelin 압축된 계층 myelinating 명과 의해 생성 된 플라즈마 멤브레인의 중앙 신경 조직 (CNS)에 즉 oligodendrocytes 및 Schwann 세포는 말 초 신 경계 (PNS)에 의해 형성 된 특수 구조 이다. CNS 그리고 PNS에서 둘 다, axoglial 상호 작용 드라이브 전문된 axonal 도메인의 형성: 노드의 Ranvier와 그들의 주변 도메인, paranodes, 및 juxtaparanodes². 수 초, 또는 internodes, 전압 개폐 나트륨 채널 (Na_v)에서 풍성 하 게 하는 작은 unmyelinated 도메인에 해당 하는 노드의 Ranvier와 대체 절연 axonal 세그먼트. 높은 농도 및 노드의 Ranvier에서 나_v 채널의 급속 한 활성화 활동 전위 그리고 myelin 칼 집의 단 열 속성 함께 재생을 허용, 보장의 효율적이 고 빠른 saltatory 유도 따라³축 삭 신경 충 동입니다.

신경 임펄스의 전도 속도 가속에 그것의 역할, myelinating 명과 장기 무결성을 보존 하 고 그것의 생존^4,5에 참여, 축 삭에 대사 지원을 합니다. 또한, 그것은 취소 되고있다에서 최근 몇 년 동안 그 myelin는 인생, 따라서 아마도 참가 규정 및 다양 한 신 경계 기능의가 소성을 통해 동적으로 변조. 배포, 숫자, 길이, 및 축 삭을 따라 myelin 덮개의 두께 따라서 다양 한 네트워크^6,,78세밀 하 게 조정 하는 소설 방법을 나타낼 수 있습니다. 따라서, myelin의 진화 인수 감각, 모터 및 인지 기능에 대 한 핵심 프로세스 이며 축 삭과 명과 사이 상호 작용의 섭 동은 점점는 발달에 기여로 간주 또는 신경 인수 질병⁹.

지질 (70%)의 높은 비율의 특정 기능 myelin 구성 특징 되었습니다. 단백질 (30%)에 비해 달리 다른 세포 막¹⁰. 그러나, myelin 지질, 달리 myelin 단백질의 대부분은 myelin, myelin 기본적인 단백질 (MBP), proteolipid 단백질 (PLP), 2', 3'-주기적인 뉴클레오티드 3'-포스 (CNP), myelin 연합 당단백질 (MAG)를 포함 하 여 관련 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG), PMP-22 그리고 P0¹⁰. Myelin 얼룩 다양 한 조직학 방법 존재 Luxol 빠른 블루¹¹등의 지질 구성, 수단 블랙 B¹², 베이커의 산 hematin 방법¹³로 실버¹⁴얼룩에 따라. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 방식을 적절 한 대비와 해상도 개별 섬유를 시각화를 위한 항상 허용 하지 않습니다. 수 초를 감지 하는 양자 택일 접근 immunohistochemistry myelin 단백질에 대 한 감독을 통해 이다. 다양 한 항 체는 높은 특이성으로 myelin 특정 항 원을 대상 고 myelinated 구조를 검출 하기 위하여 정기적으로 사용할 수 있습니다. 항 체 항 원 상호 작용은 1 차 항 체에 대 한 감독 및 적절 한 형광 현미경 검사 법으로 시각 fluorophore 결합 이차 항 체를 사용 하 여 추가 공개 수 있습니다. 여기, 우리는 토론 프로토콜 얼룩 myelin에 ex vivo 소 뇌 조각, 신경 조직 아키텍처의 좋은 보존 수 있는 모델을 설명 합니다. 또한, 조직 및 Purkinje 세포 (소 뇌의 유일한 myelinated 신경)의 크기 그들 electrophysiological 연구 클래식 모델 만들고 그들은 마찬가지로 고정 또는 라이브 이미징 연구를 수행 하기 위해 이상적입니다.

소 뇌 조각 Purkinje 세포 myelination, 비보 (6-7 일 생체 외에서, DIV)¹⁵전 1 주일에 의해 주로 달성 하는 과정의 초기 증상에 해당 하는 시간, P9-P10 생쥐에서 생성 됩니다. 또한,이 모델은 적응 demyelinating 질환 다 발성 경화 증 (MS) 등을 조사 하는 광범위 한 demyelination 또는 사용 하는 myelinotoxic 복합 lysophosphatidylcholine (lysolecithin, LPC), 소 뇌 조각에 유도 될 수 있다 어떤은 자발적인 remyelination^16,17옵니다. 내 인 성 remyelination 문화 매체에서 LPC 제거 후 2 일에서 그리고 거의 주 게시물 치료 완료.

이 프로토콜의 완성 등 소 뇌 조각 문화 준비 demyelination의 피크에 도달 하는 2 일 뒤 완전히 myelinated 슬라이스를 주, 그들의 전체에 대 한 다른 주에 대 한 반나절 approximatively 3 주 소요 remyelination입니다. 또한, immunohistochemistry 2 일 이내에 완료할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 6 쥐 새끼의 표준 쓰레기에 적응 그리고 계획 된 실험에 사용 되는 동물의 수에 적응 시킬 필요가 있다.

프로토콜

동물을 포함 하는 모든 작업 준수 기관 정책 및 지침 UPMC, INSERM 프랑스 및 유럽 공동체 위원회 지시 86/609/EEC에 의해 설립.

1. 준비 문화 매체와 문화의 삽입 (실습 시간 ≈ 10-15 분)

참고: 흐름 문화 후드 무 균 조건 하에서이 단계를 수행

1. 50%로 구성 된 문화 매체의 40 mL를 준비 공학은, 25% 행 크의 균형 소금 솔루션 (1x), 25% 열 비활성화 말 혈 청, 2mm 글루타민 파생, 100 IU/mL 페니실린-스와 4.5 mg/mL D-포도 당 보충. PH 7.4에 조정 합니다.
2. 필터-소독 매체 50 mL 플라스틱 주사기에 적응 0.22 μ m 필터를 통해.
   참고: 적어도 일주일에 4 ° C에서 문화 매체를 저장할 수 있습니다.
3. 6 강아지의 표준 쓰레기, 대 한 두 개의 살 균 6 잘 플레이트를 사용 합니다. 각 접시에 대 한 커버를 제거 하 고 잘 당 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다.
4. 장소 문화 삽입 각 개별 잘 소독 집게와 플라스틱 가장자리를 눌러. 접시에 다시 커버를 넣어.
   참고: 한 강아지 (6-8)에서 수집한 소 뇌 조각 두 막 (멤브레인 삽입 당 3-4 소 뇌 조각)에 파견 될 수 있다.

2. 절 개 매체의 준비 (손을 ≈ 시간 5 분)

참고: 흐름 문화 후드 무 균 조건 하에서이 단계를 수행

1. 절 개 매체, Gey의 균형 소금 솔루션 4.5 mg/mL D-포도 당 및 1 x 페니실린-스 (100 IU/mL 각)와 보완으로 구성 된 100 mL를 준비 합니다.
2. 필터-0.22 μ m 필터 장치를 통해 매체를 소독.
   참고: 적어도 한 달에 4 ° C에서 해 부 매체를 저장할 수 있습니다.
3. 60 mm 셀 문화 요리에 차가운 해 부 중간의 5 mL를 추가 합니다. 각 강아지 해 부 수에 대 한 60 m m 세포 문화 접시를 준비 합니다.
4. 사용까지 얼음에 해 부 요리를 유지.

3. 해 부 재료의 준비 (체험 시간 ≈ 15 분)

1. 100% 에탄올과 벤치를 청소.
2. 모든 해 부 도구, 면도날과 조직 헬기의 플라스틱 플랫폼 100% 에탄올으로 소독.
3. 조직 헬기에 면도날과 플라스틱 플랫폼을 해결 하 고 300 µ m 절단 두께 조정.
4. 해 부를 시작 하기 전에 모든 에탄올 증발 했다 다는 것을 확인 하십시오.

4. CerebellumDissection 및 섹션 준비 (체험 시간 ≈ 동물 당 15-20 분)

1. 쌍 안 현미경 얼음 처럼 차가운 해 부 매체를 포함 하는 60 m m 세포 문화 요리 중 하나 고 상단 플레이트를 제거 합니다.
2. (신중 하 게 동물의 눈을 만지고 피) 70% 에탄올과 머리 모피를 면봉 하 고 승인 된 절차에 따라 큰 날카로운가 위를 사용 하 여 동물을 목을 벨.
   참고: 소 뇌 조각 특정 섹스 또는 스트레인 바이어스 없이 P9-P10 쥐에서 생성 됩니다.
3. 작은 위를 사용 하 여 목에서 시작 하 고 마우스 총구에 올라가고 머리의 중간에 따라 피부를 잘라.
4. 하는 머리를 잡고 고 두개골, 머리, 아래 ventrally 피부를 다시 접어 고 하나의 손가락 사이 피부 두 겹을 꼬집어.
5. 부드럽게 구멍 매그넘으로 작은 위를 삽입 하 고 하나는 측면 쪽으로 절 개 옆 머리 두개골 주위 잘라 하 여 두개골을 잘라. 절단, 뇌 조직의 손상을 방지 하면서 최대한가 위의 팁을 병렬과 두개골에 가까운 유지.
6. 벌금-스트레이트 집게를 사용 하 여 두개골의 등 쪽 부분을 검색 합니다. 두개골의 등 쪽 부분을 신중 하 게 해제 하는 동안 접착 meninges (반투명 관개 막 주변 뇌 조직)를 잘라 작은 위 뇌 조직 손상을 방지 하는 데 필요한 경우.
7. 조심 스럽게 소개 괜 찮 아 요-스트레이트 집게 (또는 또는 주걱을 사용 하 여) 복 부 두개골과 두뇌 사이 두뇌 밖으로 뒤집기 부드럽고 시와 삼차 신경 작은 위로 잘라.
8. 바로 접시 위에 거꾸로 머리를 선회 하 여 차가운 해 부 매체를 포함 하는 60 m m 셀 문화 접시에 중력으로 뇌 고 필요 하다 면 작은 위로 마지막 유착을 풀어.
9. 연구원, 직면 등 쪽과 복 부 측 접시의 바닥에 누워 뇌를 찾으시는 미세 집게를 사용 하 여.
10. 손상 받을 수 있는 쌍 안 현미경 하 개 측면에 뇌를 무력화 하 고 hindbrain, 만지지 마십시오 벌금-스트레이트 집게를 사용 합니다. (앞-및 midbrain, 그림 1Aa에 회로도 참조), 뇌의 나머지에서는 hindbrain 분리 벌금-스트레이트 집게를 사용 하 여. hindbrain의 나머지에서 소 뇌를 분리, 미세 집게 잘라 사용 아래 소 뇌 소 뇌 peduncles (회로도 참조 그림 1Aa').
11. 일단 소 뇌 격리, 신중 하 게 찢 어 멀리 meninges 벌금-스트레이트 집게를 사용 하 여 (에 회로도 참조 그림 1Aa').
12. 고급 곡선된 겸 자와 소 뇌를 부드럽게 잡고를 지 면 위로 헬기 면도날을 수직 플라스틱 플랫폼에 ( 그림 1Bb회로도 참조).
13. 어떤 과잉 발음 1 mL에 적응 하는 메 마른 얇은 끝 피 펫 팁을 사용 하 여 소 뇌 주위 절 개 매체의 플라스틱 ( 그림 1Bb회로도 참조).
14. 뻗어, 단면 ( 1Bb 그림에 회로도 참조) 동안 최적의 화살 조각 플랫폼에 한 번 배치는 소 뇌 낳는 평면, 하지만 확인 합니다.
15. 소 뇌의 300 μ m 두께 화살 섹션 조직 다지기와 슬라이스 (회로도 참조 그림 1Bb'). 힘과 칼 날의 속도 사이트에 최적화 될 필요가 있다.
16. 부드럽게 썰어 소 뇌에 해 부 매체의 한 방울을 추가 합니다. 넓은 구멍 피 펫 팁 1 mL 피 펫에 배치를 사용 하 여 천천히 썰어 소 뇌를 발음 하 고 차가운 해 부 매체 포함 된 60 mm 셀 문화 접시에 다시 전송 (에 회로도 참조 그림 1Bb ').
17. 각 소 뇌 슬라이스 사이 100% 에탄올과 조직 헬기의 플라스틱 플랫폼을 청소. 플랫폼에 다음 뇌를 배치 하기 전에 증발 하는 에탄올을 하자.
18. 두 파인 직선 겸 자 (또는 양자 택일로 티타늄 바늘) 개별 분할 영역을 분리 하는 vermis에서 6-8 조각 선택를 사용 하 여 ( 그림 1Cc 에 회로도 참조 하 고 1Cc').
19. 6 잘 플레이트 문화 삽입 하 고 일부 절 개 매체, 1 mL 피 펫에 적응 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 함께 한 문화 삽입에 최대 4 선택 된 분할 영역 전송 (에 회로도 참조 그림 1Cc').
20. 배치 문화 삽입 밀어 하 여 올바른 위치에 그들을 부드럽게 당겨 절 개 매체 또는 집게를 사용 하 여, 그들이 서로 접촉을 피하고 중간 조각 (에 회로도 참조 그림 1Cc').
21. 얇은 끝 피 펫 팁을 사용 하 여 조각 주위 절 개 매체의 어떤 과잉을 제거 합니다. 슬라이스는 멤브레인에 평평 하다 확인 (회로도 참조 그림 1Cc').
22. 멤브레인에 슬라이스를 추가 하는 데 직후 인큐베이터에 6-잘 접시를 놓습니다.

5. 조각 문화와 Demyelination (실습 시간 ≈ 15-20 분)

참고: 흐름 문화 후드 무 균 조건 하에서이 단계를 수행

1. 조각 준비 후 3 일 마다 미리 예 열 하 고 버퍼링 된 신선한 문화 매체의 당 1 mL와 문화 매체를 교체 합니다.
2. Demyelination에 대 한 모든 문화 매체 아래 문화 6 일 체 외 (DIV) 후 삽입을 제거 하 고 0.5 mg/mL LPC를 포함 하는 미리 데워 진된 신선한 문화 매체의 잘 당 1 mL와 함께 그것을 대체 합니다. 15-17 h 37 ° C, 5% CO₂에서 품 어.
3. 부 화, 후 미리 데워 진된 문화 매체의 1 mL를 포함 하는 25 mm 페 트리 접시에 그들을 배치 하 여 삽입을 세척.
   참고: 삽입 매체 접촉 해야 하지만 그것에 의해 커버 되지 않을.
4. 즉시 신선한 미리 데워 진된 문화 매체를 포함 하는 새로운 6 잘 플레이트에 문화 삽입 전송.
5. 조각 고정 될 때까지 2-3 일 마다 미리 데워 진된 신선한 문화 매체의 1 mL와 문화 매체를 교체 합니다.

6. Immunohistochemistry (실습 시간 ≈ 1시 30분-2 h)

참고: 6.1 단계를 실시 합니다. 6.3 to. 연기 후드. 박람회 paraformaldehyde (PFA)을 방지 하 고 적절 한 조작 및 보호를 위한 제품 안전 데이터 시트를 참조.

1. 각 문화 리프트를 사용 하 여 집게 플라스틱 가장자리를 눌러 삽입 하 고 각 우물에서 막 삽입 아래 문화 매체를 제거 합니다.
2. 4%의 2 개 mL를 추가 하 여 30 분 동안 소 뇌 조각 해결 PFA 막 삽입에 PBS pH 7.4 x 1에서.
   참고: 고정 시간 지점의 myelination 공부의 단계에 따라: 4 DIV myelination, 완전히 myelinated 조각에 7 DIV의 발병에 해당. LPC 치료의 경우 9 DIV demyelination, remyelination의 발병에 11 DIV와 완전히 remyelinated 조각에 14 DIV의 절정에 해당합니다.
3. 3 시간 10 분 동안 2 mL 1 x PBS 가진 조각으로 삽입을 세척.
4. 25 x 30 x 확대를 부드럽게 메스 또는 브러시를 사용 하 여 그들을 밀어 하 여 쌍 안 현미경 막 삽입에서 슬라이스를 구분 합니다. 또는, 막에서 그들을 분리 하는 동안 슬라이스를 손상의 위험을 방지 하려면 여전히 연결 된 조각으로 막 잘라 메스를 사용 합니다.
5. 브러시를 사용 하 여 1 x PBS를 포함 하는 4-잘 접시의 우물에 떠 있는 분할 영역을 전송 합니다.
6. 각 우물에서 PBS를 발음 하 고 15 ~ 20 분 동안-20 ° C에 미리 냉각된 100% 에탄올에 슬라이스를 품 어. 이 단계는 myelinated 섬유에 항 체 침투를 촉진 한다.
7. 100% 에탄올을 발음 하 고 한 번 짧게 1 PBS, x 다음 실 온에서 10 분의 1 x PBS에 두 번 세척.
8. PBS를 발음 하 고 PBS, 5 %NGS, 실 온에서 0.3% 비 이온 세제 일반적인 항 체 고정 사이트를 차단 하려면 x 1을 포함 하는 솔루션으로 30 ~ 45 분에 대 한 슬라이스를 품 어.
9. 차단 솔루션 발음 아니 세척이 필요 합니다.
10. 4 ° c.에 솔루션을 차단에 희석 주 항 체와 하룻밤 슬라이스를 품 어 소 뇌 organotypic 조각에 myelin를 시각화 하려면 MBP (닭, 1/150 또는 마우스 IGg2b, Smi99, 1/200) 또는 PLP (쥐, hybridoma, 1/5 ~ 1/10) 항 체.
    참고: 동일한 조각에 둘 이상의 항의 식을 나타내기 위해 더블-또는 트리플 얼룩이 절차 수행 (예를 들어 그림 1 참조). 부 화를 동시에 수행 하기 위해 다른 종에서 생산 되는 주요 항 체 확인 합니다. 그런 다음 다른 fluorophores에 결합 된 그들의 해당 보조 항 체를 사용 하 여 ( 테이블의 자료 를 참조 꾸벅꾸벅 졸 기 및 paranodal 마커¹⁸ 항 체).
11. 두 번째 날, 워시 슬라이스 3 번 10 분의 1 x PBS에.
12. 실 온에서 어둠 속에서 (1/500 희석) 솔루션을 차단에 희석 보조 항 체와 3 h에 품 어.
    참고: 여기 설명 하는 것 보다 다른 항 체를 사용 하는 경우 항 체 희석 및 보육 시간 최적화 필요 수 있습니다.
13. 어둠 속에서 10 분의 1 x PBS에 슬라이스 세 번을 씻어.
14. 쌍 안 현미경, 유리 슬라이드에 분할 영역을 탑재 합니다. 슬라이드에 1 x PBS의 100 µ L를 놓고 슬라이스를 브러시를 사용 하 여 PBS에 전송 합니다. 필요한 경우 슬라이스를 펼쳐 슬라이드에 그들을 평평 하 게. PBS의 어떤 과잉을 제거 합니다. 경우에 immunolabeling 막에 아직도 붙어 조각 하 여 수행 됩니다, 유리 슬라이드에 막 coverslip 직면 조각으로 탑재 합니다.
15. 유리 coverslip에 직접 장착 매체의 한 방울을 배치 하 고 부드럽게 커버 조각. 어둠 속에서 4 ° C에서 몇 달 동안 탑재 된 슬라이드를 저장할 수 있습니다.

결과

Organotypic 소 뇌 조각 PLP GFP 유전자 변형 마우스 (그림 2B), 뿐만 아니라 Purkinje 세포 얼룩 함께 P9-P10 C57black6 야생-타입 (WT) (그림 2A)에서 얻은 대표 myelin immunostainings의 예. 소 뇌 조각 백색 질에서 미는 folia의 주변으로 조각의 영역 트랙과 myelination Purkinje 세포의 주로 6 ~ 7 후 달성 팀 7 DIV에서 전체 demyelination의 유도 LPC 치료 (

토론

여기, 우리는 전을 생성 하는 프로토콜 세부 vivo 모델 마우스 소 뇌 organotypic 슬라이스 문화에 해당 게시 방법^15,,1619 및 후속 myelin 이전에서 적응 이러한 준비의 immunostaining입니다. 이 전략 모두 건강 하 고 병 적인 상태에는 고해상도와 수 초 구성 요소를 시각화 하는 가능성을 제공 합니다.

10 일 된 쥐에서 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BME medium	ThermoFisher Scientific	41010026
Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS)	ThermoFisher Scientific	14180046
GlutaMAX (100x)	ThermoFisher Scientific	35050038
Heat-inactivated Horse Serum	ThermoFisher Scientific	26050088
Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
Gey’s Balanced Salt Solution	Sigma Aldrich	G9779-500ML
D-Glucose Solution (45%)	Sigma Aldrich	G8769-100ML
Lysophosphatidylcholine (LPC)	Sigma Aldrich	L4129-100MG
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15714
Absolute ethanol (100% ethanol)	VWR Chemicals	20821.330	Cooled at -20°C
Triton® X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
10% Normal Goat Serum (NGS)	ThermoFisher Scientific	500622
Phosphate Buffer Solution	EuroMEDEX	ET330-A	pH 7.4
Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)	Merck Millipore	06-896	Dilution 1/300
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)	Merck Millipore	AB9348	Dilution 1/150
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)	Merck Millipore	NE1019	Dilution 1/200
Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)	Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan		Dilution 1/5 to 1/10
Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)	Sigma Aldrich	S8809	Dilution 1/150
Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)	Abcam	ab34151	Dilution 1/500
Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405	ThermoFisher Scientific		Dilution 1/500
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-20
Tissue chopper	McIlwain
Razor blades
Large scissors	F.S.T	14101-14
Small scissors	F.S.T	91500-09
Fine-straight forceps	F.S.T	91150-20
Curved-fine forceps	F.S.T	11297-00
Cell culture dishes (60 mm and 100 mm)	TPP
4-, 6-well culture plates	TPP
Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter)	Merck Millipore	PICM0RG50
Cell culture incubator			37°C, 5% CO2
Fine-end pipette tips	Dutscher	134000CL
Wide-bore pipette tips	ThermoFisher Scientific	2079G
Sterile syringe	Terumo Europe		20 or 50 mL
Sterile syringe filters	Terumo Europe		0.22 µm
Scalpel	Swann-Morton	0510
Brush
Microscope slides	RS France		76 mm x 26 mm x 1.1 mm
Glass coverslips	RS France		22 mm x 22 mm
Kimtech Sciences Tissue Wipers	Kimberly-Clark Professional	5511
Binocular microscope