Preparazione e Immunostaining di su colture organotipiche Myelinating fetta cerebellare

Riepilogo

Qui presentiamo un metodo per preparare organotipiche fetta culture dal cervelletto di topo e guaina mielinica colorazione da immunohistochemistry adatto per studiare i meccanismi della mielinizzazione e remyelination nel sistema nervoso centrale.

Abstract

Nel sistema nervoso, della mielina è una struttura complessa membrana generata da myelinating glial cells, cui assoni di ensheathes e facilita la conduzione elettrica. Alterazione della mielina è stato indicato per accadere in varie malattie neurologiche, dove è associato con i deficit funzionali. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un ex vivo modello composto da fette organotipiche cerebellari del topo, che possono essere mantenute in coltura per diverse settimane e più ulteriormente essere etichettati per visualizzare la mielina.

Introduzione

I neuroni sono cellule altamente polarizzate, che comprendono un vano somato-dendritica che riceve gli input dal suo ambiente e un assone che assicura la generazione e la propagazione di impulsi elettrici ad altre cellule. Propagazione rapida e tempestiva consegna delle informazioni è essenziale per il corretto funzionamento del sistema nervoso. Nei vertebrati, esso è facilitato dalla mielinizzazione, che permette di aumentare la velocità di conduzione assonale¹. Mielina è una struttura specializzata formata da strati compattati della membrana di plasma generato dalla glia myelinating, vale a dire gli oligodendrociti nel sistema nervoso centrale (SNC) e cellule di Schwann nel sistema nervoso periferico (PNS). Sia nel SNC e SNP, interazioni axoglial guidare la formazione di domini axonal specializzati: i nodi di Ranvier e loro circostante di domini, paranodes e juxtaparanodes². I axonal segmenti isolati di mielina o internodi, si alternano con i nodi di Ranvier, che corrispondono a piccoli domini unmyelinated arricchiti in scanalature tensione-gated del sodio (Na_v). L'alta concentrazione e la rapida attivazione di canali_v Na presso i nodi di Ranvier consentono la rigenerazione dei potenziali d'azione e insieme con le proprietà isolanti delle guaine mieliniche, garantire la conduzione efficiente e veloce stile della impulso nervoso lungo l' assone³.

Oltre al suo ruolo nell'accelerare la velocità di conduzione dell'impulso nervoso, glia myelinating fornisce supporto metabolico per l'assone, preservare la sua integrità a lungo termine e che partecipano della sua sopravvivenza^4,5. Inoltre, è diventato chiaro in anni recenti che mielina è modulata in modo dinamico per tutta la vita, quindi presumibilmente partecipano il regolamento e la plasticità delle varie funzioni del sistema nervoso. Rettifiche nette per la distribuzione, numero, lunghezza e spessore delle guaine di mielina lungo gli assoni così potrebbero rappresentare un nuovo modo di regolare vari reti^6,7,8. Pertanto, l'acquisizione evolutiva della mielina è un processo chiave per le funzioni sensoriali, motorie e cognitive e la perturbazione dell'interazione tra assoni e cellule gliali è sempre più considerata come un contributo per l'inerente allo sviluppo o acquisite neurologica malattie⁹.

Composizione della mielina è stata caratterizzata, con la caratteristica peculiare di un'alta percentuale di lipidi (70%) rispetto alle proteine (30%) a differenza di altre membrane cellulari¹⁰. Tuttavia, a differenza dei lipidi della mielina, la maggior parte delle proteine della mielina sono specifica di mielina, tra cui la proteina basica della mielina (MBP), proteolipide (PLP), 2', glicoproteina di 3'-ciclico del nucleotide 3'-fosfodiesterasi (CNP), mielina (MAG), glicoproteina del oligodendrocyte del myelin (MOG), PMP-22 e P0¹⁰. Vari metodi istologici a macchiare la mielina esistano base alla sua composizione lipidica, come Luxol fast blu¹¹, Sudan nero B¹², Baker ematina acida metodo¹³, così come¹⁴di macchiatura d'argento. Tuttavia, questi approcci non sempre consentono un adeguato contrasto e risoluzione per visualizzare le singole fibre. Un approccio alternativo per rilevare la mielina è tramite immunoistochimica diretto contro proteine della mielina. Vari anticorpi antigeni della mielina-specifici di destinazione con un'alta specificità e possono essere utilizzati regolarmente per rilevare strutture myelinated. L'interazione antigene-anticorpo può essere ulteriormente rivelato utilizzando un anticorpo secondario accoppiato ad un fluoroforo diretto contro l'anticorpo primario e visualizzati con microscopia di fluorescenza adeguata. Qui, descriviamo un protocollo immunochimico per macchiare la mielina su ex vivo cerebellare fette, un modello che permette per una buona conservazione dell'architettura del tessuto nervoso. Inoltre, l'organizzazione e la dimensione delle cellule del Purkinje (l'unico neurone myelinated del cervelletto) li rendono un modello classico per gli studi elettrofisiologici e sono allo stesso modo ideale per svolgere gli studi fissi o live-imaging.

Le fette cerebellare sono generate dai topi P9-P10, un tempo corrispondente alla comparsa precoce di mielinizzazione delle cellule di Purkinje, un processo che avviene per lo più di una settimana ex vivo (6-7 giorni in vitro, DIV)¹⁵. Inoltre, questo modello è adattato per indagare demielinizzanti come la sclerosi multipla (SM), come un vasto demyelination può essere indotta a cerebellare fette utilizzando myelinotoxic composto lisofosfatidilcolina (o lisolecitina, LPC), cui è seguita da una spontanea remyelination^16,17. Remyelination endogeno avviene da due giorni dopo la rimozione di LPC dal terreno di coltura ed è quasi completa un post trattamento di settimana.

Il completamento del presente protocollo prende circa 3 settimane, tra cui una mezza giornata per la preparazione di colture cerebellare fetta una settimana per ottenere fette completamente myelinated, seguite da 2 giorni per raggiungere la vetta del demyelination e un'altra settimana per loro pieno remyelination. Inoltre, immunohistochemistry può essere completato in 2 giorni. Il protocollo descritto qui è adattato a una cucciolata standard di 6 topi cuccioli e deve essere adattato per quanto riguarda il numero di animali utilizzati per l'esperimento pianificato.

Protocollo

Tutti i lavori che coinvolgono gli animali è conformato da politiche istituzionali e linee guida stabilite dall'UPMC, INSERM e il francese e la direttiva comunitaria del Consiglio 86/609/CEE.

1. preparazione del terreno di coltura e cultura inserti (hands-on tempo ≈ 10 – 15 min)

Nota: Eseguire questo passaggio in una cappa a flusso cultura in condizioni sterili

1. Preparare 40 mL di terreno di coltura, che è costituito da 50% BME, soluzione salina bilanciata di 25% Hank (1x), 25% inattivati al calore cavallo del siero, completato con derivato di glutamina 2mm, 100 UI/mL penicillina-streptomicina e 4,5 mg/mL D-glucosio. Regolare il pH a 7.4.
2. Filtro-sterilizzare il mezzo attraverso una 0.22 μm filtro adattato su una siringa di plastica da 50 mL.
   Nota: Terreno di coltura può essere memorizzato a 4 ° C per almeno una settimana.
3. Per una cucciolata standard di 6 cuccioli, utilizzare due piastre 6 pozzetti sterili. Per ogni piatto, togliere il coperchio e aggiungere 1 mL di terreno di coltura per pozzetto.
4. Collocare una cultura inserto in tutti i pozzetti singoli tenendo il bordo in plastica con pinze sterili. Riporre il coperchio la piastra.
   Nota: Le fette cerebellare raccolte da un cucciolo (6-8) possono essere spedite su due membrane (3-4 fette cerebellare per inserto di membrana).

2. preparazione del mezzo di dissezione (hands-on tempo ≈ 5 min)

Nota: Eseguire questo passaggio in una cappa a flusso cultura in condizioni sterili

1. Preparare 100 mL di mezzo di dissezione, costituito di soluzione salina bilanciata di Gey completati con 4,5 mg/mL D-glucosio e 1 x penicillina-streptomicina (100 IU/mL ciascuno).
2. Filtro-sterilizzare il mezzo tramite un'unità di filtro 0.22 μm.
   Nota: Il mezzo di dissezione può essere memorizzato a 4 ° C per almeno un mese.
3. Aggiungere 5 mL di terreno freddo dissezione in piastre di coltura cellulare di 60 mm. Preparare una piastra di coltura cellulare 60 mm per ogni cucciolo essere sezionato.
4. Tenere i piatti di dissezione su ghiaccio fino all'utilizzo.

3. preparazione del materiale di dissezione (hands-on tempo ≈ 15 min)

1. Pulire il banco con etanolo al 100%.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione, una lama di rasoio e piattaforma di plastica del chopper tessuto con etanolo al 100%.
3. Fissare la lama di rasoio e la piattaforma di plastica sull'elicottero del tessuto e regolare lo spessore di taglio di 300 µm.
4. Assicurarsi che tutti l'etanolo evaporato prima di iniziare la dissezione.

4. CerebellumDissection e preparazione di sezioni (hands-on tempo ≈ 15 – 20 min per animale)

1. Posizionare uno dei piatti di cultura cellulare 60 mm contenente il mezzo di dissezione ghiacciata sotto il microscopio binoculare e rimuovere la piastra superiore.
2. La pelliccia testa del tampone con etanolo al 70% (con cura evitando di toccare gli occhi dell'animale) e decapitare l'animale utilizzando delle grandi forbici affilate, secondo la procedura approvata.
   Nota: Le fette cerebellare sono generate da P9-P10 topi senza sesso specifico o ceppo bias.
3. Utilizzare piccole forbici per tagliare la pelle lungo la linea mediana della testa a partire dal collo e risalendo verso il vivo di volata del mouse.
4. Per tenere la testa ed esporre il cranio, ripiegare la pelle ventralmente sotto la testa e un pizzico di due pieghe della pelle tra le dita.
5. Inserire delicatamente il piccole forbici il magnum di orifizio e tagliare il cranio facendo uno laterale incisione verso il lato e poi tagliare tutto intorno il testa del cranio. Tenere la punta delle forbici come parallelo, nei pressi del cranio come possibile durante il taglio, per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale.
6. Recuperate la parte dorsale del cranio usando il forcipe ammenda-dritto. Mentre si solleva con attenzione la parte dorsale del cranio, tagliare le meningi aderente (irrigata membrana traslucida che circonda il tessuto cerebrale) se necessario con piccole forbici per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale.
7. Introdurre con cautela belle-dritto forcipe (o in alternativa utilizzare una spatola) tra il ventrale del cranio e il cervello, delicatamente capovolgere il cervello e tagliare l'ottica e nervi di trigeminal con piccole forbici.
8. Aiutare il cervello a cadere per gravità nella piastra di coltura cellulare di 60 mm contenente mezzo ghiacciato dissezione girando la testa sottosopra appena sopra il piatto e rilasciare le aderenze ultima con piccole forbici, se necessario.
9. Utilizzando una pinzetta, orientare il cervello con il lato dorsale rivolto verso il ricercatore e il lato ventrale che si trova sul fondo del piatto.
10. Sotto il microscopio binoculare, è possibile utilizzare il forcipe ammenda-dritto per immobilizzare il cervello sul lato del forebrain ed evitare di toccare il hindbrain, come potrebbe rompersi. Il hindbrain di separato dal resto del cervello (fore - e del midbrain, vedere schema in Figura 1Aa), usando il forcipe ammenda-dritto. Per separare il cervelletto dal resto del hindbrain, utilizzare una pinzetta per tagliare i peduncoli cerebellari sotto il cervelletto (vedere schema su Figura 1Aa').
11. Una volta che il cervelletto è isolato, attentamente strappare via le meningi usando il forcipe ammenda-diritta (vedere schema su Figura 1Aa').
12. Tenere il cervelletto delicatamente con il forcipe curvo fine e inserirlo con il lato dorsale fino sulla piattaforma plastica perpendicolarmente per la lama di rasoio di chopper (Vedi schema in Figura 1Bb).
13. Aspirare l'eventuale eccedenza del mezzo di dissezione intorno il cervelletto utilizzando una punta sottile-fine sterile adattata un 1 ml pipettare (Vedi schema in Figura 1Bb).
14. Assicurarsi che il cervelletto appoggiato in piano, ma non è allungato, una volta posizionati sulla piattaforma per ottenere fette sagittale ottimale durante il taglio (Vedi schematico su Figura 1 BB).
15. Affettate 300 μm di spessore sezioni sagittali del cervelletto con l'elicottero di tessuto (vedere schema su Figura 1Bb'). La forza e la velocità della lama deve essere ottimizzato in loco.
16. Delicatamente e aggiungere una goccia di mezzo di dissezione sul cervelletto affettato. Utilizzando un wide-bore puntale inserito una pipetta da 1 mL, lentamente aspirare il cervelletto affettato e trasferirlo nella piastra di coltura cellulare di 60 mm contenente mezzo ghiacciato dissezione (vedere schema su Figura 1Bb cm).
17. Pulire la piattaforma di plastica del chopper tessuto con etanolo al 100% tra ogni affettare del cervelletto. Evaporare l'etanolo prima di mettere il cervelletto successivo sulla piattaforma.
18. Utilizzare due belle-dritto forcipe (o in alternativa gli aghi di titanio) per separare le singole sezioni e selezionare 6-8 fette da vermis (vedere schema in Figura 1Cc e 1Cc').
19. Prendere una piastra a 6 pozzetti con inserti di cultura e trasferimento fino a 4 sezioni selezionate sul modulo di una cultura insieme a qualche mezzo di dissezione, utilizzando un puntale di wide-bore adattato su una pipetta da 1 mL (vedere schema su Figura 1Cc').
20. Mettete le fette in mezzo l'inserto di cultura usando la dissezione medio o il forcipe per spingere e tirare delicatamente in posizione giusta, evitando loro di essere in contatto tra loro (vedere schema su Figura 1Cc').
21. Rimuovere qualsiasi eccesso di medie di dissezione intorno le fette utilizzando un puntale sottile-fine. Garantire che le fette disteso sulla membrana (vedere schema su Figura 1Cc').
22. Posizionare la piastra 6 pozzetti in incubatrice immediatamente dopo aver aggiunto le fette sulla membrana.

5. cultura e demielinizzazione a fette (hands-on tempo ≈ 15 – 20 min)

Nota: Eseguire questo passaggio in una cappa a flusso cultura in condizioni sterili

1. Sostituire il terreno di coltura con 1 mL per pozzetto di pre-riscaldato e tamponata terreno di coltura fresco ogni 3 giorni dopo la preparazione della fetta.
2. Per il demyelination, rimuovere tutti i mezzo di coltura sotto la cultura inserisce dopo 6 giorni in vitro (DIV) e sostituirlo con 1 mL / pozzetto di terreno di coltura fresco pre-riscaldato contenente 0,5 mg/mL LPC. Incubare per 15-17 h a 37 ° C, 5% CO₂.
3. Dopo l'incubazione, lavare gli inserti ponendoli in una capsula Petri 25 mm contenente 1 mL di terreno di coltura pre-riscaldato.
   Nota: Gli inserti devono essere a contatto con il fluido, ma non essere coperti da esso.
4. Trasferire immediatamente gli inserti di cultura in una nuova piastra 6 pozzetti contenenti terreno di coltura pre-riscaldato di nuovo.
5. Sostituire il terreno di coltura con 1 mL di terreno di coltura fresco pre-riscaldato ogni 2-3 giorni fino alla fissazione di fette.

6. Immunohistochemistry (hands-on tempo ≈ 01:30 – 2 h)

Nota: Eseguire i passi 6.1. a 6.3. sotto cappa aspirante. Evitare esposizione a paraformaldeide (PFA) e consultare la scheda di sicurezza prodotto per manipolazione adeguata e protezione.

1. Utilizzare pinze per sollevare che ogni cultura inserisce tenendo il bordo di plastica e rimuovere il terreno di coltura sotto la membrana inserti da ciascun pozzetto.
2. Difficoltà le fette cerebellare per 30 min con l'aggiunta di 2 mL di 4% PFA in 1X PBS pH 7.4 sugli inserti di membrana.
   Nota: Il punto di tempo di fissazione dipende dalla fase di mielinizzazione studiato: DIV 4 corrisponde alla comparsa di mielinizzazione, 7 DIV a fette completamente myelinated. In caso di trattamento di LPC, DIV 9 corrisponde al picco della demielinizzazione, 11 DIV all'insorgenza di remyelination e 14 DIV a completamente remyelinated fette.
3. Lavare gli inserti con le fette di tre volte con 2 mL di PBS 1X per 10 min.
4. Separare le fette dagli inserti membrana sotto il microscopio binoculare utilizzando un 25x ingrandimento 30x, spingendoli delicatamente con un bisturi o una spazzola. In alternativa, per evitare il rischio di danneggiare le fette mentre staccandole dalla membrana, utilizzare un bisturi per tagliare la membrana con le fette ancora attaccate.
5. Trasferire le fette galleggiante nei pozzetti di una piastra a 4 pozzetti contenenti 1X PBS, utilizzando un pennello.
6. Aspirare il PBS da ogni pozzetto e incubare le fette in etanolo 100% pre-raffreddata a-20 ° C per 15-20 min. Questo passaggio facilita la penetrazione dell'anticorpo in fibre myelinated.
7. Aspirare il 100% di etanolo e lavare una volta brevemente con 1 x PBS, poi due volte in PBS 1X per 10 min a temperatura ambiente.
8. Aspirare il PBS e incubare le fette per 30 a 45 minuti con una soluzione contenente 1X PBS, 5% NGS, 0,3% detergente non ionico a temperatura ambiente per bloccare i siti di anticorpo specifico non fissazione.
9. Aspirare la soluzione di blocco. Nessun lavaggio è necessario.
10. Incubare le fette per una notte con gli anticorpi primari diluiti in blocco soluzione a 4 ° C. Per visualizzare la mielina su fette organotipiche cerebellari, utilizzare MBP (pollo, 1/150 o Mouse IGg2b, Smi99, 1/200) o PLP (ratto, Ibridoma, 1/5 al 1/10) anticorpi.
    Nota: Per rivelare l'espressione dell'antigene più di una nella stessa sezione, eseguire un doppio o triplo procedura di colorazione (vedere la Figura 1 come esempio). Per eseguire l'incubazione contemporaneamente, garantire gli anticorpi primari sono prodotte in diverse specie. Quindi, utilizzare loro corrispondenti anticorpi secondari accoppiati a diversi fluorofori (Vedi Tabella materiali per nodale e paranodali marcatore¹⁸ anticorpi).
11. Il secondo giorno, lavare le fette tre volte in PBS 1X per 10 min.
12. Incubare per 3h con anticorpi secondari diluiti in soluzione (diluizione 1/500) al buio a temperatura ambiente di blocco.
    Nota: Ottimizzazione dei tempi di diluizione e incubazione anticorpo potrebbe essere necessaria quando si utilizzano altri anticorpi quelli descritti qui.
13. Lavare tre volte le fette in 1X PBS per 10 min al buio.
14. Sotto un microscopio binoculare, montare le fette su una lastra di vetro. Mettere 100 µ l di PBS 1X sulla diapositiva e trasferire le fette in PBS con un pennello. Stendere le fette se necessario e appiattirli sulla diapositiva. Rimuovere l'eccesso di PBS. Nel caso in cui il immunolabeling viene eseguita con le fette ancora attaccate alle membrane, montare con le fette di fronte il vetrino coprioggetto, con la membrana sul vetrino.
15. Mettere una goccia di mezzo di montaggio direttamente sul vetrino coprioggetti e coprire delicatamente le fette. Diapositive intelaiate possono essere conservati per diversi mesi a 4 ° C al buio.

Risultati

Esempi di immunostainings rappresentante della mielina in organotipiche cerebellari fette ottenute da P9-P10 C57black6 wild-type (WT) (Figura 2A), così come topi transgenici PLP-GFP (Figura 2B), insieme alle cellule di Purkinje macchiatura. Mielinare da materia bianca cerebellare fette canzoni regione delle fette verso la periferia della folia e mielinizzazione delle cellule del Purkinje è per lo più raggiunto dopo 6 o 7 DIV. ...

Discussione

Qui, abbiamo dettaglio un protocollo per generare un ex vivo modello corrispondente alle culture del mouse organotipiche cerebellari fetta, adattato da precedentemente metodi pubblicati^15,16,19 e la mielina successiva immunostaining di questi preparati. Questa strategia offre la possibilità di visualizzare componenti della mielina con una risoluzione elevata negli stati sani e patologici.

Tratto da 1...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BME medium	ThermoFisher Scientific	41010026
Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS)	ThermoFisher Scientific	14180046
GlutaMAX (100x)	ThermoFisher Scientific	35050038
Heat-inactivated Horse Serum	ThermoFisher Scientific	26050088
Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
Gey’s Balanced Salt Solution	Sigma Aldrich	G9779-500ML
D-Glucose Solution (45%)	Sigma Aldrich	G8769-100ML
Lysophosphatidylcholine (LPC)	Sigma Aldrich	L4129-100MG
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15714
Absolute ethanol (100% ethanol)	VWR Chemicals	20821.330	Cooled at -20°C
Triton® X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
10% Normal Goat Serum (NGS)	ThermoFisher Scientific	500622
Phosphate Buffer Solution	EuroMEDEX	ET330-A	pH 7.4
Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)	Merck Millipore	06-896	Dilution 1/300
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)	Merck Millipore	AB9348	Dilution 1/150
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)	Merck Millipore	NE1019	Dilution 1/200
Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)	Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan		Dilution 1/5 to 1/10
Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)	Sigma Aldrich	S8809	Dilution 1/150
Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)	Abcam	ab34151	Dilution 1/500
Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405	ThermoFisher Scientific		Dilution 1/500
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-20
Tissue chopper	McIlwain
Razor blades
Large scissors	F.S.T	14101-14
Small scissors	F.S.T	91500-09
Fine-straight forceps	F.S.T	91150-20
Curved-fine forceps	F.S.T	11297-00
Cell culture dishes (60 mm and 100 mm)	TPP
4-, 6-well culture plates	TPP
Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter)	Merck Millipore	PICM0RG50
Cell culture incubator			37°C, 5% CO2
Fine-end pipette tips	Dutscher	134000CL
Wide-bore pipette tips	ThermoFisher Scientific	2079G
Sterile syringe	Terumo Europe		20 or 50 mL
Sterile syringe filters	Terumo Europe		0.22 µm
Scalpel	Swann-Morton	0510
Brush
Microscope slides	RS France		76 mm x 26 mm x 1.1 mm
Glass coverslips	RS France		22 mm x 22 mm
Kimtech Sciences Tissue Wipers	Kimberly-Clark Professional	5511
Binocular microscope