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Resumo

A recente epidemia do vírus Zika destaca a importância de estabelecer abordagens genéticas inversas para desenvolver vacinas e/ou estratégias terapêuticas. Aqui, nós descrevemos o protocolo para resgatar um vírus de recombinação contagioso do Zika de um clone full-length do cDNA montado em um cromossoma artificial bacteriano o controle do promotor imediato-adiantado humano do citomegalovírus.

Resumo

A associação da infecção pelo vírus Zika (ZIKV) com complicações neurológicas durante o recente surto mundial e a falta de vacinas aprovadas e/ou antivirais têm ressaltou a necessidade urgente de desenvolver sistemas genéticos reversos de ZIKV para facilitar a estudo da biologia de ZIKV e o desenvolvimento de aproximações terapêuticas e/ou profilácticas. No entanto, como com outros Flavivirus, a geração de clones de cDNA infecciosos de comprimento total ZIKV foi dificultada devido à toxicidade de sequências virais durante sua amplificação em bactérias. Para superar este problema, nós desenvolvemos uma aproximação não tradicional baseada no uso de cromossomas artificiais bacterianos (BACs). Usando essa abordagem, a cópia de cDNA de comprimento total da cepa ZIKV rio grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) é gerada a partir de quatro fragmentos de DNA sintético e montada no plasmídeo pBeloBAC11 de cópia única o controle do citomegalovírus humano (CMV) promotor imediato precoce. O clone montado do cDNA do BAC é estável durante a propagação nas bactérias, e o ZIKV de recombinação contagioso (r) é recuperado em pilhas de vero após o transfection do clone do cDNA do BAC. O protocolo aqui descrito fornece uma técnica poderosa para a geração de clones infecciosos de Flavivirus, incluindo ZIKV, e outros vírus de RNA de vertente positiva, particularmente aqueles com grandes genomas que têm problemas de estabilidade durante a bactéria de propagação.

Introdução

ZIKV é um membro mosquito-carregado do gênero Flavivirus dentro da família Flaviviridae que atualmente constitui uma emergência de saúde pública global1. Como outros Flavivirus, ZIKV é um vírus de RNA envelopado com um icosahedral-como a estrutura que contem um sentido positivo, molécula single-encalhado do RNA de aproximadamente 10,8 KB (Figura 1)2. O genoma viral codifica uma grande poliproteína de aproximadamente 3.423 aminoácidos que é processado por proteases virais e celulares em três proteínas estruturais (capsid [C], pré-membrana/membrana [prM/M] e envelope [E]) que estão envolvidos na formação do partículas virais e sete proteínas não estruturais (NS) (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) que participam da replicação do genoma, do conjunto de vírus e da evasão da resposta imune do hospedeiro (Figura 1)3.

Historicamente, a infecção por zikv tem sido associada a uma doença febril leve4,5. No entanto, a recente pandemia explosiva de infecções por zikv em toda a América do Sul e central, o Pacífico Sul e o Caribe6,7,8, e sua associação com a ocorrência de síndrome de Guillain-Barré e microcefalia9,10,11,12,13, mudaram a percepção histórica e potenciaram a relevância do zikv como um importante patógeno humano. Nesse sentido, o desenvolvimento de ferramentas moleculares, como clones de cDNA infecciosos, facilitará o estudo da patogênese viral e o desenvolvimento de vacinas geneticamente definidas e a identificação de medicamentos antivirais para o tratamento da infecção pelo ZIKV. Como descrito para outros Flavivirus, a geração de clones infecciosos de ZIKV é difícil devido à presença de promotores bacterianos crípticos no genoma viral14 que permitem a expressão gotejante de proteínas virais tóxicas durante a propagação do clones de cDNA em bactérias usando plasmís de alto número de cópia padrão15,16,17. Para superar esse problema de toxicidade, várias abordagens não tradicionais foram implementadas com sucesso nos últimos dois anos18. Estes incluem o uso de plasmíos de baixo número de cópia19,20, a inserção de íntrons para interromper as regiões tóxicas21,22,23, a ligadura in vitro de fragmentos de cDNA 24 de cada , 25, silenciamento mutacional de promotores bacterianos crípticos presentes no genoma viral26,27, amplicões subgenómico infecciosos (ISA)28,29, o método de montagem da Gibson30 , e o uso da reacção de extensão circular do polymerase (CPER)31.

Nisto, nós descrevemos o protocolo detalhado para a engenharia de um clone full-length do cDNA da tensão zikv-RGN13de zikv, usando um bac para superar o problema da toxicidade, e o salvamento do rzikv infeccioso pelo transfection direto do clone do cDNA do Bac em vero células32, uma linha celular aprovada pela administração de alimentos e drogas (FDA) para o desenvolvimento de vacinas humanas33. Neste sistema, a cópia de cDNA de comprimento total do genoma viral é montada no plasmídeo BAC pBeloBAC1134 (Figura 2a), um plasmídeo de baixo número de cópia (uma a duas cópias por célula) derivado do Escherichia coli F-factor35, que minimiza a toxicidade das sequências de Flavivirus durante a sua propagação em bactérias. O cDNA do genoma de ZIKV é montado em pBeloBAC11 o controle do promotor imediato-adiantado CMV humano, para permitir a expressão do RNA viral (v) no núcleo de pilhas transfected pelo RNA polymerase II celular, e flanqueado no 3 '-extremidade pela hepatite Delta Virus (HDV) ribozima (RZ), seguido pelas sequências da terminação de hormônio do crescimento bovino (BGH) e sinais de poliadenilação para produzir RNAs sintéticos que ostentam autênticas 5 '-e 3 '-extremidades do genoma viral, respectivamente (Figura 2b). Este sistema cDNA-lanç conduz à expressão intracelular do RNA viral tampado, permitindo a recuperação de zikv infeccioso sem a necessidade para uma etapa in vitro da transcrição. A abordagem Bac fornece uma poderosa metodologia aplicável à construção de clones de cDNA infecciosos estáveis e totalmente funcionais para outros flavivírus, bem como outros vírus de RNA de cadeia positiva36,37, 38,39,40,41.

Protocolo

1. construção de um clone infeccioso do cDNA de ZIKV em um BAC

Nota: A estratégia para a montagem do ZIKV em BACs é descrita para a cepa RGN13 (número de adesão KU527068) (Figura 2).

  1. Selecione locais de restrição únicos adequadamente espaçados no genoma viral que estão ausentes no plasmídeo pBeloBAC11 (Figura 2a).
    Nota: Para o ZIKV-RGN, foram selecionados os sítios de restrição PML I, AFE I e BstB I (posições genómicas 3.347, 5.969 e 9.127, respectivamente). No caso de nenhum site de restrição adequado estar disponível no genoma viral, gerar novos locais de restrição através da introdução de mutações de nucleotídeo silencioso no genoma viral durante o projeto de fragmento de cDNA.
  2. Gerar por síntese química quatro fragmentos de cDNA abrangendo o genoma de comprimento total (Z1 a Z4), ladeado pelo promotor CMV no 5 '-End e o HDV RZ, a terminação de BGH, e seqüências de poliadenilação no 3 '-End ( Figura 2b). Cada fragmento deve ser ladeado pelos locais de restrição selecionados (etapa 1,1).
    Nota: Fragmento Z1 é usado como uma espinha dorsal para clonar o resto dos fragmentos no pBeloBac11. Para esse fim, deve conter o promotor CMV humano e deve ser ladeado no 5 '-End por ApaL I (para clonar este fragmento em pBeloBAC11) e ASC I (ausente no genoma viral), e no 3 '-End pelos locais de restrição selecionados para a montagem do clone infeccioso (PML I , AFE I e BstB I) seguidos por MLU I (ausente no genoma viral) e BamH I (para clonar este fragmento em pBeloBAC11). O fragmento Z4 deve conter a região genômica do último local de restrição selecionado (BstB I) até o final do genoma viral, seguido do HDV RZ, da terminação de BGH e das sequências de poliadenilação, e do local de restrição MLU I (Figura 2b). Alternativamente, os fragmentos do cDNA (Z1-Z4) podiam ser gerados por uma combinação de reações Chain reversas padrão da polimerase da transcriptase (RT-PCRs) e de PCRs de sobreposição usando oligonucleotides específicos.
  3. Monte o clone infeccioso do cDNA pela clonagem seqüencial dos fragmentos Z1 a Z4 em pBeloBAC11 (Figura 2b).
    1. Digerir o plasmídeo pBeloBAC11 e o fragmento Z1 com ApaL I e BamH I. Para isso, misture 2 μg de plasmídeo pBeloBAC11 ou 1 μg de fragmento Z1 com 10 μL de tampão de reação 10x, 20 unidades de cada enzima e água para atingir um volume final de 100 μL. Incubar a 37 ° c por 2 h.
    2. Dephosphorylate o vetor do BAC usando a fosfatase alcalina do camarão (SAP). Para esse fim, adicionar 2,5 μL (2,5 unidades) de SAP para o BAC digerido e incubar a 37 ° c para 1 h. Aqueça-inative o SAP pela incubação em 75 ° c por 15 minutos.
    3. Purify o vetor do BAC dephosphorylated e fragmento Z1 pela electroforese do gel do agarose usando um jogo comercial do Clean-up do gel aperfeiçoado para a purificação de fragmentos do ADN maiores de 10 KB (veja a tabela dos materiais).
    4. Realize a reação de ligadura para gerar o plasmídeo (p) BAC-Z1. Para esse fim, misture 150 ng de vetor de BAC digerido purificado com a pastilha purificada usando uma relação molar de vector-a-inserir de 1:3, 1,5 μL de tampão de ligase de DNA 10x T4 contendo 10 mM de ATP, uma unidade de ligase de DNA T4 e água para um volume final de 15 μL.
    5. Incubar a mistura de ligadura por 20 h a 16 ° c. Como o controle da reação da ligadura, execute em paralelo uma reação da ligadura sem inserção. Aqueça-inative a ligase pela incubação em 65 ° c por 15 minutos.
      Nota: No caso de DNAs Blunt-ended, incubar a reação da ligadura por 20 h em 14 ° c. Devido ao grande tamanho do vetor BAC (Figura 2a), é essencial o uso de maiores quantidades de vetor e inserção do que as ligações usando plasmídos convencionais, a fim de aumentar a eficiência de ligadura.
    6. Transformar 50 μL de células eletrocompetentes de E. coli DH10B com 2 μL de reação de ligadura (etapa 1.3.5) por eletroporação (capacitância de 25 μf, 2,5 kV e resistência a 100 Ω), utilizando-se as côvetes de eletroporação equipadas com eletrodos espaçados em intervalos de 0,2 cm, seguindo os protocolos padrão.
    7. Transfira as células para um tubo de polipropileno com 1 mL de meio SOC (2% triptona, 0,5% extrato de levedura, 0, 5% NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mm MgSO4, 20 mm glicose [pH 7,0]) e incubar-los a 37 ° c por 1 h com agitação suave (200-250 rpm). Placa das células para as placas de agar Luria (LB) contendo 12,5 μg/mL de cloranfenicol e incubar-los a 37 ° c por 16 h.
    8. Escolha 8 a 12 colônias bacterianas, faça uma réplica em uma placa de agar LB fresca contendo 12,5 μg/mL de cloranfenicol, e teste se eles contêm a pastilha correta por análise direta de PCR usando oligonucleotídeos específicos.
    9. Escolha uma colônia positiva da placa da réplica, cresça-a em 100 mL de LB contendo 12,5 μg/mL de cloranfenicol, e isole o cDNA de BAC pelo método de Lise alcalina usando um kit MIDI comercial de plasmídeo, seguindo a recomendação para a purificação de grandes plasmídos de baixa cópia (ver a tabela de materiais).
      Nota: O cDNA do BAC preparado por este método pode ser contaminado com até 30% do ADN genomic bacteriano, mas é apropriado na qualidade executar a análise de limitação, arranjar em seqüência, e clonagem. Dependendo do tamanho do BAC, podem ser obtidos rendimentos de 4-6 μg do plasmídeo BAC.
    10. Verifique a integridade genética do cDNA clonado pela análise de restrição. Digerir 500 ng do plasmídeo pBAC-Z1 com ASC I e PML I a 37 ° c por 1 h e confirmar a presença do fragmento Z1 por eletroforese em gel. Para confirmar ainda que não foram introduzidas mutações indesejadas, sequenciar a pastilha com oligonucleotídeos específicos.
    11. Partindo do plasmídeo pBAC-Z1 contendo os sítios de restrição selecionados (PML I, AFE I, BstB I e MLU I), clone sequencialmente os fragmentos Z2 a Z4 para gerar o clone de cDNA infeccioso de comprimento total pBAC-ZIKV (Figura 2b), após abordagens como descrito acima para o fragmento Z1 (etapas 1.3.1-1.3.10).

2. preparação de alta pureza pBAC-ZIKV para o resgate de rZIKV infecciosa

Nota: A preparação em grande escala de um clone infeccioso de pbac-zikv ultrapura, apropriado para o transfection e o salvamento de vírus infecciosos, é executada pelo lysis alcalino com um jogo comercial desenvolvido especificamente para a purificação do Bac (veja a tabela de Materiais). O kit deve incluir uma etapa de digestão de de dependente de ATP que remove a contaminação por DNA genômica bacteriana, permitindo o isolamento do cDNA de Bac com um grau de pureza semelhante ao obtido com o método de cloreto de césio.

  1. Cresça uma única colônia de E. coli DH10B que carreg o clone infeccioso de pbac-zikv em 5 ml do meio da libra que contem 12,5 μg/ml do cloranfenicol em 37 ° c por 8 h com agitação delicada (200-250 rpm).
  2. Adicionar 1 mL de cultura bacteriana (passo 2,1) a 500 mL de LB com 12,5 μg/mL de cloranfenicol num balão de 2 L e cultivar as células a 37 ° c por 14-16 h (até um OD600 de 0,6-0,8).
    Nota: Os caldos ricos, tais como o caldo fantástico (TB), podem produzir densidades extremamente elevadas da pilha, tendo por resultado um rendimento mais baixo e menos pureza do cDNA do BAC.
  3. Purify o clone infeccioso do cDNA do BAC pelo lysis alcalino usando um jogo comercial desenvolvido especificamente para a purificação do BAC, seguindo as especificações do fabricante (veja a tabela dos materiais). Mantenha o cDNA de BAC purificado a 4 ° c. Dependendo do tamanho do Bac, os rendimentos de 30 μg do clone do cDNA do Bac do ultrapura podem ser obtidos.
    Nota: Não seque a pelota do ADN por mais de 5 minutos, porque a secagem excessiva tornará difícil dissolver o cDNA do BAC. Devido ao grande tamanho do clone do cDNA do Bac, evite vortexing ou pipetagem para impedir o Shearing do plasmídeo.

3. salvamento de rZIKV infeccioso do clone do cDNA do BAC pelo transfection de pilhas de vero

Nota: O rZIKV infeccioso é recuperado pelo transfection de pilhas de vero com o clone do cDNA de pBAC-ZIKV, usando um reagente catiônico comercial do transfection do lipido (veja a tabela dos materiais; Figura 3).

  1. Um dia antes da transfecção, placa em 6 poços placas 5 x 105 células Vero/bem em meio de crescimento (Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio [DMEM] suplementado com 5% soro fetal bovino [FBS], 2 mm L-glutamina, e 1% não essenciais aminoácidos) sem antibióticos para levantar 90% monocamadas de pilha confluente pelo tempo do transfection.
    Nota: Recomendamos a realização do resgate de vírus em triplicates.
  2. Equilibrar o meio sérico reduzido (ver a tabela de materiais) à temperatura ambiente e preparar misturas de transfecção em tubos de microcentrífuga estéreis para cada amostra de transfecção da seguinte forma.
    1. Adicione 4 μg do clone do cDNA do BAC em 250 μL do meio soro-reduzido e misture-o com cuidado, evitando o vortexing para impedir o corte do plasmídeo.
    2. Em um tubo separado, diluir 12 μL de reagente de transfecção (1 mg/mL) (ver a tabela de materiais) em 250 μL de meio soro-reduzido, misturar por vortexing, e incubar à temperatura ambiente por 5 min.
    3. Combine o cDNA BAC diluído e o reagente do transfection (com uma relação 1:3 do ADN: reagente do transfection), misture-o com cuidado ao evitar vortexing, e incubar na temperatura ambiente por 20-30 minutos.
  3. Durante o período de incubação do BAC cDNA/transfection reagentmistura, lave as células Vero com meio de crescimento sem antibióticos e deixe as células em 1 mL de meio fresco sem antibióticos.
    Nota: A adição de antibióticos durante o processo de transfecção pode diminuir a eficiência da transfecção.
  4. Distribua gota gota o 500 μl da mistura do reagente do cDNA/transfection do Bac (da etapa 3.2.3) nas pilhas de vero, misture-as balanç a placa para a frente e para trás, e incubar as pilhas em uma incubadora humidificada de 5% co2 em 37 ° c por 6 h.
  5. Retire o meio de transfecção, adicione 2 mL de meio de crescimento fresco com antibióticos (100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina), incubar as células em uma incubadora de 5% CO2 humidificada a 37 ° c, e verificar todos os dias para a indução de efeito CITOPÁTICO (CPE ).
    Nota: O CPE de ZIKV é pronunciado completamente em pilhas de vero e caracteriza-se pela presença de pilhas arredondadas e birrefringentes que desprendem e flutuam no sobrenadante da cultura do tecido.
  6. Colete alíquotas (100 μL) dos sobrenadantes da cultura da célula vero (passo 3,5) a cada 24 h para determinar a eficiência da recuperação de vírus avaliando a presença de ZIKV usando um ensaio de placa padrão em células Vero frescas (figura 4a).
  7. Após quatro a seis dias de transfecção, quando o CPE é de cerca de 50%-75% (Figura 4B), recolher os sobrenadantes de cultura de tecido em tubos cônicos de 15 ml e centrifugar a 2.000 x g por 10 min a 4 ° c para remover detritos celulares.
  8. Colha os sobrenadantes contendo rZIKV e descarte as pastilhas celulares. Aliquot o sobrenadante nos criotubos e armazene-os em-80 ° c para confirmar mais a presença de rzikv resgatado.

4. titulação de rZIKV recuperado

  1. Um dia antes da titulação, semente em placas de 12 poços 2,5 x 105 células Vero/poço em meio de crescimento para elevar 90% monocamadas de células confluentes no momento da titulação.
    Nota: Recomendamos a realização da titulação do rZIKV recuperado em triplicados.
  2. Retire uma alíquota do sobrenadante do congelador (passo 3,8) e faça diluições seriadas de 10 vezes em meio de crescimento sem FBS.
  3. Lave as células Vero 2x com solução salina tampão fosfato (PBS) e adicione 200 μL/poço de cada diluição de vírus em triplicado. Coloc placas em uma incubadora humidificada de 5% CO2 em 37 ° c e balanç cada 15 minutos por um período de adsorção do minuto 90.
  4. Remover o inábulo viral, sobrepor as células com 2 mL de meio de crescimento contendo 2% FBS, 1% DEAE-Dextran, e 0,6% Agar Noble, e incubar a 37 ° c 5% co2 para 3-4 dias.
    Nota: É possível usar agarose, metilcelulose ou outros suportes de sobreposição. O tempo para a formação apropriada da chapa variará dependendo da sobreposição usada e da tensão de ZIKV.
  5. Correção de células infectadas pelo ZIKV com 1 mL/poço de formaldeído a 4% diluído em PBS à temperatura ambiente por 1 h, remover a sobreposição e visualizar as placas virais, manchando-as com 0,1% de violeta de cristal em 20% de metanol à temperatura ambiente por 15 min.
    1. Descarte a violeta cristalina, lave 3x com água, deixe secar as chapas e conte manualmente as placas (Figura 4C, painel esquerdo). O Titer viral é calculado como unidades formadoras de placas por mililitro (PFU/ml).
  6. Alternativamente, as placas virais podem ser visualizadas pela imunocoloração com o anticorpo monoclonal do rato da proteína do Pan-Flavivirus E (mAb) 4G2 (Figura 4C, painel direito).
    1. Para avaliar as placas de ZIKV por imunocoloração, após a fixação e remoção do agar de sobreposição como descrito acima (na etapa 4,5), lave as células 2x com PBS e permeabilize-os por incubação com 200 μL/poço de 0,5% Triton-X100 em PBS por 15 min à temperatura ambiente.
    2. Retire a solução de permeabilização, lave as células 3x com PBS e bloqueie-as com 200 μL/poço de solução de bloqueio (10% FBS em PBS) durante 1 h à temperatura ambiente.
      Nota: Outras soluções de bloqueio padrão (por exemplo, 2,5% BSA em PBS) podem ser usadas nesta etapa.
    3. Retire a solução de bloqueio e incubar as células com 200 μL/poço da proteína de Pan-Flavivirus E mAb 4G2 diluída na solução de bloqueio (1 μg/mL) durante 1 h a 37 ° c.
      Nota: Outros anticorpos mAb ou policlonais (pAb) podem ser usados em vez de 4G2 para a imunocoloração e detecção de placas virais.
    4. Lave as células 3x com PBS e incubar-as com 200 μL de anticorpo secundário de rato biotinilado diluído (seguindo a recomendação do fabricante) na solução de bloqueio durante 1 h a 37 ° c.
    5. Retire o anticorpo secundário, lave as células 4x com PBS e visualize as placas virais usando um kit de peroxidase baseado em avidina/biotina seguindo as especificações do fabricante (veja a tabela de materiais).

5. confirmação de sucesso rZIKV resgate

Nota: Para confirmar ainda mais a identidade do vírus resgatado, a expressão da proteína ZIKV E é analisada por imunofluorescência utilizando o rato mAb 1176-56 específico para a proteína ZIKV E (Figura 4D). Este mAb é específico para a proteína de ZIKV E, contrariamente à situação da proteína mAb 4G2 do Pan-Flavivirus E (etapa 4.6.3). Alternativamente, a identidade do vírus pode ser confirmada por sequenciamento.

  1. Um dia antes da análise da imunofluorescência, as coberturas de semente em 24 placas do poço que contêm 1 x 105 células Vero/poço no meio do crescimento para levantar 90% monocamadas confluentes da pilha pelo tempo da infecção.
  2. Lave as células 2x com PBS e infecte-as com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,5 PFU/célula do vírus resgatado em meio de crescimento sem FBS (100 μL/poço) em Triplicate. Incubar as placas a 37 ° c por 90 min.
  3. Após a adsorção viral, retire o inábulo viral, adicione 0,5 mL de meio de crescimento fresco com 2% FBS, e incubar as células em uma incubadora de 5% CO2 humidificada a 37 ° c para 48 h.
  4. Remova o sobrenadante da cultura do tecido, fixe as pilhas com 150 μl/poço do paraformaldeído de 4% em PBS por 20 minutos na temperatura ambiente, e permeabilize as pilhas com 150 μl/poço de 0,5% Triton-X100 em PBS por 15 minutos na temperatura ambiente.
  5. Depois de remover a solução de permeabilização e lavar as células 3x com PBS, bloqueie as células com 150 μL/poço de solução de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente.
    Nota: A varredura da pilha seja obstruída com soluções de obstrução alternativas (por exemplo, 2,5% BSA em PBS).
  6. Retire a solução de bloqueio e incubar as células com 100 μL/poço de mAb 1176-56, específico para a proteína ZIKV E, diluído em solução de bloqueio (1 μg/mL) por 1 h a 37 ° c.
  7. Lave as células 3x com PBS, incubar-os à temperatura ambiente por 1 h com 100 μL/poço de Alexa fluor 488-anticorpo secundário conjugado anti-rato diluído (seguindo a recomendação do fabricante) na solução de bloqueio, lave as células extensivamente com PBS, e Incubar-os com 150 μL/poço de 4 ',6 '-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 mg/mL) diluído 1:200 em PBS à temperatura ambiente por 10 min.
  8. Lave as células 3x com PBS, montar as lamelas em um meio de montagem Antifade (ver a tabela de materiais), e analisar as amostras um microscópio de fluorescência.
    Nota: Para o armazenamento a longo prazo, armazene amostras em 4 ° c, protegidas da luz.

6. amplificação e geração de ações virais

Nota: Uma vez confirmada a identidade do vírus resgatado (seção 5), amplificar o vírus nas células Vero e gerar estoques virais para estudos adicionais.

  1. Cresça células Vero em 100 mm x 21 mm placas em 90% confluência e infectá-los com um MOI de 0,1 PFU/Cell como descrito anteriormente.
  2. Quando o CPE está em torno de 75% (aproximadamente 48-72 h pós-infecção), colete o sobrenadante de cultura de tecido em um tubo cônico de 50 mL e centrifugue a 2.000 x g por 10 min a 4 ° c para remover os detritos celulares.
  3. Colher o sobrenadante contendo rZIKV e descartar o pellet celular. Aliquot o sobrenadante em criotubos e armazene-os em-80 ° c.
  4. Retire uma alíquota de vírus do congelador e determine o título viral por ensaio de placa como descrito anteriormente (secção 4).

Resultados

O protocolo descrito aqui permite a geração de clones infecciosos de cDNA de comprimento total estáveis de ZIKV usando um BAC para minimizar os problemas de toxicidade associados a várias sequências flavivirais. A recuperação eficiente do rZIKV infeccioso do clone do cDNA do BAC pode facilmente ser conseguida após o transfection de pilhas suscetíveis de vero (Figura 2). Usando este protocolo, nós geramos um clone estável do cDNA do comprimento completo da tensão RGN32 de zikv sequencialmente clonando quatro fragmentos de sobreposição do cDNA no PLASMÍDEO do BAC pBeloBAC1134 usando métodos convencionais da clonagem e original locais de restrição presentes no genoma viral (Figura 2). O clone full-length do cDNA foi flanqueado no 5 '-end pelo promotor CMV humano para permitir a expressão de Vrna no núcleo de pilhas transfected, e no 3 '-end pelo RZ de HDV seguido pelas seqüências do poliadenilação e da terminação de BGH, para produzir RNAs que contêm o exato 3 '-fim do genoma viral (Figura 2). A estabilidade nas bactérias do clone gerado do cDNA do BAC, junto com sua manipulação fácil usando tecnologias de recombinação padrão do ADN, destaca o potencial da aproximação do cDNA do BAC para a geração rápida e segura de clones completos estáveis do cDNA de ZIKV e outros Flavivirus ou vírus de RNA positivo-encalhado com genomas virais instáveis.

Uma vez montado o clone do cDNA Bac (Figura 2), o vírus infeccioso poderia ser facilmente recuperado após a transfecção direta de células Vero sensíveis com o clone do cDNA Bac utilizando lipossomas catiônicos(Figura 3). Este sistema cDNA-lanç permitiu a expressão intracelular do Vrnatampado, permitindo a recuperação de vírus infecciosos sem a necessidade para uma etapa in vitro da transcrição. Usando esta aproximação, nós pudemos resgatar rzikv-RGN com os títulos mais altamente de 106 pfu/ml em 5 dias posttransfection (figura 4a). Além disso, o vírus resgatado induziu um CPE claro (Figura 4B), gerou placas homogêneas de aproximadamente 2 mm de tamanho (Figura 4C), e sua identidade foi confirmada por sequenciamento (dados não mostrados) e análise de imunofluorescência utilizando o MAB específico para a proteína ZIKV E, 1176-56 (Figura 4D). In vitro os dados indicam que o rZIKV-RGN recuperado replicado eficientemente em pilhas de vero e aos níveis comparados a um isolado natural de ZIKV32 (dados não mostrados). Globalmente, estes resultados demonstram que o rZIKV infeccioso pode ser resgatado de clones de cDNA de comprimento total montados em um BAC.

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Figura 1 : Organização do genoma de Zikv e estrutura do virion. (A) organização do GENOMA: zikv contém um RNA único-encalhado positivo que seja traduzido como uma única poliproteína. A poliproteína traduzida foi clivada por proteases virais (flechas) e hospedeiras (diamantes) para produzir as proteínas estruturais capsídeo (C, azul), matriz (M, marrom) e envelope (e, verde) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). As regiões 5 ' e 3 ' não traduzidas (UTRs) no final do genoma viral são indicadas com linhas pretas. (B) estrutura do virion: os virions de zikv foram decorados com as proteínas de e e de M, ancoradas em um BICAMADA do lipido com um icosahedral-como a estrutura. o envelope viral estava o nucleocapsídeo viral compor da proteína de C associada com o RNA genomic viral. Este número foi adaptado de Ávila-Pérez et al.18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2 : Montagem do clone infeccioso de cDNA de comprimento total de ZIKV em um Bac. (A) representação esquemática do pBeloBAC11 Bac: os genes reguladores ParA, parb, parCe repe,a origem da replicação do fator F (OriS), o gene resistente ao cloranfenicol (cmr) e o Lac O gene Z é indicado. Os sítios de restrição relevantes utilizados para montar o clone infeccioso do cDNA ZIKV são sublinhados. (B) montagem do clone de cDNA infecciosa de comprimento total do Zikv no pBeloBAC11 Bac: quatro fragmentos de DNA sobrepostos (Z1-Z4), cobrindo todo o GENOMA do Zikv (Figura 1) e ladeado pelos locais de restrição indicados, foram gerados por substâncias químicas síntese e clonado sequencialmente em pBeloBAC11 para gerar o clone infeccioso de ZIKV cDNA pBAC-ZIKV. O cDNA infeccioso full-length do zikv foi montado o controle do promotor imediato-adiantado do citomegalovírus humano (CMV) e flanqueado no 3 '-termine pelo ribozima de HDV (RZ) e pela terminação da hormona de crescimento bovina (BGH) e pelas seqüências do poliadenilação. As siglas para os genes virais e os elementos regulatórios são descritas na Figura 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3 : Workflow para gerar rZIKV a partir do clone do cDNA Bac. As células Vero em 90% da confluência foram transfectadas em monocamada com o clone de cDNA infeccioso de comprimento total ZIKV pBAC-ZIKV (Figura 2) usando lipossomas catiônicos. No pós-transfection de 4-6 dias, quando o CPE era evidente, os sobrenadantes da cultura do tecido que contêm rZIKV foram coletados e avaliados para a presença de vírus (Figura 4) e usado para a amplificação viral em pilhas de vero. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4 : Recuperação e caracterização in vitro de rZIKV. (A) resgate de rzikv infeccioso do clone do cDNA do Bac: as células Vero em 90% da confluência (formato de placa de 6 poços, triplicados) foram simuladas transfectadas ou transfectadas com 4 μg/poço de PBAC-Zikv (Figura 3), e nos dias indicados pós-transfecção, os títulos do vírus em sobrenadantes da cultura do tecido foram determinados pelo ensaio da chapa (pfu/ml). As barras de erro indicam desvios padrão de três experimentos de transfecção diferentes. A linha preta pontilhada indica o limite de detecção (50 PFU/mL). (B) CPE viral: células Vero em 90% confluência (6-bem formato da placa, triplicates) foram mock-infectados (Top) ou infectados (MOI de 0,5 Pfu/Cell) com rZIKV, e em 48 h pós-infecção, a presença de CPE foi avaliada por microscopia de luz. Barras de escala = 100 μm. (C) placa viral ensaio e imunocoloração: as células Vero em 90% confluência (formato de placa de 12 poços) foram infectadas com rZIKV, e em 72 h pós-infecção, placas virais foram visualizadas por coloração violeta cristalina (esquerda) ou por imunocoloração ( direita) utilizando a proteína de Pan-Flavivirus E mAb 4G2. Barras de escala = 5 mm. (D) imunofluorescência: as células Vero na confluência de 90% (formato de placa de 24 poços, triplicates) foram infectadas (MOI de 0,5 Pfu/Cell) com rZIKV e, em 48 h pós-infecção, analisadas por imunofluorescência utilizando o MAB 1176-56, específico para zikv Proteína E. Os núcleos da pilha foram manchados com DAPI. Uma imagem incorporada representativa de pilhas de vero ZIKV-Infected é mostrada. O quadrado branco no canto superior direito representa uma imagem ampliada de células Vero ZIKV infectadas. Barras de escala = 100 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os clones de cDNA infecciosos constituem ferramentas moleculares essenciais para a pesquisa básica de vírus RNA e o desenvolvimento de vacinas e/ou a identificação de estratégias antivirais. Entretanto, para muitos vírus de RNA positivo-encalhado, incluindo Flavivirus, a geração de clones infecciosos do cDNA é difícil devido à instabilidade dos cDNAs clonados quando propagado nas bactérias usando Plasmids padrão do elevado-cópia-número. No caso do zikv e de outros Flavivirus, essa instabilidade se deve principalmente à expressão gotejante de proteínas virais tóxicas de promotores bacterianos crípticos presentes no genoma viral14,15,16,17 . Aqui, nós descrevemos um protocolo alternativo e poderoso para gerar um clone infeccioso do cDNA de comprimento total estável de ZIKV como um único plasmídeo, baseado no uso do plasmídeo do BAC pBeloBAC1134 (Figura 2a) para superar o problema da toxicidade, o uso do Promotor de CMV para permitir a expressão do vRNA no núcleo de pilhas transfected, e o HDV RZ para gerar vRNAs com 3 '-extremidades exatos (Figura 2b). Usando este método, nós temos gerado com sucesso um clone infeccioso inteiramente estável da tensão RGN de ZIKV que permite a recuperação eficiente e de confiança do rZIKV infeccioso após o transfection direto de pilhas suscetíveis de vero (Figura 3 e Figura 4).

Nos últimos anos, foi feito um enorme esforço para superar os problemas de instabilidade associados aos clones de cDNA infecciosos do ZIKV, e várias abordagens foram implementadas com sucesso18, incluindo a ligadura in vitro de fragmentos de cDNA24 ,25, plasmíos de baixa cópia19,20, a inativação de promotores bacterianos crípticos pela introdução de mutações silenciosas26,27, inserção intron21, 22 anos de , 23, o método de montagemGibson 30, o métodoISA 28,29, e o uso de CPER31. Embora essas abordagens superem o problema da toxicidade e sejam úteis para gerar clones de cDNA infecciosos de ZIKV, alguns deles são trabalhosos e apresentam várias desvantagens, incluindo a necessidade de medidas in vitro de ligadura e transcrição que reduzem o vírus eficiência da recuperação ou a introdução de um número elevado de mutações silenciosas para inativar o promotor bacteriano críptico que poderia afetar a aptidão viral, entre outro. A abordagem descrita neste protocolo apresenta as seguintes vantagens. i) o PLASMÍDEO BAC pBeloBAC1134 tem uma replicação estritamente controlada, mantendo uma ou duas cópias de plasmídeo por célula, o que minimiza a toxicidade e permite a manutenção estável em bactérias de cDNAs instáveis. II) a propagação e modificação de plasmíos de BAC são quase semelhantes às dos plasmídos convencionais, considerando as ligeiras modificações descritas neste protocolo para manipular fragmentos de BAC-DNA de grande porte e plasmíos de baixa cópia. Notavelmente, o clone do cDNA do Bac pode igualmente ser modificado em E. coli pela recombinação homous usando o sistema vermelho do recombinação42,43,44. III) o uso do promotor CMV permite que o expressão intracelular de ZIKV vRNA tampado e a recuperação de vírus infecciosos sem a necessidade de uma etapa de transcrição in vitro. IV) o rZIKV infeccioso é gerado após o transfection direto de pilhas suscetíveis (por exemplo, vero) com o clone do cDNA do BAC. Desde que o transfection do ADN em pilhas de mamíferos é mais eficiente do que o transfection do RNA, a eficiência da recuperação do vírus com a aproximação do BAC é mais elevada do que aquela observada usando transcritos do RNA, reduzindo o número de passagens em pilhas da cultura para gerar um estoque viral e, Conseqüentemente, limitando a introdução de mutações indesejadas pela adaptação da cultura de pilha.

Finalmente, o potencial da abordagem da BAC é apoiado pelo sucesso do uso deste método (com ligeiras modificações) para o engenheiro de clones de cDNA infecciosos de outros flavivírus, incluindo o vírus da dengue36, e vários coronavírus de alto impacto em saúde humana e animal, como a gastroenterite transmissível coronavirus37 (tgev), vírus da peritonite infecciosa felina38 (FIPV), CORONAVIRUS humano OC4339 (hcov-OC43), síndrome respiratória aguda grave coronavirus40 (SARS-COV), e síndrome respiratória do Oriente Médio coronavirus41 (Mers-COV), entre outros.

No protocolo descrito aqui, há duas etapas críticas que devem ser consideradas. Uma consideração importante é identificar locais de restrição únicos apropriados no genoma viral que estão ausentes no plasmídeo BAC. Se nenhum site de restrição adequado estiver disponível, novos locais de restrição podem ser gerados durante o projeto de clonagem pela introdução de mutações de nucleotídeo silencioso. Outra questão importante é que os plasmílicos de BAC estão presentes em apenas uma ou duas cópias por célula e, portanto, baixos rendimentos de plasmídio de BAC com uma alta contaminação do DNA genómico bacteriano são obtidos usando protocolos padrão projetados para alta e plasmímids de número médio de cópias. Este problema potencial é facilmente superado usando grandes volumes da cultura e purificante o plasmídeo do Bac com um jogo comercial desenvolvido especificamente para a purificação do Bac.

Em resumo, nós desenvolvemos uma aproximação genética reversa poderosa de ZIKV baseada no uso de um BAC que poderia ser adaptado para gerar clones infecciosos estáveis e inteiramente funcionais do cDNA de outros vírus positivo-encalhado do RNA para facilitar o estudo da biologia destes vírus e o desenvolvimento de vacinas e/ou para facilitar a identificação de medicamentos antivirais.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Carla Gómez por sua assistência técnica na geração de clones de cDNA BAC e Snezhana Dimitrova para ajudar na preparação do vídeo. Este trabalho foi apoiado em parte por subvenções do Ministério da economia e da competitividade espanhola (MINECO, Grant Number BFU2016-79127-R) para F.A.T. e os institutos nacionais de saúde (NIH, número de subvenção 1R21AI120500) para L.M.S. e F.A.T.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Molecular Biology Reagents
Afe INew England BioLabsR0652S10,000 units/mL
AmpliTaq DNA PolymeraseThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)N80801615,000 Units/mL
ApaL INew England BioLabsR0507S10,000 units/mL
Asc INew England BioLabsR0558S10,000 units/mL
BamH INew England BioLabsR0136S10,000 units/mL
BstB INew England BioLabsR0519S20,000 units/mL
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
ElectroMAX DH10B Cells ThermoFisher Scientific (Invitrogen)18290015Electocompetent DH10B cells
Electroporation Cuvettes, 0.2 cmBio-Rad165-2086
EthanolMerck100983Flamable
IsopropanolMerck109634Flamable
Large-Construct Kit (10)QIAGEN12462For high-purity BAC preparation
LB BrothThermoFisher Scientific (Invitrogen)12780029Can be homemade as well
LB with AgarThermoFisher Scientific (Invitrogen)22700041Can be homemade as well
MethanolMerck106009Flamable
Mlu INew England BioLabsR0198S10,000 units/mL
OligonucleotidesIDTN/A
Plasmid pBeloBAC11New England BioLabsER2420S (E4154S)
Plasmid Midi Kit (25)QIAGEN12143For midle-scale preparation of BAC plasmids
Pml INew England BioLabsR0532S20,000 units/mL
Polypropylene tubes (10 mL)DeltaLab175724Other commercial sources are acceptable
QIAEX II Gel Extraction Kit (150)QIAGEN20021Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb
Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP)New England BioLabsM0371S1,000 units/mL
SOC MediumThermoFisher Scientific (Invitrogen)15544034Can be homemade as well
Synthesis of cDNA fragmentsBio BasicN/A
T4 DNA LigaseSigma-Aldrich (Roche)104812200011,000 units/mL
2. Cell Culture Reagents
6-Well PlatesThermoFisher Scientific (Nunc)140675
12-Well PlatesThermoFisher Scientific (Nunc)150628
24-Well PlatesThermoFisher Scientific (Nunc)142485
Agar NobleVWR214230
Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibodyVariesN/A
Biotinylated Anti-Mouse Secondary AntibodyVariesN/A
Cell Culture Dishes (100x21 mm)ThermoFisher Scientific (Nunc)172931
Conical Tubes (15 mL)VWR525-0150
Conical Tubes (50 mL)VWR525-0155
Crystal VioletSigma-AldrichC6158
DAPISigma-AldrichD9542Toxic and carcinogenic
DEAE-DextranSigma-AldrichD9885
DMEMThermoFisher Scientific (Gibco)11995065
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher Scientific (HyClone))SV30160.03
FormaldehydeSigma-AldrichF8775Toxic and carcinogenic
L-GlutamineThermoFisher Scientific (Gibco)25030081
Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientific (Invitrogen)11668019Transfection reagent
Nonessential amino acidsThermoFisher Scientific (Gibco)11140035
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermoFisher Scientific (Gibco)31985070Transfection medium
Pan-flavivirus E protein mAb 4G2BEI ResourcesNR-50327
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710-SToxic and carcinogenic
PBSThermoFisher Scientific (Gibco)14190144
Penicillin/StreptomycinThermoFisher Scientific (Gibco)15140122
ProLong Gold Antifade ReagentThermoFisher Scientific (Invitrogen)P10144
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787
Vectastain ABC KitVector Laboratories IncPK-4010Avidin/biotin-based peroxidase kit
Vero CellsATCCCCL-81
ZIKV E Protein mAb 1176-56BioFront TechnologiesBF-1176-56
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis SystemBio-Rad1704468Other commercial sources are acceptable
Class II Biosafety CO2 CabinetVariesN/AOther commercial sources are acceptable
Desktop Refrigrated CentrifugeVariesN/A
Fluorescence MicroscopeVariesN/A
High-Speed Refrigrated CentrifugeVariesN/A
MicroPulser ElectroporatorBio-Rad1652100Other machines are acceptable
SimpliAmp Thermal CyclerThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)A24811Other machines are acceptable
VortexerVariesN/A

Referências

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