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Riepilogo

La recente epidemia del virus zika sottolinea l'importanza di stabilire approcci genetici inversi per sviluppare vaccini e/o strategie terapeutiche. Qui, descriviamo il protocollo per salvare un virus infettivo ricombinante zika da un clone cDNA a lunghezza intera assemblato in un cromosoma artificiale batterico sotto il controllo del promotore riciclo-precoce umano.

Abstract

Durante la recente epidemia in tutto il mondo, l'associazione con complicanze neurologiche e la mancanza di vaccini e/o antivirali approvati hanno sottolineato l'urgente necessità di sviluppare sistemi genetici inversi studio della biologia e dello sviluppo di approcci terapeutici e/o profilattici. Tuttavia, come con altri flavivirus, la generazione di cloni di cDNA infettivi di iKV è stata ostacolata a causa della tossicità delle sequenze virali durante la sua amplificazione nei batteri. Per superare questo problema, abbiamo sviluppato un approccio non tradizionale basato sull'uso di cromosomi artificiali batterici (BAC). Utilizzando questo approccio, la copia cDNA completa del ceppo Rio Grande do Norte Natal viene generata da quattro frammenti di DNA sintetico e assemblata nel plasmide a copia singola sotto il controllo del citomegalovirus umano (CMV) promotore immediato-rapido. Il clone BAC cDNA assemblato è stabile durante la propagazione nei batteri, e il ricombinante infettivo (r)-IKV viene recuperato nelle cellule Vero dopo la trasfezione del clone BAC cDNA. Il protocollo qui descritto fornisce una potente tecnica per la generazione di cloni infettivi di flavivirus, tra cui la IKV, e altri virus dell'RNA a filamento positivo, in particolare quelli con grandi genomi che hanno problemi di stabilità durante i batteri propagazione.

Introduzione

Il gene è un membro del genere Flavivirus all'interno della famiglia Flaviviridae che attualmente costituisce un'emergenza sanitaria pubblica globale1. Come altri flavivirus, il virus dell'RNA è avvolto con una struttura icosaedro che contiene un senso positivo, molecola di RNA a filamento singolo di circa 10,8 kb (Figura 1)2. Il genoma virale codifica una grande poliproteina di circa 3.423 aminoacidi trasformati da proteasi virali e cellulari in tre proteine strutturali (capside [C], premembrane/membrana [prM/M]e busta [E]) che sono coinvolte nella formazione del particelle virali e sette proteine non strutturali (NS) (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) che partecipano alla replicazione del genoma, all'assemblaggio dei virus e all'evasione della risposta immunitaria dell'ospite (Figura 1)3.

Storicamente, l'infezione da IKV è stata associata a una lieve malattia febbrile4,5. Tuttavia, l'esplosiva recente pandemia di infezioni da IKV insud e Centro America, nel Pacifico meridionale e nei Caraibi 6,7,8e la sua associazione con il verificarsi della sindrome di Guillain-Barré e la microcefalia9,10,11,12,13, hanno cambiato la percezione storica e potenziato la rilevanza di IKV come un importante agente patogeno umano. In questo senso, lo sviluppo di strumenti molecolari, come i cloni infettivi di cDNA, faciliterà lo studio della patogenesi virale e lo sviluppo di vaccini geneticamente definiti e l'identificazione di farmaci antivirali per il trattamento dell'infezione da .IKV. Come descritto per altri flavivirus, la generazione di cloni infettivi di cloni cDNA nei batteri che utilizzano plasmidi standard ad alto numero di copia15,16,17. Per superare questo problema di tossicità, negli ultimi due anni sono stati attuati con successo diversi approcci non tradizionali18. Questi includono l'uso di plasmidi a basso numero di copie19,20, l'inserimento di introni per disturbare le regioni tossiche21,22,23, la legatura in vitro di frammenti di cDNA 24 Mi lasa' di , 25, silenziamento mutazionale dei promotori batterici criptici presenti nel genoma virale26,27, ampli subgenomici infettivi (ISA)28,29, il metodo di assemblaggio Gibson30 e l'uso della reazione circolare di estensione della polimerasi (CPER)31.

Qui di seguito, descriviamo il protocollo dettagliato per l'ingegneria di un clone cDNAa lunghezza intera del ceppo di IKV, il deformazione di IKV, utilizzando un BAC per superare il problema della tossicità, e il salvataggio di r-IKV infettivo mediante trasfezione diretta del clone BAC cDNA in Vero cellule32, una linea cellulare approvata dalla Food and Drug Administration (FDA) per lo sviluppo di vaccini umani33. In questo sistema, la copia cDNA completa del genoma virale viene assemblata nel pLasmid bacBeloBAC1134 (Figura2A), un plasmide a basso numero di copie (da una a due copie per cellula) derivato dal fattore F Escherichia coli 35, che riduce al minimo la tossicità delle sequenze di flavivirus durante la sua propagazione nei batteri. Il cDNA del genoma di IKV è assemblato in pBeloBAC11 sotto il controllo del promotore umano CMV immediato-precoce, per consentire l'espressione dell'RNA virale (v)nel nucleo delle cellule transfected da polimerasi iI dell'RNA cellulare, e affiancato all'estremità 3 dall'epatite il ribozyme del virus delta (HDV), seguito dalle sequenze della terminazione dell'ormone della crescita bovina (BGH) e dei segnali di poliadenilazione per produrre RNA sintetici con effetti di autentici 5' e 3'-estremità del genoma virale, rispettivamente (Figura 2B). Questo sistema lanciato da cDNA si traduce nell'espressione intracellulare dell'RNA virale con tappo, permettendo il recupero di un'imposizione infettiva di ziKV senza la necessità di una fase di trascrizione in vitro. L'approccio BAC fornisce una potente metodologia applicabile alla costruzione di cloni cDNA infettivi stabili e completamente funzionali per altri flavivirus, così come altri virus RNA a filamento positivo36,37, 38,39,40,41.

Protocollo

1. Costruzione di un clone cDNA infettivo di IIKV in un BAC

NOT: La strategia per l'assemblaggio della IKV nei BAC è descritta per il ceppo RGN13 (numero di adesione KU527068) (Figura 2).

  1. Selezionare siti di restrizione univoci opportunamente distanziati nel genoma virale che sono assenti nel pBeloBAC11 (Figura2A).
    NOT: Sono stati selezionati i siti di restrizione Pml I, Afe I e BstB I (posizioni genomiche rispettivamente 3.347, 5.969 e 9.127). Nel caso in cui non siano disponibili siti di restrizione appropriati nel genoma virale, generare nuovi siti di restrizione introducendo mutazioni nucleotidi che si silenziose nel genoma virale durante la progettazione del frammento di cDNA.
  2. Generare per sintesi chimica quattro frammenti di cDNA che si estendono sul genoma a lunghezza intera (da 1 a 4), affiancati dal promotore CMV all'estremità 5'e dall'HDV R, la terminazione BGH e sequenze di poliadenzione alla fine 3' ( Figura 2B). Ogni frammento deve essere affiancato dai siti di restrizione selezionati (passaggio 1.1).
    NOT: Frammento 1 viene utilizzato come una spina dorsale per clonare il resto dei frammenti in pBeloBac11. A tal fine, deve contenere il promotore umano CMV e deve essere affiancato alla fine 5'da ApaL I (per clonare questo frammento in pBeloBAC11) e Asc I (assente nel genoma virale), e all'estremità 3'dai siti di restrizione selezionati per l'assemblaggio del clone infettivo (Pml I , Afe I, e BstB I) seguiti da Mlu I (assente nel genoma virale) e BamH I (per clonare questo frammento in pBeloBAC11). Il frammento n. 4 deve contenere la regione genomica dall'ultimo sito di restrizione selezionato (BstB I) alla fine del genoma virale, seguito dall'HDV R, dalla terminazione BGH e dalle sequenze di poliadenzione e dal sito di restrizione Mlu I (Figura2B). In alternativa, i frammenti di cDNA (n. 1- n. 4) potrebbero essere generati da una combinazione di reazioni standard della catena di trascriveresi (RT-PCR) e PCR sovrapposti utilizzando oligonucleotidi specifici.
  3. Assemblare il clone infettivo cDNA clonando in file clonazione sequenziale di frammenti da 1 a 4 in pBeloBAC11 (Figura 2B).
    1. Digerire il plasmide pBeloBAC11 e il frammento di 1 con ApaL I e BamH I. Con questo, mescolate 2 g di plaloBAC11 plasmide o 1 g di frammento di 1/g con 10 di 10 volte il buffer di reazione, 20 unità di ogni enzima e acqua per raggiungere un volume finale di 100 gradi.
    2. Deforolare il vettore BAC usando fosfofobce alcalina di gamberetti (SAP). A tal fine, aggiungere 2,5 gradi (2,5 unità) di SAP al BAC digerito e incubare a 37oC per 1 h. Calore-inattivare il SAP per incubazione a 75 gradi centigradi per 15 min.
    3. Purificare il vettore BAC dephosphorylated e il frammento n. 1 da agarose gel elettroforesi utilizzando un kit di pulizia del gel commerciale ottimizzato per la purificazione di frammenti di DNA più grandi di 10 kb (vedere la Tabella dei Materiali).
    4. Eseguire la reazione di legatura per generare il plasmide (p)BAC-1. A tal fine, mescolare 150 ng di vettore BAC digerito purificato con l'inserto purificato utilizzando un rapporto molare di vettore-inserimento di 1:3, 1,5 L di 10x T4 DNA ligase buffer contenente 10 mM ATP, un'unità di T4 DNA ligase, e acqua ad un volume finale di 15 .
    5. Incubare la miscela di ligazione per 20 h a 16 gradi centigradi. Come controllo della reazione di legatura, eseguire in parallelo una reazione di legatura senza inserto. Inattiva termicamente la ligase per incubazione a 65 gradi centigradi per 15 minuti.
      NOT: Nel caso di DNA con terminazione smussata, incubare la reazione di legatura per 20 h a 14 gradi centigradi. A causa delle grandi dimensioni del vettore BAC (Figura 2A), è essenziale utilizzare grandi quantità di vettore e inserto rispetto alle legature che utilizzano plasmidi convenzionali per aumentare l'efficienza di legatura.
    6. Trasformare 50 celle elettrocompetenti E. coli DH10B con 2 -L della reazione di legatura (passaggio 1.3.5) per elettroporazione (25 gradi di capacità, 2,5 kV e 100 gradi) utilizzando cuvette elettroporariche dotate di elettrodi distanziati a intervalli di 0,2 cm, seguendo i protocolli standard.
    7. Trasferire le cellule su un tubo di polipropilene con 1 mL di mezzo SOC (2% tryptone, 0.5% estratto di lievito, 0.05% NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM di glucosio [pH 7.0]) e incubarli a 37 gradi centigradi per 1 h con agitazione delicata (200-250 rpm). Placcare le cellule su piastre di agar di Luria brodo (LB) contenenti 12,5 g/mL di cloramtrenico e incubarle a 37oC per 16 h.
    8. Scegli da 8 a 12 colonie batteriche, fai una replica su una piastra di agar LB fresca contenente 12,5 g/mL di cloramhenicoe e verifica se contengono l'inserto corretto mediante l'analisi PCR diretta utilizzando oligonucleotidi specifici.
    9. Scegliere una colonia positiva dalla piastra di replica, coltivarla in 100 mL di LB contenente 12,5 g/mL di clorammidenicol e isolare il BAC cDNA con il metodo di lisi alcalina utilizzando un kit commerciale di midi plasmide, seguendo la raccomandazione per la purificazione di grandi plasmidi a bassa copia (vedere la Tabella dei materiali).
      NOT: BAC cDNA preparato con questo metodo può essere contaminato con fino al 30% del DNA genomico batterico, ma è adatto in qualità per eseguire analisi di restrizione, sequenziamento e clonazione. A seconda delle dimensioni del BAC, è possibile ottenere rese di 4-6 g del plasmide BAC.
    10. Verificare l'integrità genetica del cDNA clonato mediante l'analisi delle restrizioni. Digerire 500 ng del pBAC-1 plasmid e con Asc I e Pml I a 37 gradi centigradi per 1 h e confermare la presenza del frammento di 1 usd da elettroforesi gel. Per confermare ulteriormente che non sono state introdotte mutazioni indesiderate, sequenziare l'inserto con oligonucleotidi specifici.
    11. Partendo dal pLAsmidp- 1 contenente i siti di restrizione selezionati (Pml I, Afe I, BstB I e Mlu I), clona in sequenza iframmenti da 2 a 4 per generare il clone cDNA infettivo a tutta lunghezza pBAC- come descritto in precedenza per il frammento n. 1 (passaggi 1.3.1-1.3.10).

2. Preparazione dell'alta purezza pBAC-IKV per il salvataggio di

NOT: La preparazione su larga scala di un clone infettivo ultrapure pBAC-IKV, adatto alla trasfezione e al salvataggio di virus infettivi, viene eseguita da una lisi alcalina con un kit commerciale sviluppato appositamente per la purificazione BAC (vedi tabella di Materiali). Il kit deve includere una fase di digestione di eonuclea dipendente dall'ATP che rimuove la contaminazione del DNA genomico batterico, consentendo l'isolamento del BAC cDNA con un grado di purezza simile a quello ottenuto con il metodo del cloruro di cè.

  1. Coltivare una singola colonia di E. coli DH10B portando il clone infettivo pBAC-IKV in 5 mL di lB medio contenente 12,5 g/mL di cloramfemicolo a 37 oC per 8 h con agitazione delicata (200-250 rpm).
  2. Aggiungete 1 mL di coltura batterica (passo 2.1) a 500 mL di LB con 12,5 g/mL di cloramfenicolo in un pallone da 2 L e fate crescere le cellule a 37 gradi per 14-16 h (fino a un OD600 di 0,6-0,8).
    NOT: I brodi ricchi, come Il Terrific Broth (TB), possono produrre densità cellulari estremamente elevate, con conseguente minore resa e minore purezza del BAC cDNA.
  3. Purificare il clone bac infettivo cDNA mediante lisi alcalina utilizzando un kit commerciale sviluppato appositamente per la purificazione BAC, seguendo le specifiche del produttore (vedere la Tabella dei Materiali). Mantenere il BAC cDNA purificato a 4 gradi centigradi. A seconda delle dimensioni del BAC, è possibile ottenere rese di 30 g di clone ULTRApure BAC cDNA.
    NOT: Non asciugare il pellet di DNA per più di 5 min, poiché l'essiccazione eccessiva renderà difficile sciogliere il cDNA BAC. A causa delle grandi dimensioni del clone BAC cDNA, evitare il vorticaggio o il pipettaggio per evitare la tosatura del plasmide.

3. Salvataggio di temuti r-IKV dal clone BAC cDNA per trasfezione di cellule vero

NOT: L'infectiouszia r-IKV viene recuperata dalla trasfezione delle cellule Vero con il clone pBAC-IKV cDNA, utilizzando un reagente commerciale di trasfezione lipidica cationica (vedi la Tabella dei Materiali; Figura 3).

  1. Un giorno prima della trasfezione, piastra su piastre 6-pozze 5 x 105 Vero cellule/pozzo in mezzo di crescita (il mezzo di Eagle modificato di Aquila [DMEM] integrato con 5% siero bovino fetale [FBS], 2 mM L-glutammina, e 1% aminoacidi non essenziali) senza antibiotici per aumentare il 90% di monostrati cellulari confluenti al momento della trasfezione.
    NOT: Si consiglia di eseguire i salvataggi del virus in triplicati.
  2. Mezzo equilibrate ridotto (vedi Tabella dei Materiali) a temperatura ambiente e preparare miscele di trasfezione in tubi sterili di microfuge per ogni campione di trasfezione come segue.
    1. Aggiungere 4 g del clone BAC cDNA in 250 gradi di mezzo ridotto a sieri e mescolare con attenzione, evitando vortice per evitare la tosatura del plasmide.
    2. In un tubo separato, diluire 12 - L di reagente di trasfezione (1 mg/mL) (vedi la tabella dei materiali) in 250 - L di mezzo siero-ridotto, mescolare per vortice, e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    3. Unire il BAC cDNA diluito e il reagente di trasfezione (con un rapporto 1:3 di DNA:transfection reagente), mescolare attentamente evitando il vortice e incubare a temperatura ambiente per 20-30 min.
  3. Durante il periodo di incubazione della miscela di reagente BAC cDNA/trasfezione, lavare le cellule Vero con mezzo di crescita senza antibiotici e lasciare le cellule in 1 mL di mezzo fresco senza antibiotici.
    NOT: L'aggiunta di antibiotici durante il processo di trasfezione può diminuire l'efficienza della trasfezione.
  4. Distribuire a discesa i 500 gradi della miscela di reagente BAC cDNA/transfection (del passo 3.2.3) sulle cellule Vero, mescolarle facendo oscillare la piastra avanti e indietro e incubare le cellule in un'incubatrice umidificata di COdel 5% a 37 gradi centigradi per 6 h.
  5. Togliere il mezzo di trasfezione, aggiungere 2 mL di mezzo di crescita fresco con antibiotici (100 U/mL penicillina e 100 g/mL streptonomici), incubare le cellule in un 5% di CO2 incubatore umido a 37 gradi centigradi, e controllare ogni giorno per l'induzione di effetto citopatico (CPE ).
    NOT: Il CPE di IKV è abbastanza pronunciato nelle cellule Vero ed è caratterizzato dalla presenza di cellule arrotondate e birefrananti che si staccano e galleggiano nella coltura tissutale supernatante.
  6. Raccogliere l'aliquota (100 ) dei supernatanti a coltura di tessuto della cellula Vero (passaggio 3,5) ogni 24 h per determinare l'efficienza del recupero del virus valutando la presenza di iKV utilizzando un saggio di placca standard sulle cellule Vero fresche (Figura4A).
  7. Dopo quattro o sei giorni di trasfezione, quando il CPE è di circa il 50%-75% (Figura 4B), raccogliere i supernatanti di coltura dei tessuti in tubi conici da 15 mL e centrifugarsi a 2.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi per rimuovere i detriti cellulari.
  8. Raccogliere i supernatanti che contengono r'IKV e scartare i pellet cellulari. Aliquota in criotubi e conservarli a -80 gradi centigradi per confermare ulteriormente la presenza di r-IKV salvati.

4. Titolazione di R-IKV recuperato

  1. Un giorno prima della titolazione, seme su piastre 12-well 2.5 x 105 cellule Vero / bene in mezzo di crescita per sollevare 90% monostrati di cellule confluenti al momento della titolazione.
    NOT: Si consiglia di condurre la titolazione del r-IKV recuperato in triplicati.
  2. Rimuovere un'aliquota del supernatante dal congelatore (passaggio 3.8) e fare diluizioni seriali di 10 volte nel mezzo di crescita senza FBS.
  3. Lavare le cellule Vero 2x con la saliina (PBS) con buffer fosfato e aggiungere 200 l/po di ogni diluizione del virus in triplice copia. Collocare le piastre in un'incubatrice umidificata di CO2 del 5% a 37 gradi centigradi e saldata ogni 15 min per un periodo di adsorbimenti di 90 min.
  4. Rimuovere l'inoculum virale, sovrapporre le cellule con 2 mL di mezzo di crescita contenente 2% FBS, 1% DEAE-dextran, e 0.6% Agar Noble, e incubare a 37 s C sotto 5% CO2 per 3-4 giorni.
    NOT: È possibile utilizzare agarose, metilcellulosa o altri supporti di sovrapposizione. Il tempo per una corretta formazione della placca varia a seconda della sovrapposizione utilizzata e del ceppo di .
  5. Correggere le cellule infettate da SIM-KV con 1 mL/pozzetto di formaldeide del 4% diluite in PBS a temperatura ambiente per 1 h, rimuovere la sovrapposizione e visualizzare le placche virali macchiandole con lo 0,1% di viola cristallino nel 20% di metanolo a temperatura ambiente per 15 min.
    1. Scartare il cristallo viola, lavare 3x con acqua, lasciare asciugare le piastre e contare manualmente le placche (Figura 4C, pannello sinistro). Il tigre virale è calcolato come unità di formazione della placca per millilitro (PFU/ml).
  6. In alternativa, le placche virali possono essere visualizzate immunostaining con l'anticorpo monoclonale del topo proteina pan-flavivirus E (mAb) 4G2 (Figura4C, pannello destro).
    1. Per valutare le placche di SIMKV mediante immunostaining, dopo la fissazione e la rimozione dell'agar sovrapposto come descritto sopra (al punto 4.5), lavare le cellule 2x con PBS e permelizzarle per incubazione con 200 gradi/pozzetto di 0,5% Triton-X100 in PBS per 15 min a temperatura ambiente.
    2. Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione, lavare le cellule 3x con PBS e bloccarle con una soluzione di blocco di 200 (10% FBS in PBS) per 1 h a temperatura ambiente.
      NOT: In questo passaggio è possibile utilizzare altre soluzioni di blocco standard (ad esempio, 2,5% BSA in PBS).
    3. Rimuovere la soluzione di blocco e incubare le cellule con 200 gradi centigradi della proteina mAb 4G2 diluita in soluzione di blocco (1 g/mL) per 1 h a 37 .
      NOT: Altri anticorpi mAb o policlonali (pAb) possono essere utilizzati al posto del 4G2 per l'immunostaining e il rilevamento di placche virali.
    4. Lavare le cellule 3x con PBS e incubarle con 200 litri di anticorpo secondario biotinylato anti-topo diluito (seguendo la raccomandazione del produttore) in soluzione di blocco per 1 h a 37 .
    5. Rimuovere l'anticorpo secondario, lavare le cellule 4x con PBS e visualizzare le placche virali utilizzando un kit perossidasi a base di avidina/biotina seguendo le specifiche del produttore (vedere la Tabella dei Materiali).

5. Conferma del successo del salvataggio di r'IKV

NOT: Per confermare ulteriormente l'identità del virus salvato, l'espressione della proteina E di IKV Viene analizzata dall'immunofluorescenza utilizzando il mAb 1176-56 specifico del topo per la proteina .IKV E (Figura 4D). Questo mAb è specifico per la proteina E, contrariamente alla situazione della proteina pan-flavivirus E mAb 4G2 (passaggio 4.6.3). In alternativa, l'identità del virus può essere confermata mediante sequenziamento.

  1. Un giorno prima dell'analisi dell'immunofluorescenza, i semi copronoi i duelabbra in piastre di 24 pozze contenenti 1 x 105 5 cellule Vero/pozzo nel mezzo di crescita per aumentare il 90% di monostrati cellulari confluenti al momento dell'infezione.
  2. Lavare le cellule 2x con PBS e infettarle con una molteplicità di infezione (MOI) di 0,5 PFU/cellula del virus salvato nel mezzo di crescita senza FBS (100 - L/po' di acqua) in triplice copia. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi per 90 min.
  3. Dopo l'adsorbimento virale, rimuovere l'inoculo virale, aggiungere 0,5 mL di mezzo di crescita fresco con 2% FBS, e incubare le cellule in un 5% CO2 incubatore umido a 37 gradi centigradi per 48 h.
  4. Rimuovere la coltura tissutale supernatante, fissare le cellule con 150 l/po di 4% di paraformaldeide in PBS per 20 min a temperatura ambiente, e permeabilizzare le cellule con 150 gradi L/po' di 0,5% Triton-X100 in PBS per 15 min a temperatura ambiente.
  5. Dopo aver rimosso la soluzione di permeabilizzazione e lavato le cellule 3x con PBS, bloccare le cellule con 150 l/po di soluzione di blocco durante 1 h a temperatura ambiente.
    NOT: La scansione cellulare viene bloccata con soluzioni di blocco alternative (ad esempio, 2,5% BSA in PBS).
  6. Rimuovere la soluzione di blocco e incubare le cellule con 100 l/po di mAb 1176-56, specifica per la proteina .IKV E, diluita nella soluzione di blocco (1 g/mL) per 1 h a 37 .
  7. Lavare le cellule 3x con PBS, incubarle a temperatura ambiente per 1 h con 100 l/po di Alexa Fluor 488-coniugato anticorpo secondario anti-topo diluito (seguendo la raccomandazione del produttore) in soluzione di blocco, lavare le cellule ampiamente con PBS, e incubarli con 150 l/po di 4',6'-diamidino-2-fenilondole (DAPI; 1 mg/mL) diluito 1:200 in PBS a temperatura ambiente per 10 min.
  8. Lavare le celle 3x con PBS, montare i copricoperture su un supporto di montaggio antisbidisca (vedere la tabella dei materiali) e analizzare i campioni al microscopio a fluorescenza.
    NOT: Per l'immagazzinamento a lungo termine, conservare i campioni a 4 gradi centigradi, protetti dalla luce.

6. Amplificazione e generazione di titoli virali

NOT: Una volta confermata l'identità del virus salvato (sezione 5), amplificare il virus sulle cellule Vero e generare scorte virali per ulteriori studi.

  1. Coltivano le cellule Vero in piastre da 100 mm x 21 mm al 90% di confluenza e le infettano con un MOI di 0,1 PFU/cellula come descritto in precedenza.
  2. Quando il CPE è di circa il 75% (circa 48-72 h post-infezione), raccogliere la coltura tissutale supernatant in un tubo conico 50 mL e centrifugare a 2.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi per rimuovere i detriti cellulari.
  3. Raccogliere il supernatante che contiene r'IKV e scartare il pellet cellulare. Aliquota la supernata in criotubi e conservarli a -80 gradi centigradi.
  4. Rimuovere un virus aliquota dal congelatore e determinare il titer virale con un saggio placca come descritto in precedenza (sezione 4).

Risultati

Il protocollo qui descritto consente la generazione di cloni infettivi cDNA a lunghezza composta da .IKV utilizzando un BAC per ridurre al minimo i problemi di tossicità associati a diverse sequenze flavivirali. Il recupero efficiente di r-IKV infettivo dal clone BAC cDNA può essere facilmente ottenuto dopo la trasfezione di cellule Vero sensibili (Figura 2). Utilizzando questo protocollo, abbiamo generato un clone cDNA stabile a lunghezza intera del ceppo RGN32 di .IKV clonando in sequenza quattro frammenti di cDNA sovrapposti nel pBeloBAC1134 del plascoBAC 11 di BAC utilizzando metodi di clonazione convenzionali e unici siti di restrizione presenti nel genoma virale (Figura 2). Il clone cDNA a tutta lunghezza è stato affiancato all'estremità 5'dall'emittente umano CMV per consentire l'espressione del vRNA nel nucleo delle cellule trasfette, e all'estremità 3'dall'HDV R 'seguito dalle sequenze di poliadenilazione e terminazione del BGH, per produrre RNA contenenti l'esatto 3'-fine del genoma virale (Figura 2). La stabilità nei batteri del clone BAC cDNA generato, insieme alla sua facile manipolazione utilizzando tecnologie standard del DNA ricombinante, evidenzia il potenziale dell'approccio BAC cDNA per la generazione rapida e affidabile di cloni cDNA a lunghezza intera stabili di Altri flavivirus o virus dell'RNA dal filamento positivo con genomi virali instabili.

Una volta assemblato il clone BAC cDNA (Figura 2), il virus infettivo potrebbe essere facilmente recuperato dopo la trasfezione diretta di cellule Vero sensibili con il clone BAC cDNA utilizzando liposomi cationici(Figura 3). Questo sistema lanciato da cDNA ha permesso l'espressione intracellulare del vRNAcon tappo, consentendo il recupero di virus infettivi senza la necessità di una fase di trascrizione in vitro. Utilizzando questo approccio, siamo stati in grado di salvare r-IKV-RGN con titers superiore a 106 PFU/mL a 5 giorni posttrasfezione (Figura 4A). Inoltre, il virus salvato ha indotto un CPE chiaro (Figura 4B), generato placche omogenee di circa 2 mm (Figura4C),e la sua identità è stata confermata dal sequenziamento (dati non mostrati) e dall'analisi dell'immunofluorescenza utilizzando l'analisi per la proteina IKV E, 1176-56 (Figura 4D). I dati in vitro indicano che il r-IKV-RGN recuperato è stato replicato in modo efficiente nelle cellule Vero e a livelli rispetto a un isolare32 (dati non mostrati). Nel complesso, questi risultati dimostrano che il r-IKV infettivo può essere salvato da cloni cDNA a lunghezza intera assemblati in un BAC.

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Figura 1 : Organizzazione del genoma di IKV e struttura virione. (A) Organizzazione del genoma: IKV contiene un RNA positivo a filamento singolo che viene tradotto come un singolo poliproteina. La poliproteina tradotta è stata scissa da proteasi virali (frecce) e ospite (diamanti) per produrre le proteine strutturali capsid (C, blu), matrice (M, marrone), e envelop (E, verde), e sette proteine non strutturali (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e NS5). Le regioni non tradotte a 5' e 3' (UTR) alla fine del genoma virale sono indicate con linee nere. (B) Struttura Virion: i virioni di IKV erano decorati con le proteine E e M, ancorati in un bistrato lipidico con una struttura icosaedrale. Sotto l'involucro virale c'era il nucleocapside virale composto dalla proteina C associata all'RNA genomico virale. Questa cifra è stata adattata da . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2 : Assemblaggio del clone infettivo cDNA di .IKV in un BAC. (A) Rappresentazione schematica del pBeloBAC11 BAC:I geni regolatori parA, parB, parCe repE, l'origine della replicazione delfattore F (OriS), il gene resistente al cloramenico (Cmr) e il lac Sono indicati il gene . I relativi siti di restrizione utilizzati per assemblare il clone infettivo del cDNA di IKV sono sottolineati. (B) Assemblaggio del clone di cDNA infettivo a lunghezza intera di IKV nel pBeloBAC11 BAC:Quattroframmenti di DNA sovrapposti (n. 1 -4), che coprono l'intero genoma di sintesi e clonato in sequenza in pBeloBAC11 per generare il clone infettivo del cDNA di iKV pBAC-IKV. Il cDNA infettivo di iKV a piena lunghezza è stato assemblato sotto il controllo del promotore immediato-precoce del citomegalovirus umano (CMV) e affiancato all'estremità 3'dall'HDV ribozyme (R) e le sequenze di ormone della crescita bovina (BGH) e sequenze di poliambonazione. Gli acronimi per i geni virali e gli elementi regolatori sono come descritto nella Figura 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3 : flusso di lavoro per la generazione di r-IKV dal clone BAC cDNA. Le cellule di vero al 90% della confluenza sono state trascate nel monostrato con il clone infettivo cDNA pBAC-IKV (Figura 2) utilizzando liposomi cationici. A 4-6 giorni dopo la trasfezione, quando la CPE era evidente, i supernatanti della coltura tissutale contenenti r-IKV sono stati raccolti e valutati per la presenza di virus (Figura 4) e utilizzati per l'amplificazione virale nelle cellule Vero. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4 : Recupero e caratterizzazione in vitro di r-IKV. (A) Salvataggio di r-IKV infettivo dal clone BAC cDNA: le cellule Vero al 90% della confluenza (formato piastra 6-po, triplicati) sono state trascate in modo fittizio o trascate con 4 i feticidell di virus nei supernatanti della coltura tissutale sono stati determinati dal saggio di placca (PFU/mL). Le barre di errore indicano deviazioni standard da tre diversi esperimenti di trasfezione. La linea nera tratteggiata indica il limite di rilevazione (50 PFU/mL). (B) Le cellule CPE:Vero virali al 90% di confluenza (formato piastra 6-po, triplicati) sono state infettate in modo mock (top) o infettate (MOI di 0,5 PFU/cellula) con r'IKV, e a 48 h di post-infezione, la presenza di CPE è stata valutata dalla microscopia. Le barre di scala ( 100 m. (C) L'analto della placca virale e l'immunostaining: le cellule nere al 90% della confluenza (formato 12-beh piastra) sono state infettate con r-IKV, e a 72 h di post-infezione, le placche virali sono state visualizzate da colorazione viola cristallina (a sinistra) o immunostaining ( a destra) utilizzando la proteina pan-flavivirus E mAb 4G2. Barre di scala - 5 mm. (D) Immunofluorescenza:Le cellule veroali al 90% di confluenza (formato piastra 24-po, triplicati) sono state infettate (MOI di 0,5 PFU/cellula) con r-IKV e, a 48 h di post-infezione, analizzate dall'immunofluorescenza utilizzando il mAb 1176-56, specifico per E proteina. I nuclei cellulari sono stati macchiati con DAPI. Viene visualizzata un'immagine rappresentativa delle cellule Vero infettate da SIMLV. Il quadrato bianco in alto a destra rappresenta un'immagine ingrandita delle cellule Vero infettate da SIMLV. Barre di scala : 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

I cloni infettivi di cDNA costituiscono strumenti molecolari essenziali per la ricerca di base dei virus dell'RNA e lo sviluppo di vaccini e/o l'identificazione di strategie antivirali. Tuttavia, per molti virus dell'RNA a filamento positivo, compresi i flavivirus, la generazione di cloni infettivi di cDNA è difficile a causa dell'instabilità dei cDNA clonati quando vengono propagati nei batteri che utilizzano plasmidi standard ad alto numero di copie. Nel caso di iKV e di altri flavivirus, questa instabilità è dovuta principalmente all'espressione che perde le proteine virali tossiche dei promotori batterici criptici presenti nel genoma virale14,15,16,17 . Qui, descriviamo un protocollo alternativo e potente per generare un clone cDNA infettivo stabile di .IKV come un singolo plasmide, basato sull'uso del pBeloBAC1134 (Figura 2A) per superare il problema della tossicità, l'uso del Promotore di CMV per consentire l'espressione del vRNA nel nucleo delle cellule trasfette, e l'HDV R z per generare vRNA con accurate 3'-estremità (Figura 2B). Utilizzando questo metodo, abbiamo generato con successo un clone infettivo completamente stabile del RGN di deformazione di Figura 4).

Un enorme sforzo è stato fatto negli ultimi anni per superare i problemi di instabilità associati ai cloni di cDNA infettivi di IKV, e diversi approcci sono stati implementati con successo18, tra cui la legatura in vitro dei frammenti di cDNA24 ,25, plasmidi a bassa copia19,20, l'inattivazione di promotori batterici criptici con l'introduzione di mutazioni silenziose26,27, inserimento intron21, 22 Milia , 23, il metodo assembly Gibson30, il metodo ISA28,29e l'utilizzo di CPER31. Anche se questi approcci superano il problema della tossicità e sono utili per generare cloni di cDNA infettivi di IKV, alcuni di loro sono laboriosi e presentano diversi svantaggi, tra cui la necessità di passi di ligazione e trascrizione in vitro che riducono il virus l'efficienza di recupero o l'introduzione di un elevato numero di mutazioni silenziose per inattivare il promotore batterico criptico che potrebbe influenzare la forma fisica virale, tra gli altri. L'approccio descritto in questo protocollo presenta i vantaggi seguenti. i) Il plasmide BACpBeloBAC1134 ha una replica rigorosamente controllata, mantenendo una o due copie di plasmide per cellula, che riduce al minimo la tossicità e consente una manutenzione stabile nei batteri di cDNA instabili. ii) La propagazione e la modifica dei plasmidi BAC sono quasi simili a quelle dei plasmidi convenzionali, considerando le lievi modifiche descritte in questo protocollo per manipolare frammenti di DNA di grandi dimensioni e plasmidi a bassa copia. In particolare, il clone BAC cDNA può anche essere modificato in E. coli da ricombinazione omologa utilizzando il sistema di ricombinazione rosso42,43,44. 3) L'uso di promotore CMV consente il l'espressione intracellulare del vRNA di VRNA e il recupero di virus infettivi senza richiedere una fase di trascrizione in vitro. iv) Dopo la trasfezione diretta di cellule sensibili (ad esempio, Vero) viene generato il r-IKV infettivo con il clone BAC cDNA. Poiché la trafezione del DNA nelle cellule dei mammiferi è più efficiente della trasfezione dell'RNA, l'efficienza di recupero del virus con l'approccio BAC è superiore a quella osservata utilizzando le trascrizioni dell'RNA, riducendo il numero di passaggi nelle cellule di coltura per generare uno stock virale e, di conseguenza, limitando l'introduzione di mutazioni indesiderate per adattamento della coltura cellulare.

Infine, il potenziale dell'approccio BAC è supportato dall'uso di questo metodo (con lievi modifiche) per progettare cloni infettivi di cDNA di altri flavivirus, tra cui il virus della dengue36e diversi coronavirus di alto impatto salute umana e animale, come il coronavirus trasmissibile di gastroenterite37 (TGEV), il virus della peritonite infettiva felina38 (FIPV), il coronavirus umano OC4339 (HCoV-OC43), grave sindrome respiratoria acuta40 (SARS-CoV), e sindrome respiratoria del Medio Oriente coronavirus41 (MERS-CoV), tra gli altri.

Nel protocollo qui descritto sono presenti due passaggi critici da considerare. Una considerazione importante è l'identificazione di appositi siti di restrizione unici nel genoma virale che sono assenti nel plasmide BAC. Se non sono disponibili siti di restrizione adeguati, è possibile generare nuovi siti di restrizione durante la progettazione della clonazione mediante l'introduzione di mutazioni mutiadi silenziosi. Un'altra questione importante è che i plasmidi BAC sono presenti in una o due copie per cellula, e quindi, basse rese di plasmidi BAC con un'elevata contaminazione del DNA genomico batterico sono ottenuti utilizzando protocolli standard progettati per plasmidi medio-copia-numero. Questo potenziale problema è facilmente superata utilizzando grandi volumi di coltura e purificando il plasmide BAC con un kit commerciale sviluppato appositamente per la purificazione BAC.

In sintesi, abbiamo sviluppato un potente approccio genetico inverso basato sull'uso di un BAC che potrebbe essere adattato per generare cloni di cDNA infettivi stabili e completamente funzionali di altri virus dell'RNA a filamento positivo per facilitare lo studio della biologia di questi virus e lo sviluppo di vaccini e/o per facilitare l'identificazione dei farmaci antivirali.

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano ringraziare Carla Gàmez per la sua assistenza tecnica nella generazione di cloni BAC cDNA e Snezhana Dimitrova per aver aiutato con la preparazione video. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni del Ministero spagnolo dell'Economia e della Competitività (MINECO, numero di sovvenzione BFU2016-79127-R) alla F.A.T. e dagli Istituti Nazionali di Sanità (NIH, numero di sovvenzione 1R21AI120500) a L.M.S. e F.A.T.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Molecular Biology Reagents
Afe INew England BioLabsR0652S10,000 units/mL
AmpliTaq DNA PolymeraseThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)N80801615,000 Units/mL
ApaL INew England BioLabsR0507S10,000 units/mL
Asc INew England BioLabsR0558S10,000 units/mL
BamH INew England BioLabsR0136S10,000 units/mL
BstB INew England BioLabsR0519S20,000 units/mL
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
ElectroMAX DH10B Cells ThermoFisher Scientific (Invitrogen)18290015Electocompetent DH10B cells
Electroporation Cuvettes, 0.2 cmBio-Rad165-2086
EthanolMerck100983Flamable
IsopropanolMerck109634Flamable
Large-Construct Kit (10)QIAGEN12462For high-purity BAC preparation
LB BrothThermoFisher Scientific (Invitrogen)12780029Can be homemade as well
LB with AgarThermoFisher Scientific (Invitrogen)22700041Can be homemade as well
MethanolMerck106009Flamable
Mlu INew England BioLabsR0198S10,000 units/mL
OligonucleotidesIDTN/A
Plasmid pBeloBAC11New England BioLabsER2420S (E4154S)
Plasmid Midi Kit (25)QIAGEN12143For midle-scale preparation of BAC plasmids
Pml INew England BioLabsR0532S20,000 units/mL
Polypropylene tubes (10 mL)DeltaLab175724Other commercial sources are acceptable
QIAEX II Gel Extraction Kit (150)QIAGEN20021Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb
Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP)New England BioLabsM0371S1,000 units/mL
SOC MediumThermoFisher Scientific (Invitrogen)15544034Can be homemade as well
Synthesis of cDNA fragmentsBio BasicN/A
T4 DNA LigaseSigma-Aldrich (Roche)104812200011,000 units/mL
2. Cell Culture Reagents
6-Well PlatesThermoFisher Scientific (Nunc)140675
12-Well PlatesThermoFisher Scientific (Nunc)150628
24-Well PlatesThermoFisher Scientific (Nunc)142485
Agar NobleVWR214230
Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibodyVariesN/A
Biotinylated Anti-Mouse Secondary AntibodyVariesN/A
Cell Culture Dishes (100x21 mm)ThermoFisher Scientific (Nunc)172931
Conical Tubes (15 mL)VWR525-0150
Conical Tubes (50 mL)VWR525-0155
Crystal VioletSigma-AldrichC6158
DAPISigma-AldrichD9542Toxic and carcinogenic
DEAE-DextranSigma-AldrichD9885
DMEMThermoFisher Scientific (Gibco)11995065
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher Scientific (HyClone))SV30160.03
FormaldehydeSigma-AldrichF8775Toxic and carcinogenic
L-GlutamineThermoFisher Scientific (Gibco)25030081
Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientific (Invitrogen)11668019Transfection reagent
Nonessential amino acidsThermoFisher Scientific (Gibco)11140035
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermoFisher Scientific (Gibco)31985070Transfection medium
Pan-flavivirus E protein mAb 4G2BEI ResourcesNR-50327
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710-SToxic and carcinogenic
PBSThermoFisher Scientific (Gibco)14190144
Penicillin/StreptomycinThermoFisher Scientific (Gibco)15140122
ProLong Gold Antifade ReagentThermoFisher Scientific (Invitrogen)P10144
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787
Vectastain ABC KitVector Laboratories IncPK-4010Avidin/biotin-based peroxidase kit
Vero CellsATCCCCL-81
ZIKV E Protein mAb 1176-56BioFront TechnologiesBF-1176-56
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis SystemBio-Rad1704468Other commercial sources are acceptable
Class II Biosafety CO2 CabinetVariesN/AOther commercial sources are acceptable
Desktop Refrigrated CentrifugeVariesN/A
Fluorescence MicroscopeVariesN/A
High-Speed Refrigrated CentrifugeVariesN/A
MicroPulser ElectroporatorBio-Rad1652100Other machines are acceptable
SimpliAmp Thermal CyclerThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)A24811Other machines are acceptable
VortexerVariesN/A

Riferimenti

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