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Resumo

O protocolo descreve o cultivo de biofilmes transversais compostos por candida albicans e streptococcus mutans e apresenta um método confocal baseado em microscopia para o monitoramento de pH extracelular dentro desses biofilmes.

Resumo

Biofilmes transversais que consistem em células fúngicas e bacterianas estão envolvidos em uma variedade de doenças bucais, como infecções endodônticas, periodontite, infecções mucosas e, mais notavelmente, cárinos da primeira infância. Em todas essas condições, o pH na matriz biofilme impacta as interações microbe-hospedeiros e, portanto, a progressão da doença. O protocolo atual descreve um método confocal baseado em microscopia para monitorar a dinâmica do PH dentro de biofilmes entre reinos compostos por candida albicans e streptococcus mutans. O espectro de emissão dupla dependente de pH e as propriedades de coloração da sonda ratiométrica C-SNARF-4 são explorados para determinar quedas no pH em áreas extracelulares dos biofilmes. O uso de ratiometria pH com a sonda requer uma escolha meticulosa de parâmetros de imagem, uma calibração completa do tintura e pós-processamento cuidadoso e baseado em limiar dos dados de imagem. Quando utilizada corretamente, a técnica permite a rápida avaliação do pH extracelular em diferentes áreas de um biofilme e, portanto, o monitoramento de gradientes pH horizontais e verticais ao longo do tempo. Embora o uso de microscopia confocal limite o perfil z a biofilmes finos de 75 μm ou menos, o uso de ratiometria pH é idealmente adequado para o estudo não invasivo de um importante fator de virulência em biofilmes entre reinos.

Introdução

Biofilmes entre reinos compostos por espécies fúngicas e bacterianas estão envolvidos em várias condições patológicas na cavidade oral. Candida spp. tem sido frequentemente isolada de infecções endodônticas1 e de lesões periodontais2,3. Em infecções mucosas, espécies estreptocócicas do grupo de áciculos têm sido mostradas para melhorar a formação fungal de biofilme, invasão de tecidos e disseminação nos modelos in vitro e murina4,5,6,7. Mais interessante, o transporte oral de Candida spp. tem sido comprovado estar associado à prevalência de cáios em crianças8. Como mostrado nos modelos de roedores, uma relação simbiótica entre mutanos streptococcus e candidas albicans aumenta a produção de polissacarídeos extracelulares e leva à formação de biofilmes mais grossos e cariogênicos9,10.

Em todas as condições acima mencionadas, as cárinas da primeira infância, em particular, o pH biofilme é importante para a progressão da doença, e o papel eminente da matriz biocinematográfica para o desenvolvimento de microambientes acidogênicos11 exige metodologias que permitam estudar mudanças de pH dentro de biofilmes transfronteiriços. Abordagens simples e precisas baseadas em microscopia confocal para monitorar pH dentro de biofilmes bacterianos12 e fúngicos13 foram desenvolvidas. Com o dye ratiométrico C-SNARF-4 e o pós-processamento de imagem baseado em limiares, o pH extracelular pode ser determinado em tempo real em todas as três dimensões de um biofilme14. Em comparação com outras técnicas publicadas para monitoramento de pH baseado em microscopia em biofilmes, a ratiometria de pH com C-SNARF-4 é simples e barata, pois não requer a síntese de partículas ou compostos que incluem um tintura de referência15 ou o uso de excitação de dois fótons16. O uso de apenas um corante evita problemas com compartimentação de sondas, sangramento fluorescente e branqueamento seletivo16,17,18, enquanto ainda permite uma diferenciação confiável entre pH intra e extracelular. Finalmente, a incubação com o tintura é realizada após o crescimento do biofilme, que permite estudar tanto laboratório quanto em biofilmes cultivados no situ.

O objetivo do presente trabalho é ampliar o uso da ratiometria de pH e fornecer um método para estudar mudanças de pH em biofilmes inter-reinos. Como prova de conceito, o método é usado para monitorar pH em biofilmes de espécies duplas compostas por s. mutans e c. albicans expostos à glicose.

Protocolo

O protocolo para coleta de saliva foi revisto e aprovado pelo Comitê de Ética do Condado de Aarhus (M-20100032).

1. Cultivo de Biofilmes transfronteiriços

  1. Grow S. mutans DSM 20523 e C. albicans NCPF 3179 em placas de agar de sangue a 37 °C em condições aeróbicas.
  2. Transfira colônias individuais de cada organismo para testar tubos preenchidos com 5 mL de infusão cardíaca cerebral (BHI). Cresça por 18 h em condições aeróbicas a 37 °C.
  3. Centrífuga as culturas durante a noite em 1.200 x g por 5 min. Descarte o supernatante, resuspenda as células em soro fisiológico e ajuste o OD550 nm a 0,5 para C. albicans (~107 células/mL) e S. mutanos (~108 células/mL). Diluir a suspensão s. mutans 1:10 com soro fisiológico estéril (~107 células/mL).
  4. Pipette 50 μL de solução salivar estéril, preparada de acordo com o método de Jong et al.19, nos poços de uma placa inferior óptica 96-poço para microscopia. Incubar por 30 min a 37 °C. Lave os poços 3x com 100 μL de soro fisiológico estéril. Esvazie os poços.
  5. Adicione 100 μL de suspensão C. albicans a cada poço. Incubar a 37 °C por 90 min. Lave 3x com soro fisiológico estéril.
    NOTA:Não esvazie completamente os poços durante a lavagem. Deixe um reservatório de 20 μL para evitar forças excessivas de cisalhamento.
  6. Adicione 100 μL de soro bovino fetal inativado pelo calor (inativado a 56 °C por 30 min) a cada poço. Incubar a 37 °C por 2 h. Lave 3x com soro fisiológico estéril. Esvazie os poços, deixando um reservatório de 20 μL.
  7. Adicione 100 μL de suspensão s. mutans (preparado na etapa 1.3) a cada poço. Adicione 150 μL de BHI contendo 5% de sacarose. Incubar a 37 °C por 24 h ou mais. Ao cultivar biofilmes mais antigos, mude o meio diário para o BHI fresco. No final da fase de crescimento biofilme entre reinos, lave 5x com soro fisiológico estéril.

2. Imagem de pH ratiométrica

NOTA:A imagem de pH ratiométrica precisa ser realizada imediatamente após a conclusão do crescimento do biofilme.

  1. Para imagens de pH ratiométricas, use um microscópio de varredura a laser confocal invertido com uma lente de imersão de óleo ou água de 63x, uma linha laser de 543 nm e um sistema de imagem espectral (ou seja, detector DE META) para permitir a imagem de sinais fluorescentes sobrepostos. Use uma incubadora para aquecer o estágio do microscópio a 35 °C.
  2. Defina o detector para garantir a detecção de fluorescência verde de 576-608 nm e detecção simultânea de fluorescência vermelha de 629-661 nm. Escolha um poder laser apropriado e ganhe para evitar excesso e subexposição.
    NOTA: A exposição das imagens é melhor vista em imagens de paleta com coramento falso.
  3. Defina o tamanho do pinhole para 1 Unidade Arejada ou uma fatia óptica de ~0,8 μm. Defina o tamanho da imagem para 512 x 512 pixels e a velocidade de varredura para 2. Escolha uma média de linha de 2, usando a opção média.
    NOTA: No início de uma série de experimentos, verifique se as configurações do microscópio escolhido fornecem um claro contraste entre células bacterianas, paredes fúngicas, matriz de biofilme e citoplasma fúngico.
  4. Prepare 100 μL de soro fisiológico estéril contendo 0,4% (w/v) de glicose, titulado a pH 7. Prepare uma solução de estoque de C-SNARF-4 (1 mM em sulfoxida de dimetil). Adicione o tinantes a uma concentração final de 30 μM.
    ATENÇÃO: Use luvas de nitrilo ao manusear o tye ratiométrico.
  5. Esvazie um dos poços com um biofilme transmal, deixando um reservatório de 20 μL. Adicione o soro fisiológico estéril contendo glicose e o tye ratiométrico. Coloque a placa de 96 poços no palco do microscópio e comece a fotografar o biofilme.
  6. Adquirir imagens únicas ou pilhas Z em diferentes locais do biofilme. Marque a posição X-Y no software de microscópio para seguir mudanças de pH em determinados campos de visão ao longo do tempo. Em intervalos regulares, tire imagens com o laser desligado para corrigir a compensação do detector.
  7. Repita as etapas 2.4-2.6 para a análise de cada biofilme cultivado em um poço diferente.

3. Calibração do Tye Ratiométrico

NOTA: A calibração do corno e a montagem de uma curva de calibração podem ser realizadas em um dia diferente da imagem pH ratiométrica.

  1. Prepare uma série de 50 mM 2-morpholinoesulfonic acid (MES) tampão titado para pH 4.0-7,8 em etapas de 0,2 pH unidades a 35 °C. Pipette 150 μL de cada solução tampão nos poços de uma placa de 96 poços de fundo óptico para microscopia.
  2. Adicione o tinantes aos poços cheios de tampão da placa de 96 poços a uma concentração final de 30 μM. Deixe equilibrar por 5 min.
  3. Aqueça o estágio do microscópio a 35 °C. Escolha as mesmas configurações de microscópio como para imagens de pH ratiométricas. Coloque a placa de 96 poços no palco do microscópio. Concentre-se na parte inferior dos poços. Adquirir duas imagens (canal verde e vermelho) para todas as soluções tampão, 5 μm acima da parte inferior do poço. Em intervalos regulares, tire imagens com o laser desligado para corrigir a compensação do detector.
  4. Realize o experimento de calibração em triplicado.
  5. Exporte todas as imagens como arquivos TIF. Importe-os em software dedicado de análise de imagem (ou seja, ImageJ20). Subtraia as imagens tiradas com o laser desligado das respectivas imagens das soluções tampão clicando no Processo | Calculadora de Imagem | Subtrair).
    NOTA: Se necessário, corte as imagens para eliminar artefatos nas bordas da imagem realizando seleção retangular usando Imagem | Crop.
  6. Divida as imagens do canal verde através das imagens do canal vermelho e calcule as intensidades médias de fluorescência nas imagens resultantes clicando | Histograma.
  7. A partir dos experimentos triplicados, plote as proporções médias verde/vermelha sem o pH. Use software dedicado para se adequar a uma função aos dados de calibração (ou seja, MyCurveFit).

4. Análise de Imagem Digital

NOTA:A análise de imagem digital pode ser realizada a qualquer momento após a calibração do dine e da imagem de pH ratiométrica.

  1. Armazene as imagens de biofilme do canal verde e vermelho em pastas separadas e renomeie ambas as séries de arquivos com números sequenciais (por exemplo, GREEN_0001). Importe as imagens em um software dedicado de análise de imagens (ou seja, ImageJ). Clique em Analisar | Histograma para determinar a intensidade média de fluorescência nas imagens tiradas com o laser desligado e subtrair o valor das imagens de biofilme clicando Processo | Matemática | Subtrair.
  2. Importe a série de 2 imagens em software dedicado de análise de imagens (ou seja, daime21). Realize uma segmentação baseada em limiares das imagens do canal vermelho (Segmento | Segmentação automática | Limiar personalizado). Coloque o limiar 'baixo' acima da intensidade de fluorescência do citoplasma fúngico e o limiar 'alto' abaixo da intensidade das paredes fúngicas e das bactérias.
    NOTA:Quando os limiares apropriados foram escolhidos, apenas áreas extracelulares são reconhecidas como objetos.
  3. Transfira a camada de objeto da série de imagens segmentada para a série de imagens do canal verde. Para isso, clique em Segmento | Camada de objeto de transferência.
    NOTA: Se o contraste entre áreas extracelulares e citoplasma fúngico for muito fraco nos canais de cores individuais, adicione a série de imagens do canal verde à série do canal vermelho antes da segmentação clicando em Editar | Calculadora de imagem | Adição. Realize a segmentação conforme descrito abaixo de 4.2 e transfira a camada de objeto da série de imagens segmentada para a série de imagens verde e do canal vermelho.
  4. Empregue o editor de objetos para excluir pixels não-objetos na série de imagens do canal vermelho e verde (Visualizer | Editor de objetos | Em todas as imagens | Exclua pixels não-objetos). Agora as imagens de biofilme são limpas de células bacterianas e fúngicas. Exporte a série de imagens processada como arquivos TIF.
  5. Importe ambas as séries de imagem para ImageJ. ImageJ atribui uma intensidade de 0 a todos os pixels não-objetos. Remova esses pixels dividindo a série de imagem vermelha (R1) por si só (Processo | Calculadora de imagem | Imagem 1: R1; Operação: Dividir; Imagem 2: R1) e multiplicando a série de imagens resultante (R2) com a série original de imagem vermelha (Processo | Calculadora de imagem | Imagem 1: R1; Operação: Multiplique; Imagem 2: R2). Uma terceira série de imagens (R3) é criada, idêntica à R1, exceto pelo fato de que a NaN é atribuída a todos os pixels com uma intensidade de 0 no R1. Prossiga da mesma forma com a série de imagem verde.
  6. Use o filtro 'Mean' (Processo | Filtros | Média | Raio | 1 pixel) na série de imagens do canal vermelho e verde para compensar o ruído do detector. Divida a série de imagens do canal verde pela série de imagens do canal vermelho (Processo | Calculadora de imagem | Imagem 1: G3; Operação: Dividir; Imagem 2: R3). A série de imagens resultante (G3/R3) mostra a relação verde/vermelho para todos os pixels de objeto.
  7. Calcule a proporção média para cada imagem (Analisar | Histograma). Aplicar coloração falsa para melhor representação visual das proporções nas imagens (Imagem | Mesas de Mirantes). Converta as proporções verde/vermelha em valores pH empregando a função instalada abaixo de 3,6.

Resultados

Após 24h e 48 h, biofilmes robustos de cross-kingdom se desenvolveram nas placas de poço. Os albicanos mostraram diferentes graus de crescimento de filamentous, e os mutanos formaram aglomerados densos de até 35 μm de altura. Células únicas e correntes de s. mutanos agrupados em torno de hífofas fúngicas, e grandes espaços intercelulares indicaram a presença de uma matriz volumosa (Figura S1).

A calibração do tye ratiométrico produz uma ...

Discussão

Diferentes protocolos para o cultivo de biofilmes transcionais envolvendo C. albicans e Streptococcus spp. foram descritos anteriormente9,22,23,24,25. No entanto, a configuração atual se concentra em condições simples de crescimento, um cronograma compatível com dias de trabalho regulares, uma composição de espécies equilibra...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Anette Aakjær Thomsen e Javier E. Garcia são reconhecidos por excelente suporte técnico. Os autores agradecem a Rubens Spin-Neto por discussões frutíferas sobre análise de imagens.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Blood agar platesStatens Serum Institut677
Brain heart infusionOxoidCM1135
Brain heart infusion + 5 % sucroseBDH laboratory supplies10274
Candida albicansNational Collection of Pathogenic FungiNCPF 3179
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270
daime: digital image analysis in microbial ecologyUniversität WienN/AFreeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxideLife TechnologiesD12345
Fetal bovine serumGibco Life technologies10270
GS-6R refrigerated centrifugeBeckmanN/A
ImageJNational Institutes of HealthN/AFreeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
JavaOracleN/AFreeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well BlackIbidi89626
MyCurveFitMyAssays Ltd.N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) bufferBioworld700728
PHM210 pH-meterRadiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objectiveZeissN/ANA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic AcidLife TechnologiesS23920
Sterile physiological salineVWR6404
Streptococcus mutansDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenDSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PCVWRN/A
XL IncubatorPeCONN/A
Zeiss LSM 510 METAZeissN/A

Referências

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