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요약

이 프로토콜은 칸디다 알비칸스와 연쇄상 구균 뮤탄으로 구성된 크로스 킹킹 바이오필름의 재배를 설명하고 이러한 생물막 내부의 세포외 pH 모니터링을 위한 공초점 현미경 기반 방법을 제시한다.

초록

곰팡이 와 세균성 세포로 구성된 크로스 킹덤 생물막은 엔도돈증 감염, 치주염, 점막 감염 및 특히 어린 시절 충치와 같은 다양한 구강 질환에 관여합니다. 이러한 모든 조건에서, 생물막 매트릭스내의 pH는 미생물-숙주 상호작용 및 따라서 질병 진행에 영향을 미친다. 본 프로토콜은 칸디다 알비칸스 및 연쇄상 구균 뮤탄을 포함하는 크로스 킹덤 생물막 내부의 pH 역학을 모니터링하는 공초점 현미경 기반 방법을 기술한다. pH 의존적 이중 방출 스펙트럼 및 비메트릭 프로브 C-SNARF-4의 염색 특성은 생물막의 세포외 영역에서 pH의 하락을 결정하기 위해 이용된다. 프로브와 pH 비율 측정을 사용하려면 이미징 매개 변수의 세심한 선택, 염료의 철저한 교정, 이미지 데이터의 신중한 임계값 기반 사후 처리가 필요합니다. 올바르게 사용될 때, 기술은 생물막의 다른 지역에 있는 세포외 pH의 급속한 평가를 허용하고 따라서 시간 지남에 따라 수평 및 수직 pH 구배 둘 다의 감시를 허용합니다. 공초점 현미경 검사법의 사용은 Z 프로파일링을 75 μm 이하의 얇은 바이오필름으로 제한하지만, pH 비율 측정법의 사용은 왕국 간 생물막에서 중요한 독성 계수의 비침습적 연구에 이상적입니다.

서문

곰팡이와 세균성 종을 모두 포함하는 크로스 킹덤 생물막은 구강내 여러 병리학 적 조건에 관여합니다. 칸디다 spp. 빈번 하 게 에서 분리 된 endodontic 감염1 그리고 치 주 변 병 변에서2,3. 점막 감염에서, 기염 단에서 연쇄상 구균 종은 시험관 내 및 murine 모형4,5,6,7둘 다에 있는 곰팡이 생물막 대형, 조직 침략 및 보급을 강화하기 위하여 보였습니다. 가장 흥미롭게도, 칸디다 종의 구강 마차는어린이8에서 우식증의 보급과 관련이 있는 것으로 입증되었습니다. 설치류 모델에서 도시된 바와 같이, 연쇄상 구균 뮤탄스와 칸디다스 알비칸스 사이의 공생 관계는 세포외 다당류의 생산을 증가시키고 더 두껍고 더 많은 카리오제닉 생물막의 형성을 이끈다,10.

위에서 언급한 모든 조건에서, 특히, 생물막 pH는 질병 진행에 매우 중요하며, 산성미세환경(11)의 개발을 위한 생물막 매트릭스의 탁월한 역할은 크로스 킹덤 생물막 내부의 pH 변화를 연구할 수 있는 방법론을 요구한다. 세균12 및 곰팡이13 생물막 내부의 pH를 모니터링하는 간단하고 정확한 공초점 현미경 기반 접근법이 개발되었습니다. 비측정 염료 C-SNARF-4 및 임계값 기반 이미지 후처리를 통해, 세포외 pH는생물막(14)의모든 3차원에서 실시간으로 결정될 수 있다. 생물막에서 현미경 기반 pH 모니터링을 위한 다른 공표된 기술에 비해, C-SNARF-4를 사용한 pH 비측정법은 기준염료(15) 또는 2광자인용(16)의사용을 포함하는 입자 또는 화합물의 합성을 필요로 하지 않기 때문에 간단하고 저렴하다. 단 하나의 염료를 사용하면 프로브 구획화, 형광 피,선택적 표백16,17,18의 문제를 방지하면서 세포 내 pH와 세포 외 pH 간의 신뢰할 수있는 분화를 허용합니다. 마지막으로, 염료를 가진 배양은 실험실과 그(것)들 성장한 생물막에서 둘 다 공부하는 것을 허용하는 생물막 성장 후에 행해줍니다.

본 연구의 목적은 pH 비측정법의 사용을 확장하고 왕국 간 생물막에서 pH 변화를 연구하는 방법을 제공하는 것이다. 개념의 증거로서, 이 방법은 포도당에 노출된 S. 뮤탄및 C. 알비칸스로 구성된 이중 종 생물막에서 pH를 모니터링하는 데 사용된다.

프로토콜

타액 수집프로토콜은 오르후스 카운티 윤리위원회(M-20100032)에 의해 검토및 승인되었습니다.

1. 크로스 킹덤 바이오필름 재배

  1. S. 뮤탄스 DSM 20523 및 C. 알비칸스 NCPF 3179를 에어로빅 조건하에서 37°C에서 혈액 한천 플레이트에 성장시다.
  2. 각 유기체의 단일 식민지를 뇌 심장 주입 (BHI)의 5 mL로 채워진 시험관으로 옮니다. 37 °C에서 에어로빅 조건하에서 18 시간 동안 자랍니다.
  3. 1,200 x g에서 5 분 동안 하룻밤 배양. 상류를 버리고 생리식염수로 세포를 다시 중단하고 C. albicans (~ 107 세포 / mL) 및 S. 뮤탄 (~108 세포 / mL)에 대해 OD550 nm을 0.5로 조정하십시오. S. 뮤탄스 현탁액을 멸균 생리식염수(~10 7세포/mL)로 희석합니다.
  4. 피펫 50 μL의 멸균 침 액은, de Jong et al.19의방법에 따라 제조되어, 현미경 검사법용 광학 바닥 96-웰 플레이트의 우물내로. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 멸균 생리식염수 100 μL로 우물을 3배 씻으소서. 우물을 비웁습니다.
  5. 각 우물에 100 μL의 C. 알비칸스 서스펜션을 추가하십시오. 37°C에서 90분 동안 배양합니다.
    참고: 세척 중에 우물을 완전히 비우지 마십시오. 과도한 전단력을 피하기 위해 20 μL의 저장소를 둡니다.
  6. 열불활성화된 태아 소 혈청 100 μL(56°C에서 30분 동안 불활성화)을 각 우물에 넣습니다. 37°C에서 2시간 동안 배양하여 멸균 생리식염수로 3x 세척합니다. 20 μL의 저수지를 떠나, 우물을 비웁니다.
  7. 100 μL의 S. 뮤탄스 서스펜션(1.3단계에서 제조)을 각 웰에 첨가합니다. 5% 자당을 함유한 BHI 150 μL을 첨가합니다. 37°C에서 24시간 이상 배양합니다. 오래된 생물막을 재배할 때, 매일 배지를 신선한 BHI로 바꾸라. 크로스 킹덤 생물막 성장 기의 끝에서 멸균 생리식염수로 5배를 씻으십시오.

2. 비율 메트릭 pH 이미징

참고: 비율 측정 pH 화상 진찰은 생물막 성장이 완료된 후에 즉시 수행될 필요가 있습니다.

  1. 비메트릭 pH 이미징의 경우 63x 오일 또는 수지 침지 렌즈, 543nm 레이저 라인 및 스펙트럼 이미징 시스템(즉, META 검출기)을 사용하여 겹치는 형광 신호의 이미징을 허용합니다. 인큐베이터를 사용하여 현미경 단계를 35°C로 데우다.
  2. 검출기를 설정하여 576-608 nm에서 녹색 형광을 검출하고 629-661 nm에서 적색 형광을 동시에 감지합니다. 적절한 레이저 파워를 선택하고 과다 노출과 노출을 피하기 위해 게인을 선택하십시오.
    참고: 이미지 노출은 잘못된 색상이 있는 팔레트 이미지에서 가장 잘 볼 수 있습니다.
  3. 핀홀 크기를 1 Airy Unit 또는 ~0.8 μm의 광학 슬라이스로 설정합니다. 이미지 크기를 512 x 512 픽셀로 설정하고 스캔 속도를 2로 설정합니다. 평균 옵션을 사용하여 선 평균을 2로 선택합니다.
    참고 : 일련의 실험의 시작 부분에서 선택한 현미경 설정이 박테리아 세포, 곰팡이 세포벽, 생물 막 매트릭스 및 곰팡이 세포질 사이의 명확한 대비를 제공하는지 확인하십시오.
  4. pH 7에 적정된 포도당 0.4%(w/v)를 함유한 멸균 생리식염수 100 μL을 준비합니다. C-SNARF-4 (디메틸 설폭사이드의 1 mMM)의 재고 용액을 준비하십시오. 염료를 30 μM의 최종 농도에 첨가합니다.
    주의: 비율측정 염료를 취급할 때 니트릴 장갑을 착용하십시오.
  5. 20 μL의 저장소를 떠나, 크로스 킹덤 생물 막 우물 중 하나를 비우고, 포도당과 비측정 염료를 포함하는 멸균 식염수를 추가합니다. 현미경 단계에 96 웰 플레이트를 놓고 생물막을 이미징시작하십시오.
  6. 생물막의 다른 위치에서 단일 이미지 또는 Z 스택을 획득합니다. 현미경 소프트웨어에서 X-Y 위치를 표시하여 시간이 지남에 따라 특정 시야에서 pH 변화를 따릅니다. 정기적으로 레이저를 끄고 이미지를 가져가 검출기 오프셋을 보정합니다.
  7. 다른 우물에서 자란 각 생물막의 분석을 위해 2.4-2.6 단계를 반복합니다.

3. 비율 측정 염료의 교정

참고: 염료의 교정 및 교정 곡선의 피팅은 비율메트릭 pH 이미징과는 다른 날에 수행될 수 있습니다.

  1. 35°C에서 0.2 pH 단위의 단계에서 pH 4.0-7.8로 적정된 50 mM 2-모르폴리노에탄설포닉산(MES) 완충제를 준비한다. 각 완충액의 피펫 150 μL을 현미경 검사법용 광학 바닥 96웰 플레이트의 웰에 넣습니다.
  2. 96웰 플레이트의 완충충전 웰에 염료를 30 μM의 최종 농도에 첨가한다. 5 분 동안 균형을 보자.
  3. 현미경 단계를 35 °C로 데우다. 비율메트릭 pH 이미징과 동일한 현미경 설정을 선택합니다. 현미경 단계에 96 웰 플레이트를 놓습니다. 우물의 바닥에 초점을 맞춥니다. 모든 버퍼 솔루션에 대해 두 개의 이미지(녹색 및 빨간색 채널)를 획득합니다(웰 하단 의 5 μm). 정기적으로 레이저를 끄고 이미지를 가져가 검출기 오프셋을 보정합니다.
  4. 교정 실험을 삼중으로 수행합니다.
  5. 모든 이미지를 TIF 파일로 내보냅니다. 전용 이미지 분석 소프트웨어(즉, ImageJ20)로가져옵니다. 프로세스를 클릭하여 버퍼 솔루션의 각 이미지에서 레이저로 촬영한 이미지를 뺍니다. 이미지 계산기 | )를 뺍니다.
    참고: 필요한 경우 이미지를 사용하여 직사각형 선택을 수행하여 이미지 테두리에서 아티팩트를 제거하기 위해 이미지를 자르세요 | 자르기.
  6. 빨간색 채널 이미지를 통해 녹색 채널 이미지를 분할하고 분석 |를 클릭하여 결과 이미지의 평균 형광 강도를 계산합니다. 히스토그램.
  7. 삼중항 실험에서 pH에 대한 평균 녹색/빨간색 비율을 플로팅합니다. 전용 소프트웨어를 사용하여 교정 데이터(예: MyCurveFit)에 함수를 맞춥니다.

4. 디지털 이미지 분석

참고: 디지털 이미지 분석은 염료 및 비메트릭 pH 이미징의 교정 후 언제든지 수행할 수 있습니다.

  1. 녹색 및 빨간색 채널 바이오필름 이미지를 별도의 폴더에 저장하고 순차적인 숫자(예: GREEN_0001)가 있는 두 파일 의 이름을 바꿉니다. 이미지를 전용 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ)로 가져옵니다. 분석 | 클릭 히스토그램은 레이저를 끄고 촬영한 이미지의 평균 형광 강도를 확인하고 프로세스를 클릭하여 생물막 이미지에서 값을 뺍니다 | 수학 | 을 뺍니다.
  2. 2개의 이미지 계열을 전용 이미지 분석 소프트웨어(즉, 다이메21)로가져옵니다. 빨간색 채널 이미지의 임계값 기반 세분화 수행(세그먼트 | 자동 세분화 | 사용자 정의 임계값). 곰팡이 세포질의 형광 강도 와 곰팡이 세포벽 및 박테리아의 강도 이하의 '높은' 임계값을 '낮음' 임계값이상으로 설정합니다.
    참고: 적절한 임계값을 선택한 경우 세포외 영역만 개체로 인식됩니다.
  3. 분할된 이미지 계열의 오브젝트 레이어를 녹색 채널 이미지 계열로 전송합니다. 이렇게 하려면 세그먼트를 클릭합니다 | 개체 레이어를 전송합니다.
    참고: 셀라탈 영역과 곰팡이 세포질 간의 대비가 개별 색상 채널에서 너무 약한 경우 편집을 클릭하여 세분화하기 전에 녹색 채널 이미지 시리즈를 빨간색 채널 계열에 추가 | 이미지 계산기 | 추가. 4.2 아래에 설명된 대로 세분화를 수행하고 세그먼트화된 이미지 계열의 오브젝트 레이어를 녹색 및 빨간색 채널 이미지 시리즈로 전송합니다.
  4. 오브젝트 편집기를 사용하여 빨간색 및 녹색 채널 이미지시리즈(Visualizer | 개체 편집기 | 모든 이미지에서 | 개체가 아닌 픽셀을 삭제합니다). 이제 생물막 이미지는 세균세포와 곰팡이 세포 모두에서 지워집니다. 처리된 이미지 계열을 TIF 파일로 내보냅니다.
  5. 두 이미지 계열을 ImageJ로 가져옵니다. ImageJ는 오브젝트가 아닌 모든 픽셀에 0의 강도를 할당합니다. 빨간색 이미지 시리즈(R1)를 자체적으로 나누어 해당 픽셀을 제거합니다(프로세스 | 이미지 계산기 | 이미지 1: R1; 작업: 분할; 이미지 2: R1)결과 이미지 시리즈(R2)에 원본 빨간색 이미지시리즈(프로세스 | 이미지 계산기 | 이미지 1: R1; 작업: 곱하기; 이미지 2: R2). R1에서 강도가 0인 모든 픽셀에 NaN이 할당된다는 점을 제외하면 세 번째 이미지 계열(R3)이 R1과 동일하게 작성됩니다. 녹색 이미지 시리즈와 동일한 방식으로 진행합니다.
  6. '평균' 필터 사용(프로세스 | 필터 | 평균 | 반경 | 1 픽셀) 적색 및 녹색 채널 이미지 시리즈에서 감지기 노이즈를 보정합니다. 녹색 채널 이미지 시리즈를 빨간색 채널 이미지 시리즈로 나눕니다(프로세스 | 이미지 계산기 | 이미지 1: G3; 작업: 분할; 이미지 2: R3). 결과 이미지 계열(G3/R3)은 모든 오브젝트 픽셀에 대한 녹색/빨간색 비율을 표시합니다.
  7. 각 이미지의 평균 비율 계산(분석 | 히스토그램)을참조하십시오. 이미지의 비율의 더 나은 시각적 표현을 위해 거짓 색칠을 적용(이미지 | 조회 테이블). 녹색/빨간색 비율을 3.6 아래에 장착된 함수를 사용하여 pH 값으로 변환합니다.

결과

24 시간 및 48 시간 후, 우물 플레이트에서 개발 된 견고한 크로스 킹덤 생물막. C. albicans는 필라멘트 성장의 다양한 정도를 보여주었고, S. 뮤탄은 높이가 최대 35 μm의 조밀 한 클러스터를 형성했습니다. 단일 세포 및 S. 뮤탄의 사슬은 곰팡이 하이페 주위에 그룹화되고, 큰 세포 간 공간은 볼륨감 있는 매트릭스의 존재를 나타냈다(도S1).

비대칭 ?...

토론

C. 알비칸스 및 연쇄상 구균 spp를 포함하는 크로스 킹클크로스 킹에 대한 상이한 프로토콜은 이전에9,22,23,24,25를기술되었다. 그러나, 현재설정은 단순 성장 조건, 정규 근무일과 호환되는 시간 일정, 균형 잡힌 종 조성 및 방대한 생물막 매트릭스 의 개발?...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

아네트 아크예르 톰슨과 하비에르 E. 가르시아는 뛰어난 기술 지원을 인정받고 있습니다. 저자는 이미지 분석에 대한 유익한 토론에 대한 루벤스 스핀 네토 감사.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Blood agar platesStatens Serum Institut677
Brain heart infusionOxoidCM1135
Brain heart infusion + 5 % sucroseBDH laboratory supplies10274
Candida albicansNational Collection of Pathogenic FungiNCPF 3179
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270
daime: digital image analysis in microbial ecologyUniversität WienN/AFreeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxideLife TechnologiesD12345
Fetal bovine serumGibco Life technologies10270
GS-6R refrigerated centrifugeBeckmanN/A
ImageJNational Institutes of HealthN/AFreeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
JavaOracleN/AFreeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well BlackIbidi89626
MyCurveFitMyAssays Ltd.N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) bufferBioworld700728
PHM210 pH-meterRadiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objectiveZeissN/ANA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic AcidLife TechnologiesS23920
Sterile physiological salineVWR6404
Streptococcus mutansDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenDSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PCVWRN/A
XL IncubatorPeCONN/A
Zeiss LSM 510 METAZeissN/A

참고문헌

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