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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo descrive la coltivazione di biofilm tra regni costituiti da albicani Candida e Streptococcus mutans e presenta un metodo confocale basato sulla microscopia per il monitoraggio del pH extracellulare all'interno di questi biofilm.

Abstract

I biofilm tra regni composti da cellule fungine e batteriche sono coinvolti in una varietà di malattie orali, come infezioni endodontiche, parodontite, infezioni mucosali e, in particolare, carie della prima infanzia. In tutte queste condizioni, il pH nella matrice del biofilm influisce sulle interazioni microbo-ospite e quindi sulla progressione della malattia. Il presente protocollo descrive un metodo confocale basato sulla microscopia per monitorare le dinamiche del pH all'interno di biofilm tra regni incrociati che comprendono albicani Candida e mutans Streptococcus. Lo spettro a doppia emissione dipendente dal pH e le proprietà di colorazione della sonda ratiometrica C-SNARF-4 sono sfruttati per determinare le gocce di pH nelle aree extracellulari dei biofilm. L'uso di pH ratiometry con la sonda richiede una scelta meticolosa di parametri di imaging, una calibrazione completa del colorante e un'attenta post-elaborazione basata sulla soglia dei dati dell'immagine. Se utilizzata correttamente, la tecnica consente la valutazione rapida del pH extracellulare in diverse aree di un biofilm e quindi il monitoraggio dei gradienti di pH orizzontali e verticali nel tempo. Mentre l'uso di limiti di microscopia confocale per biofilm sottili di 75 m o meno, l'uso di pH ratiometry è ideale per lo studio non invasivo di un importante fattore di virulenza nei biofilm cross-kingdom.

Introduzione

I biofilm tra regni incrociati che comprendono specie sia fungine che batteriche sono coinvolti in diverse condizioni patologiche nella cavità orale. Candida spp. sono stati spesso isolati da infezioni endodontiche1 e da lesioni parodontali2,3. Nelle infezioni mucosali, specie streptococcal del gruppo mitis hanno dimostrato di migliorare la formazione di biofilm fungini, l'invasione dei tessuti e la diffusione in entrambi i modelli in vitro e murini4,5,6,7. La cosa più interessante, il trasporto orale di Candida spp. è stato dimostrato di essere associato con la prevalenza di carie nei bambini8. Come mostrato nei modelli di roditori, una relazione simbiotica tra Streptococcus mutans e Candidas albicans aumenta la produzione di polisaccharides extracellulari e porta alla formazione di biofilm biogenici più spessi e cariogenici9,10.

In tutte le condizioni di cui sopra, in particolare le carie della prima infanzia, il pH del biofilm è importante per la progressione della malattia e il ruolo eminente della matrice dei biofilm per lo sviluppo di microambienti acidogenici11 richiede metodologie che consentano di studiare i cambiamenti del pH all'interno di biofilm tra regni incrociati. Sono stati sviluppati approcci confocali a base di microscopia confocale semplici e accurati per monitorare il pH all'interno di biofilm batterici12 e13 fungini. Con il colorante ratiometrico C-SNARF-4 e la post-elaborazione dell'immagine basata sulla soglia, il pH extracellulare può essere determinato in tempo reale in tutte e tre le dimensioni di un biofilm14. Rispetto ad altre tecniche pubblicate per il monitoraggio del pH basato sulla microscopia nei biofilm, la pH ratiometry con C-SNARF-4 è semplice ed economica, perché non richiede la sintesi di particelle o composti che includono un colorante di riferimento15 o l'uso di eccitazione a due fotoni16. L'uso di un solo colorante previene problemi con la compartimentazione della sonda, il sanguinamento fluorescente e lo sbiancamento selettivo16,17,18 pur consentendo una differenziazione affidabile tra pH intra ed extracellulare. Infine, l'incubazione con il colorante viene eseguita dopo la crescita del biofilm, che consente di studiare sia i biofilm di laboratorio che quelli coltivati in situ.

L'obiettivo del presente lavoro è quello di estendere l'uso della pH ratiometry e fornire un metodo per studiare i cambiamenti di pH nei biofilm tra regni. Come prova di concetto, il metodo viene utilizzato per monitorare il pH in biofilm a doppia specie costituiti da S. mutans e C. albicans esposti al glucosio.

Protocollo

Il protocollo per la raccolta della saliva è stato rivisto e approvato dal Comitato Etico della contea di Aarhus (M-20100032).

1. Coltivazione di Biofilm trasversali

  1. Crescere S. mutans DSM 20523 e C. albicans NCPF 3179 su piastre di agar di sangue a 37 gradi centigradi in condizioni aerobiche.
  2. Trasferire colonie singole di ogni organismo a provette piene di 5 mL di infusione del cuore cerebrale (BHI). Coltivare per 18 h in condizioni aerobiche a 37 gradi centigradi.
  3. Centrifugare le colture notturne a 1.200 x g per 5 min. Scartare il supernatante, sospendere nuovamente le cellule in salina fisiologica e regolare l'OD550 nm a 0,5 per C. albicans (107 cellule /mL) e S. mutans (108 celle /mL). Diluire la sospensione S. mutans 1:10 con sterile salina fisiologica (107 cellule / mL).
  4. Pipette 50 -L di soluzione salivare sterile, preparata secondo il metodo di de Jong etal. Incubare per 30 min a 37 . Lavare i pozzi 3x con 100 gradi di salina fisiologica sterile. Svuotate i pozzi.
  5. Aggiungete 100 litri di c. albicans in ogni pozzo. Incubare a 37 gradi centigradi per 90 min. Lavare 3x con salina fisiologica sterile.
    NOTA:Non svuotare completamente i pozzi durante il lavaggio. Lasciare un serbatoio di 20 l per evitare eccessive forze di taglio.
  6. Aggiungete un'ol di siero bovino fetale inattivato dal calore (inattivato a 56 gradi centigradi per 30 minuti) a ciascuno di essi. Incubare a 37 gradi centigradi per 2 h. Lavare 3x con salina fisiologica sterile. Svuotare i pozze, lasciando un serbatoio di 20 gradi l.
  7. Aggiungere 100 litri di sospensione S. mutans (preparata al punto 1.3) ad ogni pozzo. Aggiungete 150 l di BHI contenenti il 5% di saccarosio. Incubare a 37 gradi centigradi per 24 ore o più. Quando si coltivano biofilm più vecchi, cambiare il mezzo quotidiano in BHI fresco. Alla fine della fase di crescita del biofilm tra regni, lavare 5 volte con salina fisiologica sterile.

2. Imaging pH ratiometrico

NOTA:L'imaging pH ratiometrico deve essere eseguito immediatamente dopo che la crescita del biofilm è stata completata.

  1. Per l'imaging pH ratiometrico, utilizzare un microscopio a scansione laser confocale invertito con una lente ad immersione ad olio o acqua 63x, una linea laser da 543 nm e un sistema di imaging spettrale (ad esempio, un rilevatore META) per consentire l'imaging di segnali fluorescenti sovrapposti. Utilizzare un'incubatrice per riscaldare lo stadio del microscopio a 35 gradi centigradi.
  2. Impostare il rivelatore per garantire il rilevamento della fluorescenza verde da 576,608 nm e il rilevamento simultaneo della fluorescenza rossa da 629-661 nm. Scegliere una potenza laser appropriata e guadagno per evitare eccesso e sottoesposizione.
    NOTA: l'esposizione delle immagini è meglio visibile nelle immagini della tavolozza con falsi coloranti.
  3. Impostare la dimensione del foro stenopeico su 1 Unità Airy o su una fetta ottica di 0,8 m. Impostare le dimensioni dell'immagine su 512 x 512 pixel e la velocità di scansione su 2. Scegliere una media di linea di 2, utilizzando l'opzione media.
    NOTA:All'inizio di una serie di esperimenti, verificare che le impostazioni del microscopio scelte forniscano un chiaro contrasto tra cellule batteriche, pareti cellulari fungine, matrice di biofilm e citoplasma fungino.
  4. Preparare 100 l di salina fisiologica sterile contenente lo 0,4% (w/v) di glucosio, titolato a pH 7. Preparare una soluzione di stock di C-SNARF-4 (1 mM in solfuro dimetil). Aggiungere il tinrito ad una concentrazione finale di 30 M.
    AVVISO: Indossare guanti nitrile durante la manipolazione del tintura ratiometrica.
  5. Svuotare uno dei pozzi con un biofilm tra regno, lasciando un serbatoio di 20 .L. Aggiungere la salina sterile contenente glucosio e il coloranti ratiometrico. Posizionare la piastra da 96 pozzi sullo stadio del microscopio e iniziare a creare immagini del biofilm.
  6. Acquisire singole immagini o ze-stack in diverse posizioni del biofilm. Contrassegnare la posizione X-Y nel software del microscopio per seguire i cambiamenti di pH in particolari campi visivi nel tempo. A intervalli regolari, scattare immagini con il laser spento per correggere l'offset del rilevatore.
  7. Ripetere i passaggi da 2,4 a 2,6 per l'analisi di ogni biofilm coltivato in un pozzo diverso.

3. Calibrazione del dye Ratiometric

NOTA: la calibrazione del tintura e il raccordo di una curva di calibrazione possono essere eseguite in un giorno diverso rispetto all'imaging del pH ratiometrico.

  1. Preparare una serie di 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) tonfolato a pH 4.0-7.8 in gradini di 0,2 pH unità a 35 . Pipette 150 L di ogni soluzione tampone nei pozze di una piastra da 96 pozzetto per la microscopia con fondo ottico.
  2. Aggiungere il coloranti nei pozzetto riempiti tampone della piastra da 96 pozzetto ad una concentrazione finale di 30 M. Lasciate espoli per 5 min.
  3. Riscaldare lo stadio del microscopio a 35 gradi centigradi. Scegliere le stesse impostazioni del microscopio per l'imaging pH ratiometrico. Posizionare la piastra da 96 pozzi sullo stadio del microscopio. Concentrati sul fondo dei pozzi. Acquisire due immagini (canale verde e rosso) per tutte le soluzioni buffer, 5 m sopra la parte inferiore del pozzo. A intervalli regolari, scattare immagini con il laser spento per correggere l'offset del rilevatore.
  4. Eseguire l'esperimento di calibrazione in triplice copia.
  5. Esportare tutte le immagini come file TIF. Importarli in un software di analisi delle immagini dedicato (ad esempio, ImageJ20). Sottrarre le immagini scattate con il laser spento dalle rispettive immagini delle soluzioni buffer facendo clic su Processo . Calcolatore di immagini Sottrarre).
    NOTA: se necessario, ritagliare le immagini per eliminare gli artefatti ai bordi dell'immagine eseguendo la selezione rettangolare utilizzando Immagine . Ritagliare.
  6. Dividere le immagini del canale verde attraverso le immagini del canale rosso e calcolare le intensità medie di fluorescenza nelle immagini risultanti facendo clic su Analizza . Istogramma.
  7. Dagli esperimenti triplicati, tracciare i rapporti medio verde/rosso rispetto al pH. Utilizzare un software dedicato per adattare una funzione ai dati di calibrazione (ad esempio, MyCurveFit).

4. Analisi digitale delle immagini

NOTA:L'analisi digitale delle immagini può essere eseguita in qualsiasi momento dopo la calibrazione del tinrio e l'imaging pH ratiometrico.

  1. Memorizzare le immagini del biofilm del canale verde e rosso in cartelle separate e rinominare entrambe le serie di file con numeri sequenziali (ad esempio, GREEN_0001). Importare le immagini in un software di analisi delle immagini dedicato (ad esempio, ImageJ). Fare clic su Analizza . Istogramma per determinare l'intensità media di fluorescenza nelle immagini scattate con il laser spento e sottrarre il valore dalle immagini del biofilm facendo clic su Processo . Proprietà Math . Sottrarre.
  2. Importare la serie di 2 immagini in un software di analisi delle immagini dedicato (ad esempio, daime21). Eseguire una segmentazione basata sulla soglia delle immagini dei canali rossi (Segmento Segmentazione automatica Soglia personalizzata). Impostare la soglia "bassa" al di sopra dell'intensità di fluorescenza del citoplasma fungino e la soglia "alta" al di sotto dell'intensità delle pareti cellulari fungine e dei batteri.
    NOTA:Quando sono state scelte le soglie appropriate, solo le aree extracellulari vengono riconosciute come oggetti.
  3. Trasferire il livello oggetto della serie di immagini segmentate alla serie di immagini del canale verde. A tale scopo, fare clic su Segmento . Livello oggetto di trasferimento.
    NOTA: se il contrasto tra aree extracellulari e citoplasma fungino è troppo debole nei singoli canali di colore, aggiungere la serie di immagini del canale verde alla serie di canali rossi prima della segmentazione facendo clic su Modifica . Calcolatore di immagini Addizione. Eseguite la segmentazione come descritto sotto 4.2 e trasferite il livello dell'oggetto della serie di immagini segmentate sia alla serie di immagini del canale verde che a quella rossa.
  4. Utilizza l'editor di oggetti per eliminare i pixel non oggetto nella serie di immagini del canale rosso e verde(Visualizer Editor di oggetti : In tutte le immagini Eliminare i pixel non oggetto). Ora le immagini del biofilm vengono cancellate sia dalle cellule batteriche che da quella fungine. Esportare la serie di immagini elaborate come file TIF.
  5. Importare entrambe le serie di immagini in ImageJ. ImageJ assegna un'intensità pari a 0 a tutti i pixel non oggetto. Rimuovere i pixel dividendo la serie di immagini rosse (R1) per se stessa (Processo Calcolatore di immagini Immagine 1: R1; Operazione: Dividere; Immagine 2: R1) e moltiplicando la serie di immagini risultante (R2) con la serie di immagini rosse originale (Processo Calcolatore di immagini Immagine 1: R1; Operazione: Moltiplicare; Immagine 2: R2). Viene creata una terza serie di immagini (R3), identica a R1, ad eccezione del fatto che NaN viene assegnato a tutti i pixel con un'intensità di 0 in R1. Procedere allo stesso modo con la serie di immagini verdi.
  6. Utilizzare il filtro 'Mean'(Process Proprietà Filters . Proprietà Mean (Media) . Proprietà Radius . 1 pixel) sulla serie di immagini del canale rosso e verde per compensare il rumore del rivelatore. Dividere la serie di immagini del canale verde per la serie di immagini del canale rosso (Processo Calcolatore di immagini Immagine 1: G3; Operazione: Dividere; Immagine 2: R3). La serie di immagini risultanti (G3/R3) mostra il rapporto verde/rosso per tutti i pixel dell'oggetto.
  7. Calcolare il rapporto medio per ogni immagine (Analyze Istogramma). Applicare una colorazione falsa per una migliore rappresentazione visiva dei rapporti nelle immagini(Immagine Tabelle di ricerca). Convertire i rapporti verde/rosso in valori di pH utilizzando la funzione montata sotto 3,6.

Risultati

Dopo 24 h e 48 h, robusti biofilm tra regni si sono sviluppati nelle piastre del pozzo. C. albicans ha mostrato vari gradi di crescita filamentosa, e S. mutans formavano ammassi densi fino a 35 m di altezza. Singole cellule e catene di S. mutans raggruppate intorno alle iphae fungine, e ampi spazi intercellulari indicavano la presenza di una matrice voluminosa (Figura S1).

La calibrazione del tintura ratiometrica produce una curva sigmoidale asimmetr...

Discussione

Diversi protocolli per la coltivazione di biofilm tra regni che coinvolgono C. albicans e Streptococcus spp. sono stati descritti in precedenza9,22,23,24,25. Tuttavia, l'attuale configurazione si concentra su condizioni di crescita semplici, un calendario compatibile con i normali giorni lavorativi, una composizione equilibrata delle...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Anette Aakjar Thomsen e Javier E. Garcia sono riconosciute per un eccellente supporto tecnico. Gli autori ringraziano Rubens Spin-Neto per fruttuose discussioni sull'analisi delle immagini.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Blood agar platesStatens Serum Institut677
Brain heart infusionOxoidCM1135
Brain heart infusion + 5 % sucroseBDH laboratory supplies10274
Candida albicansNational Collection of Pathogenic FungiNCPF 3179
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270
daime: digital image analysis in microbial ecologyUniversität WienN/AFreeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxideLife TechnologiesD12345
Fetal bovine serumGibco Life technologies10270
GS-6R refrigerated centrifugeBeckmanN/A
ImageJNational Institutes of HealthN/AFreeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
JavaOracleN/AFreeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well BlackIbidi89626
MyCurveFitMyAssays Ltd.N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) bufferBioworld700728
PHM210 pH-meterRadiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objectiveZeissN/ANA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic AcidLife TechnologiesS23920
Sterile physiological salineVWR6404
Streptococcus mutansDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenDSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PCVWRN/A
XL IncubatorPeCONN/A
Zeiss LSM 510 METAZeissN/A

Riferimenti

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