Ciclos de recuperação da velocidade muscular para examinar propriedades da membrana muscular

Resumo

Apresentado aqui está um protocolo para o registro de ciclos de recuperação da velocidade muscular (MVRCs), um novo método de examinar propriedades da membrana muscular. Os MVRCs permitem avaliar ao vivo o potencial da membrana muscular e alterações na função do canal de íons musculares em relação à patologia, e permite a demonstração de despolarização muscular nos músculos neurogênicos.

Resumo

Embora os estudos convencionais de condução nervosa (NCS) e eletromiografia (EMG) sejam adequados para o diagnóstico de distúrbios neuromusculares, eles fornecem informações limitadas sobre propriedades da membrana de fibra muscular e mecanismos de doenças subjacentes. Os ciclos de recuperação da velocidade muscular (MVRCs) ilustram como a velocidade de um potencial de ação muscular depende do tempo após um potencial de ação anterior. Os MVRCs estão intimamente relacionados com mudanças no potencial de membrana que seguem um potencial de ação, fornecendo assim informações sobre propriedades da membrana de fibra muscular. Os MVRCs podem ser gravados de forma rápida e fácil por estimulação direta e gravação de pacotes de várias fibras in vivo. Os MVRCs têm sido úteis na compreensão dos mecanismos da doença em vários distúrbios neuromusculares. Estudos em pacientes com canalopatias demonstraram os diferentes efeitos de mutações específicas do canal de íons sobre a excitabilidade muscular. Os MVRCs já foram testados anteriormente em pacientes com músculos neurogênicos. Neste estudo anterior, o período de refração relativa ao músculo (RMR) foi prolongado, e a supernormalidade precoce (ESN) e a supernormalidade tardia (LSN) foram reduzidas em pacientes em comparação com controles saudáveis. Assim, os MVRCs podem fornecer in vivo evidências de despolarização de membrana em fibras musculares humanas intactas que estão por trás de sua excitabilidade reduzida. O protocolo aqui apresentado descreve como gravar MVRCs e analisar as gravações. Os MVRCs podem servir como um método rápido, simples e útil para revelar mecanismos de doença sem uma ampla gama de distúrbios neuromusculares.

Introdução

Os estudos de condução nervosa (NCS) e eletromiografia (EMG) são os métodos eletrofisiológicos convencionais utilizados para o diagnóstico de distúrbios neuromusculares. O NCS permite a detecção de perda axonal e desmielinização nos nervos^1,enquanto a EMG pode diferenciar se a miopatia ou as alterações neurogênicas estão presentes no músculo devido a danos nos nervos. No entanto, o NCS ou a EMG fornecem informações limitadas sobre propriedades da membrana de fibra muscular e mecanismos de doenças subjacentes. Essas informações podem ser obtidas utilizando eletrodos intracelulares em músculos isolados de biópsias musculares^2,3,4. No entanto, é de importância clínica usar metodologias utilizando gravações de músculos intactos em pacientes.

A velocidade de um segundo potencial de ação de fibra muscular muda em função do atraso após o primeiro⁵, e esta função de recuperação de velocidade (ou ciclo de recuperação) tem sido demonstrada para mudar nos músculos distróficos ou denervated. O rendimento dessas gravações de fibras musculares únicas era, no entanto, muito baixo para ser usado como ferramenta clínica⁶. No entanto, Z'Graggen e Bostock mais tarde descobriram que gravações multifibra, obtidas por estimulação direta e gravação do mesmo feixe de fibras musculares, fornecem um método rápido e simples de obter tais gravações no vivo⁷. Uma sequência de estímulos elétricos de pulso emparelhado com intervalos interestimulantes variados (ISIs) é usada neste método^7,8,9,10,11.

Os parâmetros mvrc avaliados incluem o seguinte: 1) período de refratário relativo ao músculo (MRRP), que é a duração após um potencial de ação muscular até que o próximo potencial de ação possa ser provocado; 2) supernormalidade precoce (ESN); e 3) supernormalidade tardia (LSN). ESN e LSN são os períodos após o período refratário em que os potenciais de ação são conduzidos ao longo da membrana muscular mais rápido do que o normal. O pós-potencial despolarizador e o acúmulo de potássio nos t-tbules do músculo, respectivamente, são hipóteses como as principais causas para os dois períodos de supernormalidade.

A ampla aplicabilidade dos MVRCs aos distúrbios musculares tem sido demonstrada na detecção da despolarização da membrana na isquemia^7,10,12 e insuficiência renal^13,além de fornecer informações sobre anormalidades na membrana muscular na miopatia doença crítica¹⁴ e inclusão da miosite corporal¹⁵. A rampa de frequência e os protocolos de simulação intermitente de 15 Hz e 20 Hz foram introduzidos desde então. MVRCs, juntamente com esses protocolos adicionais, demonstraram os diferentes efeitos na excitabilidade da membrana muscular relacionada sao mutações de perda de função ou ganho de função em vários canais musculares nos canalopatias hereditárias de íons musculares (ou seja, miotonia do canal de sódio, paramiotonia congenita¹⁶, distrofia miotônica¹⁷, síndrome de Andersen-Tawil¹⁸, e miotonia congenita^,20genita).

Em um estudo recente, a aplicabilidade dos MVRCs aos músculos neurogênicos foi mostrada pela primeira vez. O termo "músculo neurogênico" refere-se às alterações secundárias nos músculos esqueléticos que se desenvolvem como denervização e reinervação após qualquer lesão nas células de chifre anteriores ou axôndidos motores. A denervation é caracterizada no EMG como atividade espontânea (ou seja, fibrilações [fibs] e ondas afiadas positivas [psws]), enquanto grandes potenciais de unidade motora com duração prolongada e maior amplitude apresentam reinnervation²¹. As alterações emg são evidentes nos músculos denervated, mas as alterações celulares subjacentes nos potenciais da membrana de fibra muscular só foram demonstradas em estudos experimentais sobre tecido muscular isolado^2,3,4. Os MVRCs fornecem mais informações sobre as propriedades da membrana muscular humana vivo em relação ao processo de denervização.

Este artigo descreve detalhadamente a metodologia dos MVRCs. Também resume as mudanças nos músculos neurogênicos em um subgrupo de pacientes de um estudo relatado anteriormente²² e sujeitos de controle saudável que permitem a determinação de se o método é apropriado para um estudo planejado.

As gravações estão sendo realizados usando um protocolo de gravação que faz parte de um programa de software. Outros equipamentos utilizados são um estimulador constante linear linear isolado, eliminador de ruído de 50 Hz, amplificador de eletromiografia isolado e conversor analógico-digital.

Protocolo

Todos os sujeitos devem fornecer consentimento por escrito antes do exame, e o protocolo deve ser aprovado pelo conselho de revisão ética local apropriado. Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Regional de Ética Científica e pela Agência Dinamarquesa de Proteção de Dados.

1. Preparação do assunto

1. Avaliar os históricos médicos dos sujeitos para garantir que eles não tenham nenhum distúrbio anterior do sistema nervoso além do grupo da doença que será investigado.
2. Informe o assunto em detalhes sobre os exames e solicite a obtenção de consentimento por escrito.
   1. Informe o sujeito sobre a inserção de duas agulhas no músculo da perna e que as fibras musculares serão estimuladas com corrente fraca.
   2. Explique que a sensação pode parecer um pouco desagradável.
   3. Informe o sujeito de que a estimulação pode ser desligada imediatamente a qualquer momento durante a gravação em caso de desconforto.
3. Limpe a perna inferior do sujeito com álcool.
4. Insira o estimulante eletrodo da agulha monopolar (25 mm x 26 G) sobre o músculo tibial anterior e o eletrodo de superfície adesivo como o ânodo 1 cm distal à agulha monopolar(Figura 1).
5. Coloque um eletrodo terrestre distal no ânodo.
6. Insira o eletrodo da agulha concêntrica de gravação (25 mm x 30 G) cerca de 2cm proximal ao estimulante eletrodo da agulha monopolar ao longo das fibras musculares(Figura 1).
7. Conecte a agulha concêntrica de gravação e eletrodos moídos ao pré-amplificador.
8. Peça ao sujeito para permanecer em silêncio e evitar o movimento durante o exame.
9. Zere a saída do estimulador e conecte os eletrodos estimulantes ao estimulador (Figura 1).
10. Mantenha a temperatura da pele entre 32-36 °C usando uma lâmpada de aquecimento.

2. Gravação dos MVRCs

1. Inicie o software de gravação semi-automatizado usando o protocolo de gravação de excitabilidade muscular e ligue o estimulador. Os estímulos começarão em 2,5 mA com 1 Hz.
2. Aumente a intensidade de estímulo manualmente, atingindo a tecla Insert até que uma resposta seja registrada (max = 10 mA).
   1. Ajuste as agulhas estimulantes e de gravação, se necessário, até registrar uma resposta aceitável com uma intensidade de estímulo inferior a 10 mA. A forma do potencial de ação muscular deve ser tripé, se possível, e estável. Evite grandes interruptores de todo o músculo.
   2. Inverta o potencial de ação muscular atingindo a chave menos (-) se o potencial aparecer de cabeça para baixo.
      NOTA: Uma linha horizontal magenta aparece na tela indicando a largura do potencial de ação.
3. Ajuste a posição e o comprimento da linha magenta arrastando a linha com o mouse. A linha horizontal verde representa a linha de base.
4. Clique em OK para começar a gravar os MVRCs.
5. Selecione uma relação de resposta de estímulo das principais opções.
6. Aumente a intensidade de estímulo atingindo a tecla Insert a um máximo de 10 mA ou tolerável.
7. Clique em OK para começar a descer a curva de resposta de estímulo.
8. Clique em OK quando o estímulo do teste atingir zero.
9. Defina a intensidade de estímulo para nivelar a latência estável.
10. Clique em OK para retornar ao menu principal.
11. Selecione a opção 1/2/5 de condicionamento stims para RC.
12. Selecione um protocolo a partir de opções de ciclo de recuperação (por exemplo, inicie o ciclo de recuperação rápida [pule atrasos alternativos]), que é o padrão.
    NOTA: A gravação continua automaticamente por 34 etapas com a diminuição dos intervalos inter-estímulos (ISIs).
13. Certifique-se de que o potencial de ação muscular está estável durante a gravação e que a agulha não se moveu. A tela muda automaticamente para as principais opções quando as 34 etapas tiverem sido concluídas.
14. Clique em Terminar de gravar | Arquivo próximo | Ok,a menos que uma frequência de ramp-up ou gravações de 20 Hz estão sendo executadas.
15. Finalize a gravação e salve os dados clicando no arquivo Close e salve o botão de dados.

3. Análises MVRC

1. Inicie o programa de software analisado rastário.
2. Selecione a gravação que será analisada e clique no botão OK.
3. Clique nos parâmetros de carga do menu Files.
4. Selecione a opção MANAL9 para a análise. Se isso não estiver presente na lista, clique no Browse para encontrar este arquivo. Clique em OK para continuar.
5. Quando uma descrição da análise de excitabilidade muscular MAnal9 aparece, clique em OK para continuar.
   1. Inverta o potencial de ação muscular digitando MM-1 se o potencial aparecer de cabeça para baixo.
   2. Clique com o botão direito de tornar a linha magenta visível. Ajuste a janela para a base da resposta de pico e com uma largura correspondente aproximadamente à largura do potencial de ação a essa altura. Arraste com o mouse para ajustar a janela. A janela determina as latências dentro das quais a altura e a latência são medidas, como indicado pelas linhas azuis pálidas, e a linha verde indica a linha de base. Clique em OK para continuar.
6. Clique em OK para remedir as latências e picos. Isso será feito automaticamente.
   NOTA: Na exibição das latências remedidas, as latências são medidas para atrasos mais curtos do que os originais. Isso porque as respostas apenas aos estímulos de condicionamento foram subtraídas das respostas ao condicionamento mais ao teste. Isso garante que os estímulos de condicionamento não interferem nas medidas de latência. Como é indicado na caixa de prompt, os pontos ruins únicos podem ser eliminados posicionando o cursor (linha vermelha vertical) sobre o ponto e acertando a chave ~. O ponto ruim é substituído por média de valores de ambos os lados no mesmo canal. Se não houver pontos ruins, defina DE (extremidade de exibição) para logo após a última latência necessária.
7. Clique em OK para criar um arquivo RMC.
8. Ignore a maioria das opções que aparecem no formulário "Criar RCC ou RMC", uma vez que estas estão preocupadas com medições de fibra C em vez de MVRCs. Clique em Salvar e Sair para continuar. Após salvar o arquivo RMC, a caixa de solicitação oferece diferentes opções
9. Se os dados de rampa de frequência e/ou estimulação repetitiva foram registrados, siga as instruções para analisá-los. Caso contrário, selecione Ir direto para criar a opção de arquivo MEM para criar um arquivo MEM. Clique em OK para continuar.
10. Clique em Salvar e Sair para continuar.
11. Clique em OK para adicionar os dados RMC ao arquivo MEM.
12. Clique em Adicionar do arquivo Input RMC para adicionar esses dados ao arquivo MEM e, em seguida, alterar o diretório para salvar o arquivo MEM composto. Em seguida, clique em Salvar e Sair para salvá-lo.
13. Clique em OK para salvar o arquivo QZD remedido para permitir diferenciação do arquivo QZD original usando um sinal #.

Resultados

Os seguintes resultados foram obtidos em um subgrupo de pacientes de um estudo recente²², no qual havia fibs/psws em todos os locais mostrando atividade de denervation profuse. Os resultados mostraram que foram avaliadas alterações nas fibras musculares após a denervização, utilizando-se a técnica MVRC descrita neste protocolo. Os MVRCs mostraram mudanças consistentes com a despolarização do potencial da membrana de repouso nas fibras musculares neurogênicas.

...

Discussão

Os MVRCs, como programado sinuoso no software de gravação, é um procedimento altamente automatizado, mas é necessário cuidado para obter resultados confiáveis. Na fase de gravação, ao ajustar as agulhas, é importante evitar estimular a zona ou o nervo da placa final. Isso geralmente leva a grandes twitches de todo o músculo, o que aumenta o risco de deslocamento da estimulação e/ou agulha de gravação durante a gravação de MVRCs. Até o momento, o método foi aplicado a vários músculos que descreveram me...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 Hz Noise Eliminator	Digitimer Ltd		Humbug
Analogue-to-Digital Converter	National Instruments		NI-6221
Analysing software program	Digitimer Ltd (copyright Institute of Neurology, University College, London)		QtracP, MANAL9
Disposable concentric needle electrode, 25 mm x 30G	Natus		Dantec DCN
Disposable monopolar needle electrode, 25 mm x 26G	Natus		TECA elite
Isolated EMG amplifier	Digitimer Ltd		D440
Isolated linear bipolar constant-current stimulator	Digitimer Ltd		DS5
Software and recording protocol	Digitimer Ltd (copyright Institute of Neurology, University College, London)		QtracW software, M3REC3 recording protocol written by Hugh Bostock, Istitute of Neurology, London, UK)