Cicli di recupero della velocità muscolare per esaminare le proprietà della membrana muscolare

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per la registrazione dei cicli di recupero della velocità muscolare (MVRC), un nuovo metodo di esame delle proprietà della membrana muscolare. Gli MVRC consentono la valutazione in vivo del potenziale della membrana muscolare e alterazioni della funzione del canale ionico muscolare in relazione alla patologia e consentono la dimostrazione della depolarizzazione muscolare nei muscoli neurogenici.

Abstract

Anche se gli studi convenzionali di conduzione nervosa (NCS) e l'elettromiografia (EMG) sono adatti per la diagnosi di disturbi neuromuscolari, forniscono informazioni limitate sulle proprietà della membrana della fibra muscolare e sui meccanismi della malattia sottostante. I cicli di recupero della velocità muscolare (MVRC) illustrano come la velocità di un potenziale di azione muscolare dipenda dal tempo dopo un potenziale di azione precedente. Gli MVRC sono strettamente correlati ai cambiamenti nel potenziale della membrana che seguono un potenziale d'azione, fornendo così informazioni sulle proprietà della membrana della fibra muscolare. Gli MVRC possono essere registrati in modo rapido e semplice mediante stimolazione diretta e registrazione da fasci multifibra in vivo. Gli MVRC sono stati utili nella comprensione dei meccanismi della malattia in diversi disturbi neuromuscolari. Studi condotti su pazienti con channelopatie hanno dimostrato i diversi effetti di specifiche mutazioni del canale ionico sull'eccitabilità muscolare. MVRC sono stati precedentemente testati in pazienti con muscoli neurogenici. In questo studio precedente, il periodo di rifrazione relativa muscolare (MRRP) è stato prolungato, e la supernormalità precoce (ESN) e la tardiva supernormalità (LSN) sono state ridotte nei pazienti rispetto ai controlli sani. In questo modo, gli MVRC possono fornire prove in vivo della depolarizzazione della membrana in fibre muscolari umane intatte che sono alla base della loro ridotta eccitabilità. Il protocollo qui presentato descrive come registrare mVRC e analizzare le registrazioni. Gli MVRC possono fungere da metodo veloce, semplice e utile per rivelare i meccanismi della malattia in un'ampia gamma di disturbi neuromuscolari.

Introduzione

Gli studi di conduzione nervosa (NCS) e l'elettromiografia (EMG) sono i metodi elettrofisiologici convenzionali utilizzati per la diagnosi di disturbi neuromuscolari. NCS consente di rilevare la perdita assonale e la demielinazione nei nervi¹, mentre EMG può distinguere se la miopatia o i cambiamenti neurogenici sono presenti nel muscolo a causa di danni ai nervi. Tuttavia, NCS o EMG forniscono informazioni limitate sulle proprietà della membrana della fibra muscolare e sui meccanismi della malattia sottostanti. Queste informazioni possono essere ottenute utilizzando elettrodi intracellulari in muscoli isolati dalle biopsie^{muscolari 2,3,4}. Tuttavia, è di importanza clinica utilizzare metodologie utilizzando registrazioni da muscoli intatti nei pazienti.

La velocità di un secondo potenziale di azione fibra muscolare cambia in funzione del ritardo dopo il primo⁵, e questa funzione di recupero della velocità (o ciclo di recupero) ha dimostrato di cambiare nei muscoli distrofici o denervati. La resa di tali registrazioni da fibre muscolari singole era, tuttavia, troppo bassa per essere utile come strumento clinico⁶. Tuttavia, in seguito, la commissione per la protezione dell'ambiente e la protezione dell'ambiente, non è stata in grado di ottenere tali registrazioni in vivo^7. In questo^metodoviene utilizzata una sequenza di stimoli elettrici a impulsi accoppiati con intervalli interstimoli variabili (ISI).

I parametri MVRC valutati includono i seguenti: 1) periodo refrattario relativo muscolare (MRRP), che è la durata dopo un potenziale di azione muscolare fino a quando il prossimo potenziale di azione può essere suscitato; 2) supernormalità precoce (ESN); e 3) supernormalità tardiva (LSN). ESN e LSN sono i periodi dopo il periodo refrattario in cui i potenziali di azione vengono condotti lungo la membrana muscolare più velocemente del normale. L'accumulo depolarizzante postpotenziale e di potassio nei tubuli t del muscolo rispettivamente, sono ipotizzati come le principali cause per i due periodi di supernormalità.

L'ampia applicabilità degli MVRC ai disturbi muscolari è stata dimostrata nel rilevamento della depolarizzazione della membrana in ischemia^7,10,12 e insufficienza renale¹³, oltre a fornire informazioni sulle anomalie della membrana muscolare nella miopatia della malattia critica¹⁴ e miosite corporea di inclusione¹⁵. Da allora sono stati introdotti i protocolli di simulazione intermittenti da 15 e 20 Hz. Gli MVRC, insieme a questi protocolli aggiuntivi, hanno dimostrato i diversi effetti sulla eccitabilità della membrana muscolare legati alle mutazioni di perdita di funzione o guadagno di funzione in vari canali ionici muscolari nelle channelopatie degli ioni muscolari ereditari (cioè, canale di sodio miotonia, paramiotonia congenita¹⁶, distrofia miaotonica¹⁷, Sindrome di Andersen-Tawil¹⁸, e miotonia congenita^19,20).

In un recente studio, l'applicabilità degli MVRC ai muscoli neurogenici è stata dimostrata per la prima volta. Il termine "muscolo neurogenico" si riferisce ai cambiamenti secondari nei muscoli scheletrici che si sviluppano come denervazione e reinnervazione dopo qualsiasi lesione alle cellule del corno anteriore o agli assoni motori. La denervazione è caratterizzata in EMG come attività spontanea (ad esempio, fibrillazioni [fibs] e onde taglienti positive [psws]), mentre grandi potenzialità di unità motorie con durata prolungata e aumento dell'ampiezza presentano reinnervation²¹. I cambiamenti EMG sono evidenti nei muscoli denervati, ma i cambiamenti cellulari sottostanti nei potenziali della fibra muscolare sono stati dimostrati solo in studi sperimentali sul tessuto muscolare isolato^2,3,4. Gli MVRC forniscono ulteriori informazioni sulle proprietà della membrana muscolare umana in vivo per quanto riguarda il processo di denervazione.

Questo documento descrive in dettaglio la metodologia degli MVRC. Riassume anche i cambiamenti nei muscoli neurogenici in un sottogruppo di pazienti da uno studio precedentemente riportato²² e soggetti di controllo sani che consente di determinare se il metodo è appropriato per uno studio pianificato.

Le registrazioni vengono eseguite utilizzando un protocollo di registrazione che fa parte di un programma software. Altre apparecchiature utilizzate è uno stimolatore di corrente a corrente costante lineare isolato, un eliminatore di rumore di 50 Hz, un amplificatore elettromiografico isolato e un convertitore analogico-digitale.

Protocollo

Tutti i soggetti devono fornire il consenso scritto prima dell'esame e il protocollo deve essere approvato dall'appropriato comitato di revisione etica locale. Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato Etico Scientifico Regionale e dall'Agenzia danese per la protezione dei dati.

1. Preparazione del soggetto

1. Valutare le storie mediche dei soggetti per assicurarsi che non abbiano disturbi del sistema nervoso precedenti diversi dal gruppo di malattie che verrà studiato.
2. Informare l'argomento in dettaglio sugli esami e richiedere il consenso scritto.
   1. Informare il soggetto circa l'inserimento di due aghi in un muscolo della gamba e che le fibre muscolari saranno stimolati con corrente debole.
   2. Spiega che la sensazione può sembrare leggermente sgradevole.
   3. Informare il soggetto che la stimolazione può essere disattivata immediatamente in qualsiasi momento durante la registrazione in caso di disagio.
3. Pulire la parte inferiore della gamba del soggetto con l'alcol.
4. Inserire l'elettrodo aghi monopolare stimolante (25 mm x 26 G) sopra il muscolo tibiale anteriore e l'elettrodo di superficie adesivo come l'anodo distale di 1 cm all'ago monopolare (Figura 1).
5. Posizionare un elettrodo di terra distale per l'anodo.
6. Inserire l'elettrodo dell'ago concentrico di registrazione (25 mm x 30 G) circa 2cm prossimale per l'elettrodo ago monopolare stimolante lungo le fibre muscolari (Figura 1).
7. Collegare l'ago concentrico di registrazione e gli elettrodi a terra al preamplificatore.
8. Chiedere al soggetto di rimanere in silenzio ed evitare il movimento durante l'esame.
9. Azzerare l'uscita dello stimolatore e collegare gli elettrodi stimolanti allo stimolatore (Figura 1).
10. Mantenere la temperatura della pelle tra i 32 e i 36 gradi centigradi utilizzando una lampada riscaldante.

2. Registrazione degli MVRC

1. Avviare il software di registrazione semi-automatica utilizzando il protocollo di registrazione eccitabilità muscolare e accendere lo stimolatore. Le stimolazioni inizieranno a 2,5 mA con 1 Hz.
2. Aumentare manualmente l'intensità dello stimolo premendo il tasto Inserisci fino a quando non viene registrata una risposta (max : 10 mA).
   1. Regolare gli aghi stimolanti e di registrazione, se necessario, fino a registrare una risposta accettabile con un'intensità di stimolo inferiore a 10 mA. La forma del potenziale di azione muscolare dovrebbe essere triphasica, se possibile, e stabile. Evitare grandi contrazioni di tutto il muscolo.
   2. Invertire il potenziale di azione muscolare premendo il tasto meno (-) se il potenziale appare capovolto.
      NOTA: sullo schermo viene visualizzata una linea orizzontale magenta che indica la larghezza del potenziale di azione.
3. Regolare la posizione e la lunghezza della linea magenta trascinando la linea con il mouse. La linea orizzontale verde rappresenta la linea di base.
4. Fare clic su OK per avviare la registrazione degli MVRC.
5. Selezionare una relazione di risposta di stimolo dalle opzioni principali.
6. Aumentare l'intensità dello stimolo premendo il tasto Inserisci a un massimo di 10 mA o tollerabile.
7. Fare clic su OK per iniziare a decrescente la curva di risposta allo stimolo.
8. Fare clic su OK quando lo stimolo di test raggiunge lo zero.
9. Impostare l'intensità dello stimolo su level per una latenza stabile.
10. Fare clic su OK per tornare al menu principale.
11. Selezionare l'opzione 1/2/5 stim di condizionamento per RC.
12. Selezionare un protocollo dalle opzioni del ciclo di ripristino (ad esempio, avviare il ciclo di ripristino rapido [ignora ritardi alternativi]), che è l'impostazione predefinita.
    NOTA: la registrazione continua automaticamente per 34 passaggi con intervalli interstimolati decrescenti (ISI).
13. Assicurarsi che il potenziale di azione muscolare è stabile durante la registrazione e che l'ago non si è mosso. La schermata passa automaticamente alle opzioni principali una volta completati i 34 passaggi.
14. Fare clic su Termina registrazione . Chiudere il file OK, a meno che non venga eseguita una frequenza di ramp-up o registrazioni a 20 Hz.
15. Terminare la registrazione e salvare i dati facendo clic sul pulsante Chiudi file e salva dati.

3. Analisi MVRC

1. Avviare il programma software di analisi per eseguire l'analisi offline.
2. Selezionare la registrazione che verrà analizzata e fare clic sul pulsante OK.
3. Fare clic su Carica parametri dal menu File.
4. Selezionare l'opzione MANAL99 per l'analisi. Se questo non è presente nella lista, fare clic su Sfoglia per trovare questo file. Fare clic su OK per continuare.
5. Quando viene visualizzata una descrizione dell'analisi di eccitabilità muscolare MAnal9, fare clic su OK per continuare.
   1. Invertire il potenziale di azione muscolare digitando MM-1 se il potenziale appare capovolto.
   2. Fare clic con il pulsante destro del mouse per rendere visibile la linea magenta. Impostare la finestra sulla base della risposta di picco e con una larghezza corrispondente approssimativamente alla larghezza del potenziale di azione a quell'altezza. Trascinare con il mouse per regolare la finestra. La finestra determina le latenze entro le quali vengono misurate l'altezza e la latenza, come indicato dalle linee blu pallido, mentre la linea verde indica la linea di base. Fare clic su OK per continuare.
6. Fare clic su OK per rimisurare le latenze e i picchi. Questa operazione verrà eseguita automaticamente.
   NOTA: Nel display delle latenze rimesmite, le latenze vengono misurate in ritardi più brevi rispetto a quelli originali. Questo perché le risposte agli stimoli di condizionamento da sole sono state sottratte dalle risposte al condizionamento più il test. Ciò garantisce che gli stimoli di condizionamento non interferiscano con le misurazioni della latenza. Come indicato nella casella di richiesta, i singoli punti non superati possono essere eliminati posizionando il cursore (linea rossa verticale) sul punto e premendo il tasto . Il punto non valido viene sostituito con la media dei valori su entrambi i lati nello stesso canale. Se non sono presenti punti non necessari, impostare DE (fine visualizzazione) su appena dopo l'ultima latenza richiesta.
7. Fare clic su OK per creare un file RMC.
8. Ignorare la maggior parte delle opzioni visualizzate nel modulo "Crea RCC o RMC", poiché queste riguardano le misurazioni della fibra C anziché degli MVRC. Fare clic su Salva ed esci per continuare. Dopo aver salvato il file RMC, la casella di richiesta fornisce diverse opzioni
9. Se sono stati registrati dati di rampa di frequenza e/o di stimolazione ripetitiva, seguire le istruzioni per analizzarli. In caso contrario, selezionare l'opzione Vai direttamente per creare un file MEM per creare un file MEM. Fare clic su OK per continuare.
10. Fare clic su Salva ed esci per continuare.
11. Fare clic su OK per aggiungere i dati RMC al file MEM.
12. Fare clic su Aggiungi da file RMC di input per aggiungere questi dati al file MEM, quindi modificare la directory in modo da salvare il file MEM composito. Quindi, fare clic su Salva ed esci per salvarlo.
13. Fare clic su OK per salvare il file Q-D rimisurato in modo da consentire la differenziazione dal file Q-D originale utilizzando un segno .

Risultati

I seguenti risultati sono stati ottenuti in un sottogruppo di pazienti da un recente studio²², in cui c'erano fibs/psws in tutti i siti che mostravano una prossucusia attività di denervazione. I risultati hanno mostrato che i cambiamenti nelle fibre muscolari dopo la denervazione sono stati valutati in vivo utilizzando la tecnica MVRC descritta in questo protocollo. Gli MVRC hanno mostrato cambiamenti coerenti con la depolarizzazione del potenziale della membrana a riposo nelle fibre muscolari ne...

Discussione

Gli MVRC, come programmato nel software di registrazione, sono una procedura altamente automatizzata, ma è necessaria attenzione per ottenere risultati affidabili. Nella fase di registrazione, durante la regolazione degli aghi, è importante evitare di stimolare la zona di fascia terminale o il nervo. Questo di solito porta a grandi contrazioni di tutto il muscolo, che aumenta il rischio di spostamento della stimolazione e/ o registrazione dell'ago durante la registrazione di MVRC. Fino ad oggi, il metodo è stato appli...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 Hz Noise Eliminator	Digitimer Ltd		Humbug
Analogue-to-Digital Converter	National Instruments		NI-6221
Analysing software program	Digitimer Ltd (copyright Institute of Neurology, University College, London)		QtracP, MANAL9
Disposable concentric needle electrode, 25 mm x 30G	Natus		Dantec DCN
Disposable monopolar needle electrode, 25 mm x 26G	Natus		TECA elite
Isolated EMG amplifier	Digitimer Ltd		D440
Isolated linear bipolar constant-current stimulator	Digitimer Ltd		DS5
Software and recording protocol	Digitimer Ltd (copyright Institute of Neurology, University College, London)		QtracW software, M3REC3 recording protocol written by Hugh Bostock, Istitute of Neurology, London, UK)