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Neste Artigo

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Resumo

Neste protocolo, as nanopartículas de ouro modificadas AS1411-g-PEI-g-PEG são sintetizadas através de reações de meio-médio de três etapas. Em seguida, a doxorubicina é carregada e entregue às células cancerígenas alvo para a terapia contra o câncer.

Resumo

Devido à resistência e toxicidade de medicamentos em células saudáveis, o uso de doxorubicina (DOX) tem sido limitado na terapia clínica do câncer. Este protocolo descreve a concepção de poli (etilenimina) enxertada com polietileno glicol (PEI-g-PEG) nanopartículas de ouro funcionalizadas (AuNPs) com aptámero carregado (AS1411) e DOX através de reações de amida. O AS1411 é especificamente ligado a receptores de nucleoslinas direcionados em células cancerosas para que o DOX alveja células cancerígenas em vez de células saudáveis. Primeiro, o PEG é carboxilado, depois enxertado em PEI ramificado para obter um copolímero PEI-g-PEG, que é confirmado pela análise de 1H NMR. Em seguida, as nanopartículas de ouro revestidas de copolímero PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs) são sintetizadas, e DOX e AS1411 são covalentemente ligados aos AuNPs gradualmente através de reações de amida. O diâmetro do AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs é de ~39,9 nm, com potencial zeta de -29,3 mV, indicando que as nanopartículas estão estáveis em água e meio celular. Ensaios de citoxicidade celular mostram que os AuNPs carregados de DOX recém-projetados são capazes de matar células cancerígenas (A549). Esta síntese demonstra o delicado arranjo de copolímeros PEI-g-PEG, aptamers e DOX em AuNPs que são obtidos por reações sequenciais de amida. Tais AuNPs funcionalizados aptamer-PEI-g-PEG fornecem uma plataforma promissora para a entrega de medicamentos direcionados na terapia contra o câncer.

Introdução

Sendo o maior problema de saúde pública em todo o mundo, o câncer é amplamente caracterizado como tendo uma baixa taxa de cura, alta taxa de recidiva e alta taxa de mortalidade1,2. Os métodos anti-câncer convencionais atuais incluem cirurgia, quimioterapia e radioterapia3, entre os quais a quimioterapia é o tratamento primário para pacientes com câncer na clínica4. Os medicamentos anticancerígenos usados clinicamente incluem paclitaxel (PTX)5 e doxorubicina (DOX)6,7. O DOX, um medicamento antineoplásico, tem sido amplamente aplicado na quimioterapia clínica, devido às vantagens da citotoxicidade do câncer e da inibição da proliferação de células cancerosas8,9. No entanto, o DOX causa cardiotoxicidade10,11, e a curta meia-vida do DOX restringe sua aplicação na clínica12. Portanto, os transportadores de drogas degradáveis são necessários para carregar o DOX e liberar subeqüentemente de forma controlada para uma área alvo.

As nanopartículas têm sido amplamente utilizadas em sistemas de entrega de medicamentos direcionados e têm várias vantagens no tratamento do câncer (ou seja, proporção superfície-volume considerável, tamanho pequeno, capacidade de encapsular várias drogas e química de superfície incapaz, etc.) 13,14,15. Em particular, as nanopartículas de ouro (AuNPs) têm sido amplamente utilizadas em aplicações biológicas e biomédicas, como a terapia fototérmica do câncer16,17. As propriedades únicas dos AuNPs, como síntese fácil e funcionalização geral da superfície, têm excelentes perspectivas no campo clínico da terapiaoncológica 18. Além disso, os AuNPs têm sido utilizados para identificar estratégias de entrega de medicamentos, diagnosticar tumores e superar a resistência em muitos estudos19,20.

Não obstante, os AuNPs precisam ser mais adaptados para superar a resistência medicamentosa através da alta liberação local em lesões tumorais por meio de uma maior permeação e retenção (EPR), como as propriedades de segmentação e acessibilidade. Os AuNPs funcionais de polímeros apresentaram vantagens únicas, como a melhoria da solubilidade da água de medicamentos anticâncer hidrofóbicos e o tempo de circulação prolongado21,22. Vários polímeros biocompatíveis têm sido usados para revestimentos AuNP, como polietileno glicol (PEG), polietileneimina (PEI), ácido hialurônico, heparina e goma xantana. Em seguida, a estabilidade, assim como a carga útil, de AuNPs é melhorada bem23. Especificamente, o PEI é um polímero altamente ramificado que é composto por muitas unidades repetitivas de aminas primárias, secundárias e terciárias24. PEI tem excelente solubilidade, baixa viscosidade e alto grau de funcionalidade, que é adequado para revestimento em AuNPs.

Por outro lado, os medicamentos anticâncicos precisam ser entregues diretamente às células cancerosas com maior eficiência de carregamento e com menor toxicidade para o tratamento de tumores metastáticos primários e avançados25. Ligantes-alvo têm grande potencial para sistemas de entrega direcionados a medicamentos anticâneos26. Sua seletividade para a ligação de moléculas-alvo confere especificidade de especificidade de medicamentos anticâncer e aumenta o enriquecimento medicamentoso em tecidos doentes27. Mais ligantes incluem anticorpos, polipeptídeos e pequenas moléculas. Comparados com outros ligantes, os aptamers de ácido nucleico podem ser sintetizados in vitro e são fáceis de modificar. AS1411 é um oligonucleotídeo de 26 bp fosfodiester não modificado que forma uma estrutura G-tetramer dimeric estável para se ligar especificamente a um receptor de proteína nuclear de alvo superexpresso em células cancerosas28,29,30. AS1411 inibe a proliferação de muitas células cancerígenas, mas não afeta o crescimento de células saudáveis31,32. Como resultado, o AS1411 tem sido usado para fabricar um sistema ideal de entrega de medicamentos direcionado.

Neste estudo, um copolímero PEI-g-PEG é sintetizado através de uma reação de amida, então as nanopartículas de ouro revestidas de copolímero PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs) são fabricadas. Além disso, o DOX e o AS1411 estão sequencialmente ligados ao PEI-g-PEG@AuNPs preparado, como mostrado na Figura 1. Este protocolo detalhado destina-se a ajudar os pesquisadores a evitar muitas das armadilhas comuns associadas à fabricação de novas PEI-g-PEG@AuNPs carregadas com DOX e AS1411.

Protocolo

ATENÇÃO: Certifique-se de consultar todas as folhas de dados de segurança do material relevante (MSDS) antes de usar todos os produtos químicos. Vários dos produtos químicos usados para preparar copolímeros e nanopartículas são agudamente tóxicos. As nanopartículas também têm perigos potenciais. Certifique-se de usar todas as práticas de segurança apropriadas e equipamentos de proteção individual, incluindo luvas, jaleco, capuzes, calças de comprimento integral e sapatos de dedos próximos.

1. Síntese de polietileno glicol de carboxil duplo (CT-PEG)33

  1. Adicione 1,46 g (14,6 mmol) de anidrido succinico (SA) e 209 mgs (1,71 mmol) de 4 dimetilaaminopirridina (DMAP) a um frasco fundo redondo de 100 mL.
  2. Adicione 15 mL de tetrahidrofurano anidrofurano (THF) ao frasco usado na etapa 1.1 e coloque uma rolha de vidro. Mantenha o frasco a 0 °C por 30 min.
  3. Adicione 4,28 g (4,28 mmol) de polietileno glicol (PEG) e 1,8 mL (12,8 mmol) de trietilamina (TEA) a um novo frasco.
  4. Adicione 15 mL de THF anidro ao frasco usado na etapa 1.3 e coloque uma rolha de vidro. Transfira a solução lentamente para o frasco usado na etapa 1.2, usando uma seringa sob atmosfera de nitrogênio.
  5. Mexa a solução a 0 °C por 2h e continue a reação à temperatura ambiente (RT) durante a noite.
  6. Utilizando um evaporador rotativo (40 °C, 0,1 MPa), concentre a solução de reação e remova o solvente THF.
  7. Na RT, dissolva a solução de reação da etapa 1.6 em 15 mL de 1,325 g/mL de diclorometano (DCM), em seguida, adicione 15 mL de éter de dietil frio (Et2O) para obter o produto de precipitação (diacíclico polietilenoglicol). Remova o solvente através de papel filtro.
    NOTA: O passo de precipitação pode ser repetido 3x.
  8. Seque os precipitados sob vácuo em RT por 48 h.

2. Síntese do copolímero PEI-g-PEG

  1. Adicione 305,47 mg de CT-PEG da etapa 1.8 e 5 mL de sulfóxido de dimetila (DMSO) a um frasco e mexa no RT para garantir que o CT-PEG seja totalmente dissolvido no DMSO.
  2. Dissolver 49,46 mg de 1-(3-dimetilaminapropyl)-3-etilcarbodimídeo hydrochloride (EDC) em 5 mL de DMSO, em seguida, adicione a solução ao frasco usado na etapa 2.1 e mexa por 30 min na RT.
  3. Dissolver 29,69 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) em 5 mL de DMSO e adicionar a solução ao frasco utilizado na etapa 2.1. Continue mexendo no RT por 3 h.
  4. Dissolva 28,6 μL de polietileneimina (PEI) em 10 mL de DMSO e adicione a solução dropwise ao frasco usado na etapa 2.1. Mexa por 3 dias, pelo menos.
  5. Transfira a solução reagida da etapa 2.4 para um saco de diálise (corte de peso molecular de 1.000 [MWCO]). Coloque o saco de diálise em um béquer de 1 L com 500 mL de água ultrapura como o dialise. Troque a água ultrauso a cada 12 h por 3 dias.
  6. Transfira a solução na etapa 2.5 para outra bolsa de diálise (10.000 MWCO). Coloque o saco de diálise em um béquer de 1 L com 500 mL de água ultrapura como o dialise. Troque a água ultrauso a cada 12 h por 3 dias.
  7. Concentre a solução a partir da etapa 2.6 usando um evaporador rotativo (40 °C, 0,1 MPa) e congele a amostra para obter o pó PEI-g-PEG.

3. Síntese de PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Dissolva 5 mg de PEI-g-PEG preparado (passo 2.7) em 5 mL de água ultrapura em um novo frasco e ajuste com uma rolha de vidro.
  2. Adicione 100 mL de solução HAuCl4 de 0,3 mM ao frasco e mexa a solução por 3 h na RT.
    NOTA: A cor da solução deve mudar imediatamente de amarelo para laranja.
  3. Adicione 1 mL de solução NaBH4 de 1 mg/mL ao frasco e mexa a solução por 3 h na RT.
    NOTA: A solução de reação deve instantaneamente virar borgonha.
  4. Dialise o produto de reação usando um saco de diálise (1.000 MWCO) durante 3 dias, conforme descrito na etapa 2.5 para obter a solução PEI-g-PEG@AuNPs.

4. Síntese de DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Adicione 1 mL de solução DOX de 2,2 mg/mL e 20 mL de solução PEI-g-PEG@AuNPs a um novo frasco e ajuste com uma rolha de vidro.
  2. Dissolva 0,727 mg de EDC em 1 mL de água ultrauso e adicione a solução EDC ao frasco utilizado na etapa 4.1.
  3. Dissolva 0,437 mg de NHS em 1 mL de água ultrapura. Adicione a solução NHS ao frasco e mexa no RT por 1h.
  4. Dilífique o produto de reação usando um saco de diálise (1.000 MWCO) durante 3 dias, conforme descrito na etapa 2.5 para obter a solução DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

5. Síntese de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Adicione 20 mL de solução DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e 4OD de AS1411 (OD = densidade óptica; 1OD ≈ 33 μg) a um novo frasco.
  2. Dissolva 28,76 mg de EDC em 1 mL de água ultrauso e adicione a solução EDC ao frasco usado na etapa 5.1.
  3. Dissolva 17,27 mg de NHS em 1 mL de água ultrapura. Adicione a solução NHS ao frasco usado na etapa 5.1 e mexa a reação por 1 h no RT.
  4. Dilífique o produto de reação usando um saco de diálise (1.000 MWCO) durante 3 dias, conforme descrito na etapa 2.5 para obter AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

6. Caracterização da amostra

  1. Dissolva o polímero CT-PEG (etapa 1.8) e o copolímero PEI-g-PEG (etapa 2.7) em tubos de clorofórmio-d em tubos de ressonância magnética nuclear (RMR), respectivamente. Analise as amostras usando um espectrômetro NMR de 600 MHz equipado com um ímã supercondutor de 14,09 T e uma sonda de alta resolução de banda larga Z de 5,0 mm 600 MHz para confirmar a estrutura química34.
  2. Disperse AuNPs, DOX e AS1411, e prepare pei-g-PEG@AuNPs (etapa 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (etapa 4.4) e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (etapa 5.4), respectivamente em água ultrapura. Em seguida, transfira para cuvetas e registos ultravioleta-visível (UV-vis) usando um espectrômetro UV-vis.
  3. Conecte um adesivo de dupla face (~2 mm x 2 mm) à folha de alumínio e mergulhe a solução de amostra (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) na fita inteira uniformemente. Analise as amostras usando um analisador de espectroscopia de fotoeletrâncro de raios-X.
  4. Disperse as soluções PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, respectivamente em água ultrauso. Em seguida, transfira para cuvetas e avalie a distribuição de tamanho usando dispersão dinâmica de luz.
  5. Disperse as soluções PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs em água ultrauso (uma gota de amostra por 5 mL de água ultrauso para cada amostra). Sonicate por 2 h. Mergulhe a rede de cobre em soluções de amostra e seque sob uma lâmpada infravermelha. Caracterize a morfologia usando um microscópio eletrônico de transmissão.
  6. Injete 1 mg de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs em um de diálise MWCO de 20 kDa, em seguida, coloque em 80 mL de salina tamponada de fosfato (PBS) com 5% de albumina de soro bovino (BSA). Mexa a 37 °C.
  7. Nos pontos de tempo predeterminados, colete alíquotas de 100 μL e substitua por PBS fresco. Use um espectrofotômetro UV-vis para medir a intensidade de fluorescência do DOX das alíquotas.

7. Ensaio CCK-8 de nanopartículas AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Cultivar células A549 no meio modificado da Águia (DMEM) modificado de Dulbecco ( DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal, penicilina U/mL de 100 U/mL e 100 μg/mL estreptomicina sob uma atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO2 a 37 °C. Substitua o meio de cultura a cada 2 dias. Use células na passagem 5 para a proliferação celular e ensaios de citotoxicidade para avaliar quantitativamente a citotoxicidade das nanopartículas AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
  2. Adicione 100 μL de solução de nanopartículas em cada poço que contabilizando 1 mL de meio celular. Depois de cultivar por 24h e 48 h, remova a mídia de cultura das placas de cultura celular, em seguida, adicione 300 μL de mídia de cultura fresca e 30 μL de soluções de kit-8 (CCK-8) de contagem celular imediatamente para cada poço. Incubar por 4h em uma incubadora de CO2 a 37 °C.
  3. Transfira 200 μL de soluções de reação da etapa 7.2 para uma placa de poço 96. Leia a densidade óptica (OD) de cada poço a 570 nm com um leitor de microplacas.
  4. Observe a morfologia das células a 24 h e 48 h sob um microscópio.

Resultados

1 A espectroscopia H NMR foi utilizada para confirmar a síntese bem sucedida de polímeros CT-PEG e copolímeros PEI-g-PEG(Figura 2). A Figura 2a mostra que o sinal de próton de metileno em δ = 3,61 ppm e sinal de próton carboxil em δ = 2,57 ppm confirmam a síntese bem sucedida dos polímeros CT-PEG. A Figura 2b mostra que o sinal de próton de metileno de PEG em δ = 2,6 ppm e sinal de pr...

Discussão

O espectro de 1H NMR (Figura 2) confirma a síntese bem sucedida do copolímero CT-PEG e do copolímero PEI-g-PEG. Os pesos moleculares de PEG e PEI foram de 1.000 e 1.200, respectivamente. Além disso, o sistema catalítico EDC/NHS foi usado para sintetizar o copolímero PEI-g-PEG através de reações de amida. Deve-se notar que se os pesos moleculares de PEG e PEI mudaram para sintetizar o copolímero PEI-g-PEG, então o tempo de reação e o sistema catalítico precisam ser re...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31700840); o Principal Projeto de Pesquisa Científica da Província de Henan (18B430013, 18A150049). Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Estudiosos de Nanhu para Jovens Estudiosos da XYNU. Os autores gostariam de agradecer ao estudante de bacharel Zebo Qu, da Faculdade de Ciências da Vida em XYNU, por seus trabalhos úteis. Os autores gostariam de reconhecer o Centro de Análise & Testes da XYNU para o uso de seus equipamentos.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
4-DimethylaminopyridineMacklinD807273
A549 cellATCC CCL-185TM
AS1411BBI Life Sciences Corporation5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411)
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF)SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Cell counting kit-8 (CCK-8)Sigma Aldrich96992-500TESTS-F
DichloromethaneTraditional Chinese medicine80047318
Diethyl ether (Et2O)SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Dimethyl sulfoxideMacklinD806645
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)Sigma Aldrich
Doxorubicin hydrochlorideRhawnR017518
Ether absoluteTraditional Chinese medicine80059618
Field Emission Transmission Electron MicroscopeFEI CompanyTecnai G2 F 20
Gold(III) chloride trihydrateRhawnR016035
Laser Particle-size InstrumentMalvern Instruments LtdZetasizerNanoZS/Masterszer3000E
Microplate ReaderMolecular DevicesSpectraMax 190
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochlorideMacklinN808856
N-HydroxysuccinimideMacklinH6231
NMR softwareDelta 5.2.1
Nuclear Magnetic Resonance SpectrometerJEOLJNM-ECZ600R/S3
Origin 8.5OriginLab
PenicillinSigma AldrichV900929-100ML
Phosphate-buffered salineSigma AldrichP4417-100TAB
Poly(ethylene glycol)Sigma Aldrich81188BioUltra, average Mn ~ 1000
Poly (ethyleneimine) solutionSigma Aldrich482595average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O
Sodium borohydride, powderAcrosC18930
StreptomycinSigma Aldrich85886-10ML
Succinic anhydrideTraditional Chinese medicine30171826
TetrahydrofuranTraditional Chinese medicine40058161
TriethylamineTraditional Chinese medicine80134318
UV/VIS/NIR SpectrometerLambda950Lambda950
X-ray Photoelectron SpectrometerThermo Fisher ScientificK-ALPHA 0.5EV

Referências

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