Sintesi di Nanoparticelle d'oro modificate Aptamer-PEI-g-PEG Caricate con doxorubicina per la consegna mirata di farmaci

Riepilogo

In questo protocollo, le nanoparticelle d'oro modificate AS1411-g-PEI-g-PEG caricate con doxorubicina vengono sintetizzati tramite reazioni di ammide in tre step. Quindi, la doxorubicina viene caricata e consegnata alle cellule tumorali bersaglio per la terapia del cancro.

Abstract

A causa della resistenza ai farmaci e della tossicità nelle cellule sane, l'uso di doxorubicina (DOX) è stato limitato nella terapia clinica del cancro. Questo protocollo descrive la progettazione di poli(etilenimina) innestate con polietilene glicole (PEI-g-PEG) copolimero funzionalizzato nanoparticelle d'oro (AuNPs) con aptamero caricato (AS1411) e DOX attraverso reazioni ammide. AS1411 è specificamente legato con recettori mirati della nucleolina sulle cellule tumorali in modo che il DOX si ritrae contro le cellule tumorali anziché le cellule sane. In primo luogo, PEG viene carbossilato, quindi innestato in PEI ramificata per ottenere un copolimero PEI-g-PEG, che è confermato ^{dall'analisi NMR 1}H. Successivamente, vengono sintetizzati nanoparticelle d'oro rivestite di copolimero PEI-g-PEG@AuNPs) e DOX e AS1411 sono covalentemente legati agli AuNP gradualmente attraverso reazioni ammide. Il diametro dell'AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs preparato è di ~39,9 nm, con un potenziale zeta di -29,3 mV, indicando che le nanoparticelle sono stabili in acqua e mezzo cellulare. I test di citotossicità cellulare mostrano che gli AuNP caricati da DOX di nuova progettatezza sono in grado di uccidere le cellule tumorali (A549). Questa sintesi dimostra la delicata disposizione di copolimeri, aptameri e DOX PEI-g-PEG sugli AuRP che si ottengono con reazioni sequenziali di ammide. Tali ADUL funzionalizzati aptamer-PEI-g-PEG forniscono una piattaforma promettente per la somministrazione mirata di farmaci in terapia oncologica.

Introduzione

Essendo il principale problema di salute pubblica in tutto il mondo, il cancro è ampiamente caratterizzato come avente un basso tasso di cura, un alto tasso di recidiva e un alto tasso^{di mortalità 1,2}. Gli attuali metodi anti-cancro convenzionali includono chirurgia, chemioterapia e radioterapia³, tra cui la chemioterapia è il trattamento primario per i pazienti oncologici nella clinica⁴. I farmaci antitumorali usati clinicamente includono principalmente paclitaxel (PTX)⁵ e doxorubicina (DOX)^6,7. Dox, un farmaco antineoplastico, è stato ampiamente applicato nella chemioterapia clinica, a causa dei vantaggi della citotossicità del cancro e dell'inibizione della proliferazione delle cellule^{tumorali 8,9}. Tuttavia, DOX causa cardiotossicità 10^,11e la breve emiprotezione di DOX ne limita l'applicazione nella clinica¹². Pertanto, i portatori di farmaci degradabili sono necessari per caricare DOX e rilasciare in modo sottoequente in modo controllato in un'area mirata.

Le nanoparticelle sono state ampiamente utilizzate in sistemi mirati di somministrazione di farmaci e hanno diversi vantaggi nel trattamento del cancro (ad esempio, rapporto superficie/volume bilmente ridotto, piccole dimensioni, capacità di incapsulare vari farmaci e chimica delle superfici tonnibili, ecc.) ^13,14,15. In particolare, le nanoparticelle d'oro (AuNPs) sono state ampiamente utilizzate in applicazioni biologiche e biomediche, come la terapia del cancro fototermico^16,17. Le proprietà uniche degli AuNP, come la facile sintesi e la funzionalizzazione generale della superficie, hanno ottime prospettive nel campo clinico della terapia del cancro¹⁸. Inoltre, gli AuNP sono stati utilizzati per identificare le strategie di somministrazione dei farmaci, diagnosticare i tumori e superare la resistenza in^{molti studi 19,20}.

Nonostante ciò, gli AuRP devono essere ulteriormente personalizzati per superare la resistenza ai farmaci attraverso un elevato rilascio locale di lesioni tumorali attraverso una maggiore permeazione e ritenzione (EPR), come le proprietà di targeting e accessibilità. Gli AuRP funzionalizzati polimerici hanno mostrato vantaggi unici, come una migliore solubilità in acqua dei farmaci anticancro idrofobici e un tempo di circolazione^{prolungato 21,22}. Vari polimeri biocompatibili sono stati utilizzati per rivestimenti AuNP, come polietilene glicole (PEG), polietileneimina (PEI), acido ialuronico, eparina e gomma di xantano. Quindi la stabilità, così come il carico utile, degli AuNP è migliorata ben²³. In particolare, pei è un polimero altamente ramificato composto da molte unità ripetute di ammine primarie, secondarie e terziarie²⁴. PEI ha un'eccellente solubilità, bassa viscosità e un alto grado di funzionalità, adatto per il rivestimento su AuNPs.

D'altra parte, i farmaci anti-cancro devono essere consegnati alle cellule tumorali direttamente con una migliore efficienza di carico e con una minore tossicità per il trattamento dei tumori metastatici primari e^{avanzati 25}. I ligandi mirati hanno un grande potenziale per i sistemi di somministrazione mirati ai farmaci anti-cancro²⁶. La sua selettività per il legame con molecole bersaglio conferisce un farmaco anti-cancro mirato alla specificità e aumenta l'arricchimento dei farmaci nei tessuti^{malati 27}. Altri ligandi includono anticorpi, polipeptidi e piccole molecole. Rispetto ad altri ligandi, gli aptameri di acido nucleico possono essere sintetizzati in vitro e sono facili da modificare. AS1411 è un oligonucleotide fosfodiestere da 26 bp non modificato che forma una struttura G-tetramero dimerica stabile per legarsi specificamente a un recettore delle proteine nucleari bersaglio sovraespresso^{sulle cellule tumorali 28,29,30}. AS1411 inibisce la proliferazione di molte cellule tumorali ma non influisce sulla crescita delle cellule^{sane 31,32}. Di conseguenza, AS1411 è stato utilizzato per fabbricare un sistema di somministrazione di farmaci mirato ideale.

In questo studio, un copolimero PEI-g-PEG viene sintetizzato attraverso una reazione ammide, quindi vengono fabbricate nanoparticelle d'oro rivestite di copolimero PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs). Inoltre, DOX e AS1411 sono collegati in sequenza al pei-g-PEG@AuNPs preparato, come illustrato nella figura 1. Questo protocollo dettagliato ha lo scopo di aiutare i ricercatori a evitare molte delle insidie comuni associate alla fabbricazione di nuovi PEI-g-PEG@AuNPs caricati con DOX e AS1411.

Protocollo

ATTENZIONE: Assicurarsi di consultare tutte le schede di dati di sicurezza dei materiali pertinenti (MSDS) prima di utilizzare tutte le sostanze chimiche. Molte delle sostanze chimiche utilizzate per preparare copolimeri e nanoparticelle sono acutamente tossiche. Anche le nanoparticelle hanno potenziali pericoli. Assicurati di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate e i dispositivi di protezione individuale, tra cui guanti, camice da laboratorio, cappucci, pantaloni a figura intera e scarpe a punta stretta.

1. Sintesi del polietilene glicole polietilenilene doppio-carbossile (CT-PEG)³³

1. Aggiungere 1,46 g (14,6 mmol) di anidride succinica (SA) e 209 mg (1,71 mmol) di 4-dimetilaminopiridina (DMAP) in un pallone inferiore rotondo da 100 ml.
2. Aggiungere 15 ml di tetraidrofurano anidrofurano (THF) al pallone utilizzato nel passaggio 1.1 e montare un tappo di vetro. Mantenere il pallone a 0 °C per 30 minuti.
3. Aggiungere 4,28 g (4,28 mmol) di polietilene glicole (PEG) e 1,8 ml (12,8 mmol) di trietilammina (TEA) in un nuovo pallone.
4. Aggiungere 15 ml di THF anidro al pallone utilizzato nel passaggio 1.3 e montare un tappo di vetro. Trasferire lentamente la soluzione nel pallone utilizzato nel passaggio 1.2, utilizzando una siringa in atmosfera di azoto.
5. Mescolare la soluzione a 0 °C per 2 ore, quindi continuare la reazione a temperatura ambiente (RT) durante la notte.
6. Utilizzando un evaporatore rotante (40 °C, 0,1 MPa), concentrare la soluzione di reazione e rimuovere il solvente THF.
7. A RT sciogliere la soluzione di reazione dal passaggio 1.6 in 15 mL di 1.325 g/mL diclorometano (DCM), quindi aggiungere 15 mL di etere dietile freddo (Et₂O) per ottenere il prodotto di precipitazione (polietilene glicole diacid). Rimuovere il solvente tramite carta da filtro.
   NOTA: La fase di precipitazione può essere ripetuta 3x.
8. Asciugare i precipitati sotto vuoto a RT per 48 ore.

2. Sintesi del copolimero PEI-g-PEG

1. Aggiungere 305,47 mg di CT-PEG dai gradini 1.8 e 5 mL di solfossido di dimetile (DMSO) a un pallone e mescolare a RT per assicurarsi che CT-PEG sia completamente sciolto in DMSO.
2. Sciogliere 49,46 mg di cloridrato di 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimide (EDC) in 5 ml di DMSO, quindi aggiungere la soluzione al pallone utilizzato nel passaggio 2.1 e mescolare per 30 minuti a RT.
3. Sciogliere 29,69 mg di N-idrossisuccinimide (NHS) in 5 ml di DMSO e aggiungere la soluzione al pallone utilizzato nel passaggio 2.1. Continuare a mescolare a RT per 3 h.
4. Sciogliere 28,6 μL di polietileneimina (PEI) in 10 ml di DMSO e aggiungere la soluzione per goccia al pallone utilizzato nel passaggio 2.1. Mescolare per almeno 3 giorni.
5. Trasferire la soluzione reagì dal passaggio 2.4 a un sacchetto di dialisi (1.000 tagli di peso molecolare [MWCO]). Posizionare il sacchetto di dialisi in un becher da 1 L con 500 mL di acqua ultrapura come dialisi. Cambiare l'acqua ultrapura ogni 12 ore per 3 giorni.
6. Trasferire la soluzione nel passaggio 2.5 in un altro sacchetto di dialisi (10.000 MWCO). Posizionare il sacchetto di dialisi in un becher da 1 L con 500 mL di acqua ultrapura come dialisi. Cambiare l'acqua ultrapura ogni 12 ore per 3 giorni.
7. Concentrare la soluzione dal passaggio 2.6 utilizzando un evaporatore rotante (40 °C, 0,1 MPa) e congelare il campione per ottenere la polvere PEI-g-PEG.

3. Sintesi di PEI-g-PEG@AuNPs

1. Sciogliere 5 mg di PEI-g-PEG preparato (fase 2.7) in 5 ml di acqua ultrapura in un nuovo pallone e montare con un tappo di vetro.
2. Aggiungere 100 mL di soluzione HAuCl₄ da 0,3 mM al pallone e mescolare la soluzione per 3 ore a RT.
   NOTA: Il colore della soluzione deve cambiare immediatamente dal giallo all'arancione.
3. Aggiungere 1 ml di soluzione NaBH₄ mg/mL al pallone e mescolare la soluzione per 3 ore a RT.
   NOTA: La soluzione di reazione dovrebbe girare istantaneamente bordeaux.
4. Dializzare il prodotto di reazione utilizzando un sacchetto di dialisi (1.000 MWCO) per 3 giorni come descritto al passaggio 2.5 per ottenere la soluzione PEI-g-PEG@AuNPs.

4. Sintesi di DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

1. Aggiungere 1 ml di soluzione DOX da 2,2 mg/mL e 20 ml di soluzione PEI-g-PEG@AuNPs in un nuovo pallone e montare con un tappo di vetro.
2. Sciogliere 0,727 mg di EDC in 1 ml di acqua ultrapura e aggiungere la soluzione EDC al pallone utilizzato nel passaggio 4.1.
3. Sciogliere 0,437 mg di NHS in 1 mL di acqua ultrapura. Aggiungere la soluzione NHS al pallone e mescolare a RT per 1 h.
4. Dializzare il prodotto di reazione utilizzando un sacchetto di dialisi (1.000 MWCO) per 3 giorni come descritto al passaggio 2.5 per ottenere la soluzione DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

5. Sintesi di AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

1. Aggiungere 20 mL di soluzione DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e 4OD di AS1411 (OD = densità ottica; 1OD ≈ 33 μg) a un nuovo pallone.
2. Sciogliere 28,76 mg di EDC in 1 ml di acqua ultrapura e aggiungere la soluzione EDC al pallone utilizzato nel passaggio 5.1.
3. Sciogliere 17,27 mg di NHS in 1 mL di acqua ultrapura. Aggiungere la soluzione NHS al pallone utilizzato nel passaggio 5.1 e mescolare la reazione per 1 h a RT.
4. Dializzare il prodotto di reazione utilizzando un sacchetto di dialisi (1.000 MWCO) per 3 giorni come descritto al passaggio 2.5 per ottenere AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

6. Caratterizzazione del campione

1. Sciogliere il polimero CT-PEG (fase 1.8) e il copolimero PEI-g-PEG (fase 2.7) rispettivamente in cloroformio-d nei tubi di risonanza magnetica nucleare (NMR). Analizzare i campioni utilizzando uno spettrometro NMR a 600 MHz dotato di un magnete superconduttore da 14,09 T e di una sonda ad alta risoluzione a banda larga a banda larga 5,0 mm 600 MHz per confermare la struttura^{chimica 34.}
2. Disperdere AuNPs, DOX e AS1411 e preparare PEI-g-PEG@AuNPs (passaggio 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (passaggio 4.4) e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (passaggio 5.4), rispettivamente in acqua ultrapura. Quindi, trasferire alle cuvette e registrare gli spettri visibili agli ultravioletti (UV-vis) utilizzando uno spettrofotometro UV-vis.
3. Attaccare un adesivo a doppia faccia (~2 mm x 2 mm) alla lamina di alluminio e immergere la soluzione del campione (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) sull'intero nastro in modo uniforme. Analizzare i campioni utilizzando un analizzatore di spettroscopia fotoelettronica a raggi X.
4. Disperdere le soluzioni PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, rispettivamente in acqua ultrapura. Quindi, trasferire alle cuvette e valutare la distribuzione delle dimensioni utilizzando lo scattering dinamico della luce.
5. Disperdere le soluzioni PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs in acqua ultrapura (una goccia di campione per 5 mL di acqua ultrapura per ogni campione). Sonicare per 2 h. Immergere la griglia di rame in soluzioni campione e asciugare sotto una lampada a infrarossi. Caratterizzare la morfologia usando un microscopio elettronico a trasmissione.
6. Iniettare 1 mg di AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs in una cassetta di dialisi MWCO da 20 kDa, quindi mettere in 80 mL di saline tamponate di fosfato (PBS) con albumina di siero bovino al 5% (BSA). Mescolare a 37 °C.
7. Nei punti di tempo predeterminati, raccogliere aliquote 100 μL e sostituire con PBS fresco. Utilizzare uno spettrofotometro UV-vis per misurare l'intensità di fluorescenza DOX delle aliquote.

7. Test CCK-8 delle nanoparticelle di AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

1. Coltivare cellule A549 nel mezzo dell'Aquila modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina in un'atmosfera umidificata del 95% di aria e del 5% di CO₂ a 37 °C. Sostituire il mezzo di coltura ogni 2 giorni. Utilizzare cellule al passaggio 5 per la proliferazione cellulare e test di citotossicità per valutare quantitativamente la citotossicità delle nanoparticelle AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs preparate.
2. Aggiungere 100 μL di soluzione di nanoparticelle in ogni pozzo contenente 1 mL di mezzo cellulare. Dopo aver coltivato per 24 ore e 48 ore, rimuovere i mezzi di coltura dalle piastre di coltura cellulare, quindi aggiungere immediatamente 300 μL di mezzi di coltura freschi e 30 μL di soluzioni di kit di conteggio cellulare-8 (CCK-8) immediatamente ad ogni pozzo. Incubare per 4 ore in un incubatore di CO₂ a 37 °C.
3. Trasferire 200 μL di soluzioni di reazione dal passo 7.2 in una piastra di pozzo 96. Leggere la densità ottica (OD) di ogni pozzo a 570 nm con un lettore di micropiatte.
4. Osservare la morfologia delle cellule a 24 ore e 48 ore al microscopio.

Risultati

^{1 ) La commissione per la} La spettroscopia H NMR è stata utilizzata per confermare la sintesi riuscita del polimero CT-PEG e dei copolimeri PEI-g-PEG (Figura 2). La figura 2a mostra che il segnale protonico di metilene a δ = 3,61 ppm e il segnale protonico carbossile a δ = 2,57 ppm confermano la sintesi riuscita dei polimeri CT-PEG. La figura 2b mostra che il segnale protonico di metilene di PEG a...

Discussione

Lo ^{spettro 1}H NMR (Figura 2) conferma la sintesi riuscita del copolimero CT-PEG e del copolimero PEI-g-PEG. I pesi molecolari di PEG e PEI erano rispettivamente 1.000 e 1.200. Inoltre, il sistema catalitico EDC/NHS è stato utilizzato per sintetizzare il copolimero PEI-g-PEG attraverso reazioni di ammide. Va notato che se i pesi molecolari di PEG e PEI sono cambiati per sintetizzare il copolimero PEI-g-PEG, allora il tempo di reazione e il sistema catalitico devono essere rivaluta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Dimethylaminopyridine	Macklin	D807273
A549 cell		ATCC CCL-185TM
AS1411	BBI Life Sciences Corporation		5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411)
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF)	SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Cell counting kit-8 (CCK-8)	Sigma Aldrich	96992-500TESTS-F
Dichloromethane	Traditional Chinese medicine	80047318
Diethyl ether (Et2O)	SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Dimethyl sulfoxide	Macklin	D806645
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Sigma Aldrich
Doxorubicin hydrochloride	Rhawn	R017518
Ether absolute	Traditional Chinese medicine	80059618
Field Emission Transmission Electron Microscope	FEI Company	Tecnai G2 F 20
Gold(III) chloride trihydrate	Rhawn	R016035
Laser Particle-size Instrument	Malvern Instruments Ltd	ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax 190
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride	Macklin	N808856
N-Hydroxysuccinimide	Macklin	H6231
NMR software	Delta 5.2.1
Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer	JEOL	JNM-ECZ600R/S3
Origin 8.5	OriginLab
Penicillin	Sigma Aldrich	V900929-100ML
Phosphate-buffered saline	Sigma Aldrich	P4417-100TAB
Poly(ethylene glycol)	Sigma Aldrich	81188	BioUltra, average Mn ~ 1000
Poly (ethyleneimine) solution	Sigma Aldrich	482595	average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O
Sodium borohydride, powder	Acros	C18930
Streptomycin	Sigma Aldrich	85886-10ML
Succinic anhydride	Traditional Chinese medicine	30171826
Tetrahydrofuran	Traditional Chinese medicine	40058161
Triethylamine	Traditional Chinese medicine	80134318
UV/VIS/NIR Spectrometer	Lambda950	Lambda950
X-ray Photoelectron Spectrometer	Thermo Fisher Scientific	K-ALPHA 0.5EV