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Este protocolo descreve um modelo de infecção de Aspergillus em larvas de zebrafish. Os esporos de aspergillus são microinjetados na cérebro traseira das larvas, e o tratamento químico é usado para induzir a imunossupressão. A progressão da infecção é monitorada através de uma configuração diária de imagens para monitorar o crescimento fúngico e as respostas imunológicas, bem como a enumeração de esporos vivos por placa de unidade formadora de colônias.
A aspergillose invasiva (IA) é uma das infecções fúngicas mais comuns entre indivíduos imunocomprometidos. Apesar da disponibilidade de medicamentos antifúngicos, a IA pode causar >50% de mortalidade em pacientes imunocomprometidos infectados. É fundamental determinar fatores hospedeiros e patógenos que contribuem para a suscetibilidade da infecção e baixas taxas de sobrevivência em pacientes infectados, a fim de desenvolver novas terapêuticas. As respostas imunológicas inatas desempenham um papel fundamental no reconhecimento e liberação dos esporos de Aspergillus, embora pouco se saiba sobre os mecanismos celulares e moleculares exatos. Modelos confiáveis são necessários para investigar interações mecanicistas detalhadas entre o hospedeiro e o patógeno. A clareza óptica e a trato genética das larvas de zebrafish fazem deles um modelo intrigante para estudar interações hospedeira-patógeno de múltiplas infecções bacterianas e fúngicas humanas em um hospedeiro vivo e intacto. Este protocolo descreve um modelo de infecção por zebrafish larval Aspergillus. Primeiro, os esporos de Aspergillus são isolados e injetados no ventrículo de cérebro traseiro de zebrafish via microinjeção. Em seguida, inibidores químicos como drogas imunossupressores são adicionados diretamente à água larval. Dois métodos para monitorar a infecção em larvas injetadas são descritos, incluindo a homogeneização 1) de larvas para enumeração da unidade formadora de colônias (UFC) e 2) uma configuração de imagem ao vivo repetida e diária. No geral, essas técnicas podem ser usadas para analisar mecanicamente a progressão da infecção por Aspergillus in vivo e podem ser aplicadas a diferentes origens hospedeiras e cepas de Aspergillus para interrogar interações hospedeiro-patógeno.
Aspergillus fumigatus é um fungo saprofítico onipresente, e seus esporos aéreos podem ser encontrados tanto dentro quanto fora de casa1. Estes esporos são inalados por todos, mas são efetivamente liberados dos pulmões de indivíduos imunocompetuntes1,2. No entanto, pessoas com condições pulmonares alteradas, como a fibrose cística, podem desenvolver aspergillose broncopulmonar devido à germinação fúngica nos pulmões3. A forma mais grave dessa infecção, aspergillose invasiva (IA), afeta indivíduos imunocomprometidos e envolve o crescimento do fungo em outros órgãos2,3. A IA leva a >50% de morte de pacientes infectados, apesar da disponibilidade de terapias antifúngicas4. Em indivíduos imunocompetuntes, as respostas imunes inatas desempenham um papel importante na limpeza dos esporos inalados1. No entanto, os mecanismos específicos que contribuem para essa liberação imunológica inata não são bem compreendidos. É importante compreender os mecanismos celulares e moleculares das principais células imunes inatas (ou seja, macrófagos e neutrófilos) no desembaraço da Aspergillus, a fim de encontrar novas estratégias terapêuticas para a IA.
Embora os modelos de mamíferos tenham sido fundamentais na identificação de fatores de virulência fúngica e respostas imunes hospedeiras5,6, a acessibilidade visual é limitada para interações hospedeiro-patógeno no nível celular. Experimentos de cultura tecidual não podem recapitular totalmente o complexo ambiente multicelular e as interações que existem em animais inteiros7. Portanto, o zebrafish ganhou popularidade como um organismo modelo alternativo para preencher essa lacuna e facilitar o estudo das interações hospedeiro-patógeno em um hospedeiro vivo e intacto em uma infecção de vários dias8,9. O sistema imunológico inato de zebrafish desenvolve-se até 24 horas após a fertilização (hpf)10, e o sistema adaptativo leva de 4 a 6 semanas para desenvolver11, proporcionando uma janela de tempo em que as respostas imunes inatas podem ser avaliadas isoladamente. As respostas imunológicas inatas são bem conservadas entre humanos e zebrafish11. Os zebrafish têm muitas qualidades que facilitam a investigação dessas respostas, incluindo a clareza óptica (que permite a imagem ao vivo de alta resolução de hospedeiros intactos) e a tratobilidade genética (o que facilita estudos mecanicistas moleculares).
O modelo de infecção por zebrafish larval Aspergillus descrito aqui foi originalmente desenvolvido por Knox et al.12. Foi recentemente expandido pelo nosso grupo e outros para investigar mecanismos imunológicos hospedeiros12,13, interações hospedeira-patógeno13,14,15, mecanismos de imunossupressão13,16,17, virulência fúngica18, e eficácia de drogas antifúngis19,20. Este modelo recapitula múltiplos aspectos da aspergillose humana. Enquanto as larvas imunocompetente são resistentes, larvas imunocomprometidas podem sucumbir à infecção12,13,16,17.
Nesse modelo, uma infecção localizada é estabelecida injetando esporos no ventrículo de cérebro traseiro da larva, uma área menos povoada com fagocitos, e o recrutamento e comportamento de fagocitos podem ser avaliados12,13. Acredita-se que os macrófagos agem como a primeira linha de defesa contra esporos de Aspergillus em humanos1 e modelos mamíferos6,21. Da mesma forma, no modelo de zebrafish, os macrófagos são recrutados para os esporos aspergillus injetados, enquanto os neutrófilos são recrutados em segundo lugar em resposta ao crescimento hifál12,13,22. A partir desse modelo, também foi aprendido que a Aspergillus pode persistir em larvas imunocompetntes do tipo selvagem após mais de 7 dias de infecção. Além disso, todo o curso da infecção pode ser acompanhado nos mesmos animais vivos por imagens confocal diárias.
Este protocolo descreve a técnica de microinjeção para injetar esporos no ventrículo de cérebro traseiro de 2 dias após a fertilização (2 dpf) larvas. A infecção é então monitorada por até 7 dias, já que as larvas de zebrafish podem viver até 10 dpf sem se alimentar. A imunossupressão pode ser induzida pelo tratamento medicamentoso, e a aplicação de drogas nas larvas também é descrita. Finalmente, são descritos dois métodos para seguir a progressão da infecção, incluindo a quantificação de UFC de larvas individuais e uma configuração diária de imagens ao vivo.
Os pesquisadores devem obter aprovação para todos os experimentos com animais dos comitês de cuidados e uso adequados dos animais. Os dados representativos mostrados neste artigo são de experimentos realizados em protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Clemson (AUP2018-070, AUP2019-012).
1. Preparação de esporos de Aspergillus para injeção
2. Preparação de placas de ágar para injeção
3. Microinjeção de ventrículo de larva de zebrafish
4. Estabelecimento de números de esporos injetados e viáveis
5. Tratamento medicamentoso de larvas injetadas
6. Imagens diárias de larvas infectadas usando o dispositivo de ferida e armadilha de zebrafish para crescimento e imagem (zWEDGI)
Após a microinjeção dos esporos de Aspergillus no cérebro traseiro das larvas de zebrafish, o resultado da infecção pode ser seguido por múltiplos ensaios, incluindo sobrevivência, CFUs e imagens vivas. Em um ensaio de sobrevivência, o número de larvas infectadas sobreviventes de 1 a 7 dpi foi monitorado. Quando as larvas do tipo selvagem foram deixadas sem tratamento, muito pouca morte foi observada, com ~80%-100% das larvas sobrevivendo a totalidade do experimento(Figura 1). Se as larvas foram imunossupressores, como a exposição à droga corticosteroide dexametasona (10 μM), observou-se diminuição significativa da sobrevida(Figura 1).
Quando as UFC foram quantificadas ao longo dos 7 dias de experimento de larvas selvagens infectadas com esporos de A. fumigatus, observou-se persistência dos esporos, com desobstrução lenta ao longo do tempo(Figura 2A). O número de esporos que sobreviveram a 1, 2, 3, 5 e 7 dpi foram normalizados ao número de esporos injetados em 0 dpi para comparar persistência e folga entre as réplicas(Figura 2B).
Linhas de peixes transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em leucócitos, juntamente com esporos aspergillus fluorescentes que expressam proteínas podem ser usados para visualizar tanto o recrutamento e o comportamento de leucócitos quanto a germinação e crescimento fúngico13. Quando os macrófagos foram rotulados (por exemplo,Tg(mpeg1:H2B-GFP),oagrupamento de macrófagos em ~50% das larvas foi tipicamente observado, a partir de 2-3 dpi(Figura 3A). O recrutamento de neutrófilos (Tg:BFP)foi tipicamente atrasado, ocorrendo principalmente após a germinação fúngica(Figura 3A). Enquanto a carga fúngica persistiu durante todo o experimento na maioria das larvas(Figura 3A),observou-se a liberação(Figura 3B). Em algumas larvas, a carga fúngica fora do cérebro traseiro também foi observada mais tarde na infecção, devido à disseminação fúngica, provavelmente em macrófagos.
A área ao redor da vesícula otic é um local possível onde essa divulgação pode ser encontrada(Figura 3C). Essas observações foram quantificadas em múltiplas larvas individuais ao longo de todo o experimento(Figura 4). Normalmente, a germinação era observada em ~60% das larvas por 5 dpi(Figura 4A). A área de cluster phagocyte, o recrutamento de macrófagos e o recrutamento de neutrófilos variam tanto ao longo do tempo quanto em larvas, com algumas tendências ao longo do experimento e algumas resolvendo ao longo do tempo (Figura 4B,C,D).
Figura 1: Análise representativa da sobrevivência das larvas infectadas. Aspergillus-infectadas larvas foram expostas ao controle do veículo (DMSO) ou dexmethasona (Dex), e a sobrevivência foi monitorada. Os dados representam três réplicas agrupadas. AS CFUs médias de injeção: DMSO = 30, Dex = 29 (p-valor e razão de risco foram calculadas pela análise de regressão de risco proporcional de Cox, ****p < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A CFU representativa conta com larvas infectadas individuais imediatamente após a injeção (0 dpi) e durante o curso de infecção (2, 3, 5 e 7 dpi). Oito larvas infectadas foram homogeneizadas e banhadas para contar a UFC para cada ponto de tempo e replicar. (A) Exemplos de dados de uma réplica. Cada ponto representa uma larva, as barras representam meios para cada ponto de tempo. (B) As contagens de UFC foram normalizadas para a contagem da UFC em 0 dpi para cada réplica, e três réplicas foram agrupadas. Os dados foram comparados entre condições experimentais utilizando análise de variância e resumidos em termos de meios marginais estimados e erros padrão. Astérix representam significância estatística em relação à UFC em 0 dpi (*p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas de experimentos de infecção. Larvas tratadas com PTU com macrófagos fluorescentes (mpeg1:H2B-GFP) e neutrófilos (lyz:BFP) foram injetadas com A. fumigatusexpressando RFP . Larvas infectadas ao vivo foram imagens repetidamente aos 2, 3 e 5 dpi em um microscópio confocal. Intensidade máxima As imagens de projeção Z são exibidas. Esquemas de larvas indicam a localização da imagem para cada painel. Todas as barras de escala representam 100 μm, exceto para as barras de escala de entrada, que são de 25 μm. (A) As imagens mostradas são de uma única larva tirada a 2, 3 e 5 dpi, representando uma progressão típica da infecção. Os insets mostram germinação fúngica nos dias 3 e 5. (B) Imagem representativa do subconjunto de larvas que podem limpar a infecção, com baixa carga fúngica e pouca inflamação a 5 dpi. (C) Imagem representativa do subconjunto de larvas em que a infecção se dissemina para fora do cérebro traseiro em momentos posteriores. Nesta imagem, fungos, macrófagos e neutrófilos podem ser encontrados ao redor e abaixo da vesícula otica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Quantificação representativa de experimentos de imagem. Imagens da configuração experimental na Figura 3 foram analisadas para germinação fúngica e recrutamento de leucócitos. (A) Larvas foram pontuadas para a presença de esporos germinados em cada dia, e a porcentagem de larvas com germinação foi calculada. (B,C,D) Cada larva individual é representada como uma linha de cores diferente. Aparência e tamanho do cluster faófilo (B), recrutamento de macrófagos (C) e recrutamento de neutrófilos (D) foram seguidos ao longo do experimento de 5 dias para cada larva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O modelo de infecção descrito aqui é benéfico para analisar as respostas imunes do hospedeiro, interações hospedeira-patógeno e patogênese fúngica12,13,14,15. Essas informações podem ser derivadas da imagem de alta resolução de patógenos fluorescentes e células hospedeiras13,sobrevivência larval e persistência da UFC ao longo do tempo.
A técnica de microinjeção é fundamental para o sucesso deste protocolo e pode precisar ser ajustada ao usar diferentes equipamentos e configurações de microinjeção. Em particular, a pressão e o tempo de injeção são duas variáveis principais e podem ser ajustados para garantir que o volume ejetado pela agulha seja ~3 nL. O tamanho da agulha conforme determinado pelo recorte com fórceps também regula o número de esporos injetados; embora, uma abertura maior pode causar danos teciduais à larva. Por outro lado, uma abertura muito pequena não permitirá que os esporos relativamente grandes (>2 μm) saiam e podem levar ao entupimento da agulha. Se isso ocorrer, a agulha pode ser relipped para ter uma abertura ligeiramente maior.
Outros protocolos para microinjeção de bactérias utilizam PVP-40 para ajudar a manter uma mistura de injeção homogênea, mas não encontramos nenhuma vantagem em usar este portador com esporos Aspergillus. O entupimento da agulha pode ser mitigado com o vórtice da preparação fúngica completamente para quebrar qualquer aglomerado antes de carregar a agulha. Às vezes, um entupimento na agulha também pode ser desalojado aumentando temporariamente o tempo de pressão ou injeção e acionando o microinjetor enquanto a agulha está no líquido ao redor das larvas. O tempo de pressão e injeção deve então ser reduzido novamente para níveis anteriores. Em outros casos, um entupimento não pode ser removido, e uma nova agulha precisa ser carregada e recalibrada.
Este protocolo foi projetado para injetar ~30-70 esporos por larva. Sabe-se que com base na concentração da preparação do esporo e no volume injetado, este número é bastante baixo. No entanto, foi empiricamente encontrado que este é o número de esporos injetados nessas condições. Por que essa diferença ocorre é desconhecida, mas pode ser devido ao esporos na agulha. Nossas próprias tentativas de injetar um número maior de esporos foram em grande parte mal sucedidas.
Para garantir que cerca de 30 a 70 esporos estejam sendo injetados e manter a consistência das injeções em todas as larvas, verifique o número de esporos injetando no E3 ao redor das larvas. Repita isso a cada cinco a seis larvas ao longo de todas as injeções. Se a contagem de esporos parece mudar, o tempo de pressão e/ou injeção pode ser ajustado para injetar um número consistente de esporos em várias larvas. No entanto, deve-se tomar cuidado para que a dose de injeção permaneça principalmente no cérebro traseiro e não preencha o cérebro médio e o cérebro.
Para garantir uma infecção localizada, a suspensão do esporo deve ser contida dentro do ventrículo de cérebro traseiro. Isso pode ser visualizado pela coloração vermelha fenol logo após a injeção, embora a cor vermelha difunde com o tempo. Para injeções, a região ao redor do vesículo ático é usada para perfurar e alcançar o ventrículo em um ângulo de 45°-65°. Esta área não tem vasos sanguíneos principais, causa menos danos teciduais e cicatriza instantaneamente. Se a pele sobre o ventrículo for perfurada, a suspensão do esporo pode ser vazada, pois a agulha que deve ser usada para injeções de esporos Aspergillus é maior do que a usada para suspensões bacterianas. Larvas injetadas ou acidentalmente danificadas podem ser marcadas injetando na gema algumas vezes para criar uma marca vermelha ou arrastando a larva para fora da linha com a agulha. Depois que um conjunto de injeções estiver completo, essas larvas devem ser removidas e descartadas antes que o resto seja lavado da placa. E3 sem azul de metileno é usado para anestesiar larvas antes da injeção e também manter larva após as injeções, porque o azul de metileno é antifúngico.
No momento da injeção, as contagens de UFC representam o número de esporos viáveis dentro do hospedeiro infectado. No entanto, se os esporos germinarem em hifas, estes podem ser divididos em "unidades fúngicas" separadas durante a homogeneização e podem dar origem a várias colônias. Ou, uma hifa multicelular ininterrupta pode dar origem a uma única colônia, resultando em uma representação média, mas imprecisa, do fardo fúngico. Isso pode ser mitigado combinando a contagem da UFC com microscopia longitudinal de larvas individuais, que fornece dados visuais do destino dos esporos injetados.
Em comparação com o sistema de mamíferos, o modelo de infecção por larvas de zebrafish é particularmente significativo devido à sua acessibilidade óptica. O recrutamento e a resposta de células imunes inatas podem ser visualizados dentro de um hospedeiro intacto ao vivo. Isso pode ser incorporado com inibição genética ou química de alvos moleculares para analisar como cada alvo afeta a reação macrófago ou neutrófilo contra esporos de Aspergillus em um animal vivo.
Enquanto o modelo de infecção por zebrafish Aspergillus continua sendo fundamental na descrição de diferentes aspectos da IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, há outras áreas de expansão. Do lado hospedeiro, é usado para descrever respostas imunes de nível celular, mas isso pode ser expandido para analisar mecanismos imunológicos no nível molecular, combinando-o com morfolino direcionado, CRISPR, linhas mutantes estáveis ou exposição química. Uma ressalva é que os homólogos de todos os mamíferos conhecidos inatas componentes da via imunológica não foram identificados em zebrafish.
Do lado do patógeno, a virulência de diferentes espécies e cepas foram descritas. Uma avenida promissora de pesquisas futuras é o uso de cepas mutantes de Aspergillus para testar como genes ou proteínas específicas contribuem como fatores de virulência. Assim, novas drogas antifúngicas podem ser desenvolvidas para atingir essas proteínas. Os medicamentos antifúngicos atuais têm baixa eficácia em pacientes humanos e há crescente resistência a essas drogas em fungos28. Este modelo in vivo pode ser usado para investigar por que essas drogas falham e como um modelo intermediário para testar a eficácia de novas drogas antifúngicas. No geral, os achados descobertos usando esse modelo podem facilitar o desenvolvimento futuro de tratamentos eficazes para pacientes infectados pela Aspergillus.
Não há conflitos ou interesses financeiros para divulgar.
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número K22AI134677. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose | Fisher | BP160-500 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
Media and Solutions | Components/Recipe | ||
E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |
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