Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Resumo

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Resumo

As células mamíferas são constantemente expostas a produtos químicos, radiações e subprodutos metabólicos que ocorrem naturalmente, que criam tipos específicos de insultos de DNA. Agentes genotóxicos podem danificar a espinha dorsal do DNA, quebrá-la ou modificar a natureza química das bases individuais. Após insulto de DNA, vias de resposta a danos de DNA (DDR) são ativadas e proteínas envolvidas no reparo são recrutadas. Uma infinidade de fatores estão envolvidos na detecção do tipo de dano e na ativação da resposta adequada ao reparo. A falha em ativar e recrutar corretamente fatores de DDR pode levar à instabilidade genômica, que está por trás de muitas patologias humanas, incluindo o câncer. Estudos de proteínas DDR podem fornecer insights sobre a resposta de medicamentos genotóxicos e mecanismos celulares de resistência a medicamentos.

Existem duas principais formas de visualizar proteínas in vivo: observação direta, marcando a proteína de interesse com uma proteína fluorescente e seguindo-a por imagem viva, ou imunofluorescência indireta em amostras fixas. Embora a visualização de proteínas fluorescentes marcadas permita um monitoramento preciso ao longo do tempo, a marcação direta em N ou C-terminus pode interferir na localização ou função da proteína. A observação de proteínas em sua versão endógena não modificada é preferida. Quando as proteínas de reparação de DNA são recrutadas para o insulto do DNA, sua concentração aumenta localmente e formam grupos, ou "focos", que podem ser visualizados por imunofluorescência indireta usando anticorpos específicos.

Embora a detecção de focos proteicos não forneça uma prova definitiva de interação direta, a co-localização de proteínas nas células indica que elas se reagrupam ao local do dano e podem informar sobre a sequência de eventos necessários para formação complexa. A análise cuidadosa da sobreposição espacial de focos em células expressas do tipo selvagem ou versões mutantes de uma proteína pode fornecer pistas preciosas sobre domínios funcionais importantes para a função de reparação de DNA. Por último, a co-localização de proteínas indica possíveis interações diretas que podem ser verificadas por co-imunoprecipitação nas células, ou retirada direta usando proteínas purificadas.

Introdução

Células humanas são constantemente expostas a uma variedade de DNA danificando agentes de várias origens. Fontes exógenas consistem principalmente em exposição a radiações, produtos químicos (incluindo agentes quimioterápicos e alguns antibióticos), e vírus, enquanto as principais fontes endógenas incluem erros na replicação do DNA e estresse oxidativo. Os efeitos diretos da exposição genotoxica podem variar de uma base modificada a uma quebra de duplo fio de DNA potencialmente letal (DSB), dependendo do estresse e da dose de exposição. Em última análise, danos de DNA não reparados ou mal reparados podem levar ao acúmulo de mutações, rearranjos genômicos, instabilidade do genoma e eventualmente levar à carcinogênese¹. As células mamíferas desenvolveram caminhos complexos para reconhecer tipos específicos de dano de DNA^2,3 e repará-los em tempo hábil, sincronizados com a progressão do ciclo celular.

A radiação ionizante (IR) danifica a dupla hélice do DNA e cria quebras de dois fios (DSBs), uma das formas mais deletérias de dano de DNA. O complexo MRN (MRE11, RAD50, NBS1) funciona como um sensor de extremidades de DNA e ativa a proteína quinase ataxia telangiectasia mutada (ATM)^4,5. Após a ativação inicial do ATM por extremidades de DNA, o ATM desencadeia uma cascata de eventos de DDR no local do rompimento, iniciando com um evento-chave, a fosforilação da variante histona H2AX⁶. Fosforilação H2AX sobre resíduo S139 ativa-o em γH2AX, abrangendo regiões até megabases em torno da lesão de DNA^6,,7,,8,9. Este evento aumenta a acessibilidade ao DNA, levando ao recrutamento e acúmulo de outras proteínas de reparação de DNA⁷. Como o γH2AX é abundante e especificamente induzido em DSBs circundantes, ele pode ser facilmente visualizado usando anticorpos específicos, e é comumente usado como um marcador substituto para DSBs no campo de reparação de DNA. Uma vez que a ruptura é sinalizada, as células ativam suas vias de reparação de DNA e processam o dano de DNA. A proteína MDC1 (mediadora da proteína de ponto de verificação de dano de DNA 1) liga diretamente γH2AX^10,interage com o ATM¹¹ e também com NBS1^12,13. Contribui para aumentar a concentração do complexo de MRN no DSB e iniciar um ciclo positivo de feedback atm. γH2AX é rapidamente removido uma vez que a ruptura é reparada, consequentemente, permitindo o monitoramento da liberação DSB. Seguida pela microscopia, a diminuição do γH2AX ao longo do tempo fornece uma medição indireta de quebras residuais e eficiência de reparação de DNA.

As células eucarióticas podem reparar DSBs por várias vias, sendo as duas principais não homólogos a junção final (NHEJ) e recombinação homólogo (HR)(Figura 1). NHEJ essencialmente liga extremidades de dupla cadeia de DNA sem o uso de homologia estendida e opera durante todo o ciclo celular^14,15. O RH torna-se predominante durante as fases S e G2, e é reprimido de outra forma, uma vez que requer uma cromátide irmã como modelo homólogo para reparo^14,16. A escolha do caminho entre nhej e RH não depende apenas da proximidade física da cromátide irmã, mas também da extensão da ressecção final de DNA^17,que inibe o NHEJ.

O reparo de DSB dependente de ecologia inicia-se pela degradação nucleolítica do fio de 5' das extremidades de ruptura para gerar caudas de DNA de 3' de fios únicos (ssDNA), um processo chamado de ressecção de 5'-3'. O complexo MRN inicia a ressecção final do DNA e a ressecção adicional é processada em combinação com BLM/EXO1 (proteína da síndrome de Bloom/exonuclease 1) ou BLM/DNA2 (replicação de DNA atp-dependente helicase/nuclease)^{18,19,20,21,22}. A ressecção final do DNA é aprimorada pela CtIP (Proteína Interagindo com ADCBP) através de sua interação direta com o complexo MRN²³ e recrutamento do BRCA1 (proteína de suscetibilidade tipo 1 do câncer de mama)^24,25. Proteína de replicação A (RPA) se liga prontamente ao ssDNA exposto e, em seguida, é deslocada pela proteína recombinase RAD51 para formar um filamento nucleoproteína que catalisa a busca homólogo e a invasão de fios^26,,27,28.

O início da ressecção é um passo crítico para a escolha do caminho de reparo. Uma vez iniciada a ressecção, as extremidades do DNA tornam-se substratos pobres para ligação pelo heterodimer Ku70/Ku80 (componente da via NHEJ) e as células são comprometidas com o HR^17,,29,30. O heterodimer Ku70/Ku80 se liga aos fins do DSB, recrutando DNA-PKcs e p53 Binding Protein 1 (53BP1)^29,30. O 53BP1 atua como uma barreira à ressecção no G1, bloqueando assim o RH ao promover a NHEJ^31,32, mas é removido de forma dependente do BRCA1 na fase S, permitindo, consequentemente, que ocorra a ressecção^33,34. Portanto, 53BP1 e BRCA1 desempenham papéis opostos no reparo do DSB, sendo 53BP1 um facilitador NHEJ enquanto o BRCA1 atua permitindo que as quebras sejam reparadas pelo RH.

Em laboratório, a formação de DSB pode ser induzida por radiação ionizante (IR). Enquanto este exemplo utiliza uma alta dose de 4 Gy, 1 Gy e 2 Gy também criam uma quantidade significativa de DSBs, adequado para a análise da formação de focos por proteínas abundantes. É importante notar que o tipo e a dose de radiação utilizada podem levar a diferentes lesões no DNA e na célula: enquanto o IR induz DSBs, também pode causar quebras de fios únicos ou modificação de base (ver^35,36 para uma referência sobre transferência de energia linear de irradiação (LET) e tipo de dano de DNA). Para determinar a cinética da formação de focos induzidos por radiação ionizante (IRIF) e sua desobstrução, que indicam reparação dos danos e reversão da formação ativada de DDR^8,,9,,37,,38, os focos podem ser monitorados em diferentes pontos de tempo após a radiação ionizante. O tempo de ativação e liberação de todas as principais proteínas de dano de DNA é conhecido^{como 39}, e muitos são investigados como marcadores substitutos de eventos-chave. Por exemplo, pRPA, que possui alta afinidade com ssDNA é usado como substituto da ressecção de quebra, proteínas MRN (MRE11, RAD50, NBS1) e exonucleases também podem ser usadas para avaliar a eficiência da ressecção. Enquanto rad51, BRCA1, BRCA2 (proteína de suscetibilidade ao câncer de mama tipo 2) e PALB2 (parceiro e localizador do BRCA2) podem ser monitorados para avaliar a eficiência do RH, a presença das proteínas Ku ou 53BP1, são utilizados como marcadores do NHEJ (Figura 1).

À medida que as proteínas das máquinas de reparação de DNA recrutam umas às outras para a quebra e montagem em superconsetos, as interações DNA-proteína e proteína-proteína podem ser inferidas seguindo sua localização individual ao longo do tempo e analisando a co-localização de proteínas, conforme visualizado por sinais sobrepostos na célula^40,,41,,42. Nas linhas celulares, a introdução de mutações pontuais ou exclusão em genes específicos de reparação de DNA, seja através da edição de genomas, ou pela superexpressão de mutantes à base de plasmídeos, permite a investigação de resíduos específicos e seu possível papel no reconhecimento de danos de DNA (por exemplo, co-localização com γH2AX) ou montagem complexa (co-localização com outra, ou várias proteínas), bem como seu impacto na reparação do DNA. Aqui, usamos a imunofluorescência indireta como meio para investigar a formação e resolução de DSBs seguindo os focos γH2AX ao longo do tempo. Também apresentamos um exemplo de formação de focos e análise de co-localização por um dos principais players no reparo de DSB: p53 Binding Protein 1 (53BP1)³². Como mencionado anteriormente, 53BP1 é considerado central para a escolha da via de reparação de DNA. Após o acúmulo de 53BP1 e sua co-localização com γH2AX fornece informações preciosas sobre a fase de ciclo celular, acúmulo de danos de DNA e via usada para reparar DSBs. O objetivo da imunolocalização indireta é avaliar a eficiência da reparação de danos do DNA nas linhas celulares, seguindo o IR como neste estudo, ou após a exposição a várias tensões na célula, desde o cruzamento de DNA até o bloqueio do garfo de replicação (uma lista de agentes nocivos ao DNA é fornecida na Tabela 1).

Figura 1: DNA quebra o fio duplo (DSB) caminhos de reparo.
O reparo do DSB envolve duas vias principais: Recombinação Homologous (RH, à esquerda) e End-Joining Não Homólogo (NHEJ, à direita). Após a quebra, as proteínas são ativadas para marcar a quebra (γH2AX), participar da ressecção final (MRN), revestir o ssDNA ressecado (pRPA), promover a recombinação (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) ou limitar a ressecção e promover o NHEJ (53BP1). Outras proteínas participam da reparação de danos, mas as proteínas listadas são rotineiramente seguidas por imunofluorescência indireta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Agente prejudicial ao DNA	Mecanismo de ação	Dose recomendada
raios-X	Radiação Formação de quebras duplas com alguns efeitos celulares descontrolados	1-4 Gy
36 Íons ar	Radiação Formação de quebras duplas encalhadas	270 keV/μm
α-partículas	Radiação Formação de quebras duplas encalhadas	116 keV/μm
Bleomicina	Inibidor da síntese de DNA	0.4-2 μg/mL
Camptothecin	Inibidor de topoisomerase I	10-200 nM
Cisplatina	Agente alquilante (induzir intrastras e crosslinks)	0,25-2 μM
Doxorrubicina	Agente de intercalação Inibidor de topoisomerase II	10-200 nM
Etoposide	Inibidor de topoisomerase II	10 μM
Hidroxiuréia	Inibidor da síntese de DNA (por reductase ribonucleotídeo)	10-200 μM
Metano-metil	Agente alquilante	0,25-2 mM
Mitomicina C	Agente alquilante	0,25-2 μM
Luz ultravioleta (UV)	Formação de dimers de timmidina (gerando distorção da cadeia de DNA)	50-100 mJ/cm2

Tabela 1: Agentes genotóxicos. Exemplos de agentes nocivos do DNA, seu mecanismo de ação e os danos induzidos com base na concentração de trabalho sugerida.

Protocolo

1. Cultura celular HeLa

1. As tampas de vidro redondo pré-tratamento com 1 M HCl a 50 °C durante 16-18 horas. Enxágüe com ddH₂O e armazene 100% EtOH.
2. Prepare o meio de cultura celular: adicione 10% (v/v) FBS ao meio DMEM.
3. Cresça 4,0 x 10⁴ células/bem em placa estéril de 12 poços com uma tampa de vidro redonda de 18 mm a 37 °C e 5% de CO₂ em uma incubadora umidificada. Aumentar as células para 80% de confluência (aproximadamente 24 horas).

2. Tratamento celular com radiação (IR)

1. Para induzir a formação de quebras de dois fios, exponha as células a 4 Gy γ-irradiação (controle: Sem irradiação, t=0). Na Célula Gama -40, isso corresponde a 4,54 min, a 0,815 Gy por minuto.
2. Incubar células a 37 °C e 5% de CO₂ em uma incubadora umidificada para o período de tempo adequado (pontos de tempo escolhidos aqui t=1, 2, 4, 16 h).

3. Extração nuclear e fixação celular

1. Preparar soluções de estoque: 0,2 M PIPES (pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M de sacarose, 1 M MgCl₂, 0,1 M EGTA (pH 8.0).
2. Prepare o tampão de extração nuclear (NEB): dissolver tubos de 10 mM (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM de sacarose, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA (pH 8.0) e 0,5% (v/v) Triton X-100 no ddH₂O. Mix até dissolver completamente.
3. Prepare 4% (v/v) paraformaldeído (PFA): dissolver 10 mL de solução aquosa PFA de 16% pfa em PBS de 30 mL. Misture até dissolver completamente.
4. No momento apropriado (t=0, 1, 2, 4, 16 h), lave as células duas vezes com 1 mL de PBS. Remova completamente o PBS.
5. Adicione 200 μL de NEB a cada poço para extração de núcleos celulares (citoplasma é degradado, apenas núcleo permanece)(Figura 2). Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente e remover completamente.
   NOTA: Não exceda 2 minutos.

Figura 2: Extração nuclear.
Imagens representativas de células antes (esquerda) e extração nuclear pós (direita). O citoplasma deve ser digerido, mas a estrutura nuclear deve permanecer intacta após a extração (à direita). (A) ampliação de 20x; barra de escala = 20 μm e (B) 40x de ampliação; barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Lave as células com 1 mL de PBS. Remova completamente o PBS. Adicione PBS cuidadosamente, as células são muito frágeis nesta etapa.
7. Adicione 200 μL de 4% (v/v) PFA a cada poço para fixação celular. Incubar por 10 minutos a 4 °C. Remova a PFA completamente.
8. Adicione 1 mL de PBS.
   NOTA: As células podem ser armazenadas em PBS a 4 °C.

4. Mancha de imunofluorescência

1. Prepare a solução de bloqueio: dissolva 5% de BSA (w/v) no PBS e adicione 0,3% (v/v) Triton X-100. Misture até dissolver completamente.
2. Prepare o tampão de diluição: dissolva 1% de BSA (w/v) no PBS e adicione 0,3% (v/v) Triton X-100. Misture até dissolver completamente.
3. Para o bloqueio, adicione 200 μL de solução de bloqueio a cada poço. Incubar por 2 horas em temperatura ambiente ou 16-18 horas a 4 °C.
   NOTA: Se o anticorpo de cabra for usado, adicione 5% de soro de cabra à solução de bloqueio.
4. Diluir o anticorpo primário no tampão de diluição (1:500; ver tabela 2 para lista de anticorpos) e vórtice até ficar bem misturado.
   NOTA: Se for usado anticorpo de cabra, adicione 1% de soro de cabra ao tampão de diluição.
5. Em uma caixa de umidade/incubação, adere a um pedaço de parafilm. Adicione 10 μL de anticorpo primário (em uma única gota). Alinhe uma borda da tampa com a gota e lentamente abaixe para o parafilme, para que o líquido se espalhe por toda parte (evite bolhas, se possível). Incubar por 2 horas em temperatura ambiente.
6. A lavagem cobre deslizamentos três vezes em PBS por 1 minuto.
7. Diluir anticorpo secundário no tampão de diluição (concentração final: 2 μg/mL) e vórtice até ficar bem misturado.
8. Aplique 10 μL de anticorpo secundário conforme descrito para os anticorpos primários. Incubar por 2 horas em temperatura ambiente.
   NOTA: Proteja contra a luz.

Anticorpo	Empresa	Referência	Fonte
53BP1	Sinalização celular	4937	Coelho
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150103	Burro
Anti-fosfo-Histone H2A. X (Ser139), clone JBW301	Miliporo	05-636	Mouse
Anti-Coelho IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150081	Cabra

Tabela 2: Anticorpos utilizados. Lista de anticorpos utilizados neste estudo.

9. A lavagem cobre deslizamentos três vezes em PBS por 1 minuto.
10. Lave as tampas com H₂O por 1 minuto.
11. Contra-reter DNA com DAPI: aplicar 10 μL de 300 nM DAPI (como descrito para anticorpos), incubar por 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, montar em lâmina de vidro com uma mídia de montagem baseada em glicerol. Alternativamente, adicione uma gota (10 μL) de mídia comercial de montagem antifade contendo DAPI em um slide e aplique um deslizamento de tampa. Pressione suavemente a mancha de cobertura e remova o excesso de fluido ao seu redor com uma toalha de papel.
12. As tampas do selo com esmalte transparente e deixe-as secar por 20 minutos.
13. Armazenar slides a 4 °C.

5. Aquisição de imagens

1. Coloque uma gota de óleo de imersão na lente objetiva de 60x. Use DAPI para localizar os núcleos através da peça ocular.
   1. Para aquisição de imagens XYZ, software de aquisição aberto e parâmetros selecionados: Tipo de scanner: Galvano; Modo scanner: Ida e volta; Tamanho da imagem: 512×512; Modo PMT: VBF; Média pmt: quadro (4 vezes); Varredura sequencial pmt: linha.
   2. Selecione o corante e os detectores:
      Canal (CH1), Corante (DAPI), Detector (SD1)
      Canal (CH2), Corante (Alexa Fluor 488), Detector (HSD3)
      Canal (CH3), Corante (Alexa Fluor 647), Detector (HSD4)
   3. Selecione ON em "Z".
2. Ajuste a imagem ao vivo. Pressione o botão Viver na janela Ao Vivo.
   1. Ajuste o foco e ajuste a intensidade do laser (%), sensibilidade (HV), ganho e deslocamento na janela da ferramenta "PMT".
      1. Ajuste a intensidade do laser (%): para brilho e branqueamento. Quanto maior a intensidade do laser, mais forte o sinal, mas o espécime irá fotobleach.
      2. Ajuste a sensibilidade (HV): nível de ruído. Quanto maior o HV, mais forte o sinal, mas a imagem será ruidosa se muito alta.
         NOTA: Mantenha sempre a tensão constante.
      3. Ajuste o deslocamento: nível de fundo.
   2. Selecione Start/End (15 fatias) para pilhas Z.
3. Comece a aquisição.
   1. Selecione a pasta para salvar imagens. Pressione o botão LSM Start para começar a adquirir a imagem. Pressione o botão Series Done para concluir a aquisição da imagem.

6. Análise de dados

1. Para análise de imagens, abra o software de análise.
   1. Pressione a janela da ferramenta Batch, selecione as imagens para analisar e selecione a pasta de saída.
   2. Pressione a janela da ferramenta Análise e selecione Projeção (exibirá a projeção de intensidade máxima de 15 fatias).
   3. Na configuração Entrada/Saída,selecione o lote criado.
   4. Pressione processo para que as imagens sejam processadas.
   5. Exportar imagens como arquivos .tiff.
2. Para quantificação de focos nucleares, abra cellprofiler.
   1. Abra o pipeline de quantificação de focos γH2AX e 53BP1 (ver informações suplementares).
   2. Dados de gráficos usando um software de tabela.
3. Para análise de co-localização, abra cellprofiler.
   1. Abra o gasoduto colocalização (ver informações suplementares). Um arquivo de planilha será criado e salvo no local preferido. No entanto, os gráficos em si não serão salvos automaticamente. Sugere-se tirar uma foto das janelas para manter o registro dos resultados.
   2. Dados de gráficos usando um software de tabela.

Resultados

No dia 2, ou 24 h postando células em tampas, as células sofreram uma divisão e são 80% confluentes. Derrubadas específicas ou mutações em proteínas de reparação de DNA podem aumentar o tempo de duplicação, ou sensibilizar as células para o tratamento genotoxico, e a densidade de semeadura, bem como as doses de tratamento devem ser ajustadas em conformidade. Para determinar as melhores condições de trabalho, o tempo da resposta aos danos no DNA pode ser estabelecido pela mancha ocidental de γH2AX ao longo...

Discussão

A análise do tempo e eficiência do reparo de danos no DNA por microscopia tem se mostrado essencial para entender como funciona o maquinário de reparação de DNA, em células normais e em patologias humanas como o câncer.

O desenvolvimento de anticorpos específicos que permitem a detecção de proteínas ativadas em sua versão fosfoilada (como γH2AX, pRPA, pRAD50 e outros^10,23,39,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips)	Neuvitro	NC0308920	Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate]	Gibco	11965118	Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Research Products International	E57060	Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	104370028	The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2)	Research Products International	M24000	Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Research Products International	P40150	Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	S36973	300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl)	Research Products International	S23020	Nuclear extraction buffer.
Sucrose	Research Products International	S24060	Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells	Costar	3513	Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red	Gibco	12604021	Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red	Gibco	15400054	TrypLE can be used instead.