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Resumo

Este protocolo descreve a purificação de tubulinas a partir de fontes de pequena/média escala, como células cultivadas ou cérebros de camundongos únicos, usando ciclos de polimerização e despomerização. A tubulina purificada é enriquecida em isótipos específicos ou tem modificações pós-transacionais específicas e pode ser usada em ensaios de reconstituição in vitro para estudar dinâmicas e interações de microtúbulos.

Resumo

Um aspecto importante dos estudos do citoesqueleto microtúbulo é a investigação do comportamento microtúbulo em experimentos de reconstituição in vitro. Permitem a análise das propriedades intrínsecas dos microtúbulos, como a dinâmica, e suas interações com proteínas associadas a microtúbulos (MAPs). O "código tubulina" é um conceito emergente que aponta diferentes isótipos de tubulina e várias modificações pós-transacionais (PTMs) como reguladores de propriedades e funções de microtúbulos. Para explorar os mecanismos moleculares do código tubulina, é crucial realizar experimentos de reconstituição in vitro usando tubulina purificada com isótipos específicos e PTMs.

Até hoje, isso foi tecnicamente desafiador como tubulina cerebral, que é amplamente utilizada em experimentos in vitro, abriga muitos PTMs e tem uma composição de isótipo definida. Assim, desenvolvemos este protocolo para purificar tubulina de diferentes fontes e com diferentes composições isótipos e PTMs controlados, utilizando a abordagem clássica dos ciclos de polimerização e despomerização. Em comparação com os métodos existentes baseados na purificação da afinidade, essa abordagem produz tubulina pura e competente para polimerização, uma vez que a tubulina resistente à polimerização ou despomerização é descartada durante as sucessivas etapas de purificação.

Descrevemos a purificação da tubulina das linhas celulares, cultivadas em suspensão ou como culturas aderentes, e de cérebros de camundongos únicos. O método descreve pela primeira vez a geração de massa celular tanto em configurações de suspensão quanto aderentes, a etapa de lise, seguida pelos sucessivos estágios de purificação da tubulina por ciclos de polimerização-despomerização. Nosso método produz tubulina que pode ser usada em experimentos que abordam o impacto do código tubulina nas propriedades intrínsecas de microtúbulos e interações microtúbulas com proteínas associadas.

Introdução

Os microtúbulos desempenham papéis críticos em muitos processos celulares. Eles dão às células sua forma, constroem fusos meioticos e mitóticos para segregação de cromossomo, e servem como trilhas para o transporte intracelular. Para desempenhar essas diversas funções, os microtúbulos se organizam de diferentes formas. Uma das questões intrigantes no campo é entender os mecanismos moleculares que permitem que os microtúbulos conservados estrutural e evolutivamente se adaptem a essa infinidade de organizações e funções. Um mecanismo potencial é a diversificação de microtúbulos, que é definido pelo conceito conhecido como 'código tubulina'1,2,3. O código da tubulina inclui dois componentes principais: incorporação diferencial de produtos genéticos α e β-tubulin (isótipos de tubulina) nos microtúbulos e modificações pós-translationais de tubulina (PTMs).

Desde a década de 1970, experimentos de reconstituição in vitro, combinados com técnicas de microscopia de luz em evolução, abriram caminho para importantes descobertas sobre as propriedades dos microtúbulos: instabilidade dinâmica4 e esteira5, e seus outros mecanismos e funções6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Quase todos os experimentos in vitro realizados até agora foram baseados em tubulina purificada do tecido cerebral usando ciclos repetidos de polimerização e despomerização16,17. Embora a purificação do tecido cerebral confere a vantagem de obter tubulina de alta qualidade em grandes quantidades (geralmente quantidades gramais), uma desvantagem importante é a heterogeneidade como tubulina purificada do tecido cerebral é uma mistura de diferentes isótipos de tubulina e é enriquecida com muitos PTMs de tubulina. Essa heterogeneidade torna impossível delinear o papel de um determinado tubulin PTM ou isótipo no controle de propriedades e funções de microtúbulos. Assim, produzir tubulina competente para montagem com PTMs de tubulina controlada e composição homogênea do isótipo é essencial para abordar os mecanismos moleculares do código tubulina.

Recentemente, uma abordagem para purificar a tubulina por cromatografia de afinidade usando o domínio TOG (gene ultraexpresso de tumor) do domínio de levedura Stu2p foi desenvolvida18. Neste método, a tubulina em lises brutas de células ou tecidos é passada através de uma coluna onde se liga ao domínio TOG imobilizado de matriz, que permite a análise de toda a piscina de tubulina de uma determinada, mesmo muito pequena, amostra. Uma abordagem muito esperada para purificar a tubulina recombinante também foi descrita nos últimos anos. Baseia-se no sistema de baculovírus, no qual um vetor bi-cistrônico contendo genes α e β-tubulina é expresso em células de insetos19. No entanto, este método é muito complicado e demorado e, portanto, é usado principalmente para estudar o impacto das mutações de tubulina20 e isótipos de tubulina21,22,23 in vitro.

No protocolo atual, descrevemos um método que utiliza a abordagem de polimerização-despolimerização bem estabelecida e amplamente utilizada como um projeto para gerar tubulina com diferentes níveis de modificação, seja a partir de linhas celulares ou do tecido cerebral do rato24. Neste procedimento, a tubulina é ciclo entre o solúvel (tubulin dimer a 4 °C) e a forma polimerizada (microtúbulo a 30 °C na presença de guanosina 5'-triphosphate [GTP]). Cada forma é separada através de sucessivas etapas de centrifugação: os dimers de tubulina permanecerão no supernascer após um giro frio (4 °C), enquanto os microtúbulos serão pelotados a 30 °C. Além disso, uma etapa de polimerização é realizada na alta piperazina-N,N'-bis (2-ácido etanolfônico) (PIPES), que permite a remoção de proteínas associadas a microtúbulos dos microtúbulos e, portanto, da tubulina finalmente purificada. Tubulin purificado de células HeLa S3 cultivadas como culturas suspensas ou aderentes está virtualmente livre de qualquer tubulina PTM e tem sido usada em recentes experimentos de reconstituição in vitro25,26,27,28. Adaptamos ainda mais o método para purificar tubulina de cérebros de camundongos únicos, que podem ser usados para um grande número de modelos de mouse com alterações em isótipos de tubulina e PTMs.

No protocolo, descrevemos pela primeira vez a geração do material de origem (massa celular ou tecido cerebral), sua lise (Figura 1A),seguida dos sucessivos passos de polimerização e despomerização da tubulina para purificar a tubulina (Figura 1B). Descrevemos ainda o processo para avaliar a pureza (Figura 2A,B) e a quantidade(Figura 3A,B) da tubulina purificada. O método pode ser adaptado para produzir tubulina enriquecida com um PTM selecionado, superexpressando uma enzima modificadora em células antes da purificação da tubulina(Figura 4B). Alternativamente, enzimas modificadoras de tubulina podem ser adicionadas à tubulina durante o processo de purificação. Finalmente, podemos purificar tubulinas sem isótipos específicos ou PTMs do cérebro de camundongos deficientes nas enzimas correspondentes modificadoras de tubulina(Figura 4B)29.

O método que descrevemos aqui tem duas principais vantagens: (i) permite a produção de quantidades suficientemente grandes de tubulina em um tempo relativamente curto, e (ii) gera tubulina pura e de alta qualidade, com composição específica de isótipo de tubulina ou PTMs. No vídeo associado deste manuscrito, destacamos algumas das etapas críticas envolvidas neste procedimento.

Protocolo

O cuidado e o uso dos animais para este estudo foram realizados de acordo com as recomendações da Comunidade Europeia (2010/63/UE). Os procedimentos experimentais foram especificamente aprovados pelo comitê de ética do Institut Curie CEEA-IC #118 (autorização nº 04395.03 dada pela Autoridade Nacional) em conformidade com as diretrizes internacionais.

1. Preparação de reagentes para purificação de tubulina

NOTA: Todos os tampões utilizados para a purificação de tubulina devem conter sais de potássio e não sais de sódio30.

  1. Prepare 1 L de meio completo: médio águia modificado de Dulbecco (DMEM), com soro bovino fetal de 10% (FBS, 100 mL), 200 mM L-glutamina (10 mL de estoque de 2 M) e 1x penicilina-estreptomicina (10 mL de 100x de estoque). Armazenar a 4 °C.
  2. Prepare 10 M hidróxido de potássio (KOH) dissolvendo 140 g de KOH na água, ajuste o volume final para 250 mL e armazene à temperatura ambiente.
  3. Prepare 0,5 M de ácido tetraáctico de etilenodiamina (EDTA), pH 8, dissolvendo 36,5 g de EDTA na água, ajuste o pH para 8,0 usando KOH (caso contrário, EDTA não se dissolverá) e o volume final para 250 mL, esterilizador de filtro e armazenar à temperatura ambiente.
  4. Prepare 5 mM de salina tamponada com fosfato (PBS)-EDTA adicionando 5 mL de 0,5 M EDTA a 500 mL de PBS, esterilizador de filtro e armazenar à temperatura ambiente.
  5. Prepare 0,5 M K-PIPES, pH 6.8, dissolvendo 75,5 g de PIPES na água, ajuste ao pH 6.8 com KOH (caso contrário, a PIPES não se dissolverá) e o volume final para 500 mL, esterilizar filtros e armazenar a 4 °C.
  6. Prepare 1 M K-PIPES, pH 6.8, dissolvendo 15,1 g de PIPES na água, ajuste ao pH 6.8 com KOH e o volume final de 50 mL, esterilize o filtro e armazene a 4 °C.
  7. Prepare 0,5 M de potássio-etileno glycol-bis (β-aminoetil éter)-N,N,N′,N′,N′--ácido tetraacético (K-EGTA, pH 7.7) dissolvendo 47,5 g de EGTA na água, ajuste ao pH 7.7 com KOH e o volume final de 250 mL, esterilizar filtros e armazenar à temperatura ambiente.
  8. Prepare BRB80 (80 mM K-PIPES, solução pH 6.8; 1 mM K-EGTA; solução de cloreto de magnésio de 1 mM [MgCl2]) misturando 3,2 mL de 0,5 M PIPES, 40 μL de 0,5 M K-EGTA e 20 μL de 1 M MgCl2 e ajuste o volume final para 20 mL. Armazenar a 4 °C.
  9. Prepare 0,1 M de flúor fenilmetanosulfonil (PMSF) dissolvendo 435 mg de PMSF em isopropanol para obter um volume final de 25 mL e armazenar a -20 °C.
  10. Prepare a mistura de inibidores de protease (200x) dissolvendo 10 mg de aprotinina, 10 mg de leupeptina e 10 mg de 4-(2-aminoetil)-fluoreto de benzenosulfonil na água para obter um volume final de 2,5 mL, fazer alíquotas de 100 μL e armazenar a -20 °C.
  11. Prepare 10% Triton X-100 misturando 5 mL de Triton X-100 em 45 mL de água, esterilizar filtros e armazenar à temperatura ambiente.
  12. Prepare o tampão de lysis (BRB80 suplementado com 1 mM 2-mercaptoetanol, 1 mM PMSF, 1x mistura de inibidores de protease e, opcionalmente, para células HEK-293, 0,2% Triton X-100) no dia da purificação de tubulina misturando 20 mL de BRB80 com 1,5 μL de 2-mercaptoethanol, 200 μL de 0,1 M PMSF, 100 μL dos inibidores de protease mix e, opcionalmente para HEK-293 células , 400 μL de 10% Triton X-100.
    NOTA: 2-mercaptoetanol é tóxico e deve ser usado no capô da fumaça.
  13. Prepare 0,2 M GTP dissolvendo 1 g de GTP em 9,5 mL de água, ajuste o pH para 7,5 usando KOH, faça alíquotas de 20 μL e armazene a -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelamento.
  14. Prepare 1 M tris (hidroximetila) aminometano-cloridrato (Tris-HCl) dissolvendo 60,56 g de Tris na água, ajuste ao pH 6.8 com HCl, completo a um volume final de 500 mL, esterilizador de filtros e armazenar à temperatura ambiente.
  15. Prepare 5x tampão amostral laemmli (450 mM dithiothreitol (DTT); 10% de dodecylsulfato de sódio (SDS); 400 μM Tris-HCl, pH 6.8; 50% glicerol; ~0,006% azul bromofenol) adicionando 4 g de SDS a 16 mL de 1 M Tris-HCl pré-aquecido, pH 6.8, e misturar a solução suavemente. Adicione 2,6 g de DTT e 20 mL de 100% glicerol à mistura e mexa até que a solução se torne homogênea. Adicione a quantidade desejada de azul bromofenol (2,5 mgs) para atingir a intensidade de cor necessária. Faça alíquotas de 5 mL e armazene a -20 °C. Prepare a solução de trabalho 2x do tampão amostral de Laemmli diluindo o estoque de 5x em água destilada.

2. Fontes de amplificação e colheita de tubulina

NOTA: Neste protocolo, foram utilizadas três fontes de tubulina: (i) células (HeLa S3 e HEK-293) cultivadas como culturas de suspensão; (ii) células cultivadas como culturas aderentes (HEK-293, HeLa e U2 OS); e (iii) tecido cerebral do rato. Este protocolo considera o dia da purificação da banheira como "dia 0" e, consequentemente, outras etapas foram descritas em relação ao dia 0.

  1. Amplificação de Células
    1. Células cultivadas como culturas de suspensão
      NOTA: Para purificar com sucesso a tubulina das culturas de suspensão, use pelo menos 2 L de cultura de suspensão.
      1. Para 2 L de cultura de suspensão, reviva e cresça o tipo celular preferido para obter 6 × 107 células 10 dias antes do dia da preparação. No dia -10, células de placa em seis pratos de 15 cm de diâmetro a 107 células por placa.
      2. No dia -8, pré-aqueça a quantidade necessária de média completa a 37 °C. Adicione 1 L de meio pré-aquecido a cada garrafa giratória em condições estéreis. Coloque os rotadores em uma mesa de agitação a 20-25 rpm dentro da incubadora de cultura celular, abra ligeiramente as tampas laterais giratórias para permitir que o meio se equilibre com a atmosfera da incubadora.
        NOTA: Para evitar qualquer contaminação, limpe completamente a superfície externa da mídia e das garrafas giratórias usando 70% de etanol.
      3. No dia -7, o trippsinize e colete as células cultivadas para 80-90% de confluência (aproximadamente 1,8 × 108 células). Recolher células de 3 pratos de cada vez, girar para baixo (200 × g, 5 min, temperatura ambiente) e suspender todas as células em 10 mL de DMEM.
        NOTA: A dissociação completa das células neste momento é muito importante para evitar a formação de agregados maiores nas garrafas giratórias, o que afeta a sobrevivência celular e resulta em baixo rendimento de tubulina.
      4. Adicione 5 mL da suspensão da célula a cada garrafa giratória contendo 1 L de DMEM, devolva os spinners à mesa de agitação na incubadora de cultura celular e permita que as células cresçam por uma semana.
    2. Células cultivadas como culturas aderentes
      NOTA: Para purificar com sucesso a tubulina de células aderentes, use um mínimo de 10 pratos de 80 a 90% de confluência.
      1. Reviva e amplie o tipo de célula desejada para obter 1 × 108 células três dias antes do dia da preparação da tubulina.
      2. No dia -3, emplaque essas células em dez pratos de 15 cm a 1 × 107células por prato e permitem que elas cresçam de 80 a 90% de confluência.
      3. No dia -1, se necessário, transfectam células com um plasmídeo para expressar uma enzima modificadora de tubulina ou um isótipo de tubulina particular.
  2. Colhendo as células/tecido cerebral
    1. Células cultivadas como culturas de suspensão
      1. Transfira a suspensão celular dos rotadores em garrafas de centrífugas de 1 L(Tabela de Materiais) e células de pelotas a 250 × g, 15 min, temperatura ambiente. Para iniciar imediatamente outra cultura de células HeLa S3 nas garrafas giratórias, deixe 100 mL de suspensão celular nos spinners e adicione 1 L de DMEM completo e pré-aquecido à garrafa giratória.
        NOTA: Verifique cuidadosamente se há contaminação bacteriana antes de prosseguir para a purificação da banheira.
      2. Resuspend células pelleted de cada garrafa de centrífuga em 10 mL de PBS gelado, e transferir todas as células para tubos de tampa de parafuso de 50 mL. Durante a suspensão, mantenha as células no gelo. Pelota as células a 250 × g, 15 min, 4 °C.
        NOTA: Siga as recomendações para limpeza e armazenamento de garrafas rotadores (ver Tabela de materiais).
      3. Descarte o supernatante e determine o volume da pelota celular. A partir de 2 L de cultura de suspensão (duas garrafas giratórias), espere uma pelota de celular de 5-6 mL.
        NOTA: No protocolo descrito abaixo, o volume de pelotas de célula é presumido ser de 10 mL. Ajuste o experimento de acordo com os volumes de pelotas.
      4. Adicione 1 volume (10 mL) de tampão de lise e suspenda a pelota da célula.
        NOTA: A razão do volume de pelotas celulares para o volume de tampão de lise é muito importante para a purificação bem sucedida da tubulina. Adicionar mais tampão de lise diminui a concentração de tubulina, que então não alcança a concentração crítica necessária para a polimerização, reduzindo consideravelmente o rendimento da tubulina.
        NOTA: As células resuspendadas no tampão de lise podem ser congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C por dois meses.
    2. Células cultivadas como culturas aderentes
      NOTA: As células de culturas aderentes devem ser colhidas muito rapidamente para a purificação bem sucedida da tubulina (aproximadamente 15 minutos para a colheita de dez pratos de 15 cm). Três pessoas participaram desta etapa do protocolo.
      1. Retire o meio de pratos de 15 cm inclinando os pratos e, em seguida, lave suavemente as células com 7 mL de PBS-EDTA à temperatura ambiente (pessoa 1). Trabalhe apenas com três pratos de 15 cm de cada vez para evitar deixar as células sem meio ou tampão.
      2. Adicione 5 mL de PBS-EDTA às células e incuba-as por 5 minutos a temperatura ambiente.
      3. Use um levantador de células para desprender suavemente as células, empurrando-as para uma borda do prato (pessoa 2), e colete todas as células em um tubo de tampa de parafuso de 50 mL (pessoa 3). Enxágüe cada prato com um adicional de 2 mL de PBS-EDTA para coletar quaisquer células restantes dos pratos. Durante esta etapa, mantenha o tubo de tampa de parafuso de 50 mL contendo a suspensão celular no gelo.
      4. Pelota as células a 250 × g, 10 min, 4 °C. Descarte o supernatante e determine o volume da pelota celular. Espere um volume de ~1 mL de dez pratos de 15 cm.
        NOTA: No protocolo descrito abaixo, o volume de pelotas de célula é presumido ser de 10 mL. Ajuste os experimentos de acordo com os volumes de pelotas.
      5. Resuspense as células em 1 volume (10 mL) de tampão de lise.
        NOTA: As células resuspensadas no tampão de lise podem ser armazenadas a -80 °C por até dois meses.
    3. Tecido cerebral
      NOTA: Podem ser usados camundongos de qualquer idade, sexo ou antecedentes genéticos. A escolha da cepa de camundongos transgênicos dependerá da questão científica a ser abordada. Neste manuscrito, mostramos o exemplo de tubulina purificada do ttll1-/- mouse, sem uma enzima glutamylating cerebral principal, a proteína tubulin tyrosine ligase-like 1 (TTLL1)31.
      1. Sacrifique o rato por luxação cervical, decapite rapidamente, e colete o cérebro em um tubo de fundo redondo. Se houver excesso de sangue no cérebro, lave rapidamente com tampão de lise. Colete o cérebro assim que o rato for sacrificado como um atraso pós-morte pode afetar o sucesso da purificação da tubulina. Use tubos de fundo redondo para acomodar a largura da sonda usada para homogeneização.
        NOTA: Os cérebros do rato coletado podem ser congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C por até 3 anos.
      2. Adicione 500 μL de tampão de lise a um único cérebro extraído de um rato adulto. Para o resto do protocolo, o volume de tampão de lise adicionado é de 10 mL. Ajuste para o seu experimento de acordo com o número de cérebros a serem usados.

3. Lise de Células ou Tecido Cerebral

  1. Células cultivadas como culturas de suspensão
    1. Para HEK-293, lise as células no gelo, subam e descem repetidamente usando pontas de pipeta de larguras diferentes. Primeiro, conecte uma ponta p1000 a uma pipeta de 10 mL, e pipete a suspensão da célula para cima e para baixo a cada 5 minutos, por 10 minutos (três ciclos de pipetação). Em segundo lugar, conecte uma ponta p200 a uma ponta p1000 e pipeta adicional a cada 5 minutos, por 20 min (cinco ciclos de pipetação).
    2. Para HeLa S3, lise as células usando uma prensa francesa (ver Tabela de Materiais para configurações).
    3. Pegue 1/100do volume do mix de lise (L) (200 μL para 20 mL de L), e adicione o mesmo volume de tampão laemmli 2x, ferva por 5 min e armazene a -20 °C para análise posterior.
  2. Células cultivadas como culturas aderentes
    1. Transfira as células para um tubo de fundo redondo de 14 mL cuja altura foi reduzida para acomodar a sonda sonicator (ver Tabela de Materiais para configurações). Sonicar as células por ~45 pulsos, e confirmar a lise celular, amostrando uma gota da mistura de lise sob um microscópio.
      NOTA: O número de pulsos pode variar de acordo com o tipo de célula usada para a purificação da tubulina. Células sonicantes demais podem causar a precipitação da tubulina e afetarão negativamente o rendimento da purificação.
    2. Pipeta as células para cima e para baixo no gelo a cada 5 minutos por 20 minutos (cinco ciclos de pipetação), usando uma ponta p200.
    3. Pegue 1/100do volume de mistura de lise (L) (200 μL para 20 mL de L) e adicione o mesmo volume de tampão laemmli 2x, ferva por 5 min e armazene a -20 °C para análise posterior.
  3. Tecido cerebral
    1. Lise o tecido cerebral usando um liquidificador de tecido (ver Tabela de Materiais para configurações). Alternativamente, lise o tecido usando um pilão de microtubo ou um equipamento equivalente e pipeta para cima e para baixo no gelo com uma seringa de 1 mL com uma agulha de 18 G.
    2. Pegue 1/100do volume de mistura de lise (L) (200 μL para 20 mL de L), e adicione o mesmo volume de tampão laemmli 2x, ferva por 5 min e armazene a -20 °C para análise posterior.

4. Purificação de Tubulin

  1. Esclarecimento lysate
    1. Limpe o lise (separando pelotas e fração solúvel da mistura de lise) por centrifugação a 150.000 × g, 4 °C, 30 min. Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes sobre rotores e tubos ultracentrifus. Para extratos celulares, uma camada flutuante branca é frequentemente formada após a centrifugação. Não transfira esta camada flutuante junto com a supernasa, pois interfere na polimerização da tubulina. Use uma seringa de volume apropriado presa a uma agulha longa de 20 G ou 21 G para remover suavemente o supernatante sem perturbar a camada flutuante. Se o supernaspeio ainda estiver nublado, centrífuga a 5.000 × g, 4 °C por 10 min.
    2. Transfira o supernatante (SN1) para um tubo ultracentrífivo e observe seu volume. Para uma cápsula de célula de 10 mL, espere um volume de ~12 mL para SN1.
    3. Pegue 1/100do volume de SN1 (120 μL para 12 mL de SN1), e adicione o mesmo volume de tampão laemmli de 2x, ferva por 5 min e armazene a -20 °C para análise posterior.
    4. Resuspene a pelota (P1) em BRB80 (Tabela de Materiais) utilizando o mesmo volume que o SN1. Pegue 1/100do volume de P1 (200 μL para 20 mL de P1), e adicione o mesmo volume de tampão laemmli 2x, ferva por 5 min e armazene a -20 °C para análise suplementar.
  2. Primeira polimerização em buffer de baixa molaridade
    1. Prepare o mix de polimerização combinando 1 volume de SN1 (12 mL), 1/200de volume de 0,2 M GTP (60 μL; concentração final 1 mM) e 0,5 volume de glicerol pré-aquecido (6 mL) em um tubo de tampa de parafuso do volume apropriado.
      NOTA: O glicerol é usado como agente de aglomeração nas etapas de polimerização ao longo do protocolo e, portanto, não é considerado nos cálculos das concentrações de outros componentes.
    2. Pipeta a mistura para cima e para baixo, evitando suavemente a formação de bolhas de ar e transferi-la para os tubos ultracentrifuuge apropriados.
      NOTA: Ao transferir a mistura para os tubos, ajuste o peso dos tubos (em pares). Isso permite que o experimentador prossiga diretamente para a sedimentação de microtúbulos após a etapa de polimerização. Faça isso para todas as etapas de polimerização em todo o protocolo.
    3. Cubra os tubos com parafilm, transfira para um banho de água a 30 °C e incuba por 20 min.
    4. Centrifugar os tubos a 150.000 × g, 30 °C por 30 min. Remova o supernatante (SN2) e mantenha a pelota de microtúbulos polimerizados (P2).
      NOTA: A pelota de microtúbulo pode ser congelada e armazenada a -80 °C por até 1 ano.
    5. Pegue 1/200do volume de SN2 (90 μL para 18 mL SN2) e adicione o mesmo volume de tampão laemmli 2x, ferva por 5 min e armazene a -20 °C para análise suplementar.
  3. Primeira Despolimerização
    1. Despolimerizar microtúbulos adicionando BRB80 gelado à pelota P2, e deixar no gelo por 5 min: para tubulina de células, adicione 1/60 (200 μL) e para tubulina de cérebros, adicione 1/20 (600 μL) do volume do SN1.
      NOTA: O volume de BRB80 gelado adicionado à pelota durante as etapas de despomerização é sempre relativo ao volume de SN1.
    2. Resuspenque a pelota de microtúbulo suavemente, evitando bolhas de ar, até que a solução seja completamente homogênea. Use uma ponta p1000 para um par de ciclos de pipetação seguido de uma ponta p200 a cada 5 minutos, por 20 min (cinco ciclos de pipetação). Este é um passo crucial para o sucesso da purificação da banheira.
    3. Transfira a solução para tubos ultracentrífugas apropriados e gire a 150.000 × g, 4 °C por 20 min. Transfira o SN3 para um novo tubo de ultracentrifuagem de 1,5 mL. A pelota formada após esta etapa de centrifugação (P3) contém proteínas precipitadas (proteínas associadas a microtúbulos ou MAPs) e microtúbulos não descoloridos. O supernatante (SN3) contém componentes solúveis: dimers tubulin despomerizados e MAPs, que se separaram dos microtúbulos despomerizados.
    4. Pegue 1-4 μL de SN3 e adicione 9 volumes de tampão laemmli 2x, ferva por 5 min e armazene a -20 °C para novas análises.
    5. Resuspende a pelota P3 no BRB80 (no mesmo volume de SN3), pegue 1-4 μL e adicione 9 volumes de tampão Laemmli 2x, ferva por 5 min e armazena a -20 °C.
  4. Segunda Polimerização (em Buffer de Alta Molaridade)
    1. Prepare a mistura de polimerização combinando 1 volume de SN3 (200 μL), 1 volume de PIPES pré-aquecidos de 1 M (200 μL, concentração final 0,5 M), 1/100de volume de 0,2 M GTP (2 μL, concentração final 1 mM) e 1 volume de glicerol pré-aquecido (200 μL) em um tubo do volume apropriado.
    2. Pipeta a mistura para cima e para baixo, evitando a formação de bolhas de ar, e transferi-la para tubos ultracentrifuuge.
    3. Cubra os tubos com parafilm, transfira-os para um banho de água a 30 °C e incubar por 20 minutos.
    4. Centrifugar os tubos a 150.000 × g, 30 °C por 30 min. Remova o supernatante (SN4) e mantenha a pelota de microtúbulos polimerizados (P4). A pelota P4 contém os microtúbulos polimerizados, e o SN4 supernatante contém tubulina não polimerizada, MAPs e outras proteínas solúveis.
      NOTA: A pelota de microtúbulo após a segunda etapa de polimerização pode ser congelada e armazenada a -80 °C por até 1 ano.
    5. Pegue 1-4 μL e adicione 9 volumes de tampão laemmli 2x, ferva por 5 min e armazene a -20 °C para novas análises.
  5. Segunda Despolimerização
    1. Despolimerizar microtúbulos adicionando BRB80 gelado à pelota P4, e deixar no gelo por 5 min: para tubulina de células, adicione 1/100 (120 μL) e para tubulina de cérebros, adicione 1/40(300 μL) do volume do SN1.
    2. Pipeta para cima e para baixo com uma ponta p200 a cada 5 minutos, por 20 minutos (cinco ciclos de pipetação).
    3. Transfira a solução para um tubo ultracentrífuga de 1,5 mL e gire a 150.000 × g, 4 °C por 20 min. Transfira o SN5 para um novo tubo de ultracentrifuagem de 1,5 mL. A pelota formada após esta etapa de centrifugação (P5) contém microtúbulos não despomerizados. O supernatante (SN5) contém a tubulina solúvel.
    4. Pegue 1-4 μL e adicione 9 volumes de tampão laemmli 2x, ferva por 5 min e armazene a -20 °C para novas análises.
    5. Resuspende a pelota P5 em BRB80 (mesmo volume de SN5), pegue 1-4 μL e adicione 9 volumes de tampão laemmli 2x, ferva por 5 min e armazene a -20 °C para novas análises.
  6. Terceira Polimerização (em Buffer de Baixa Molaridade)
    1. Prepare o mix de polimerização: 1 volume de SN5 (120 μL), 1/200de volume de 0,2 M GTP (0,6 μL, concentração final é de 1 mM) e 0,5 volume de glicerol pré-aquecido (60 μL) em um tubo do volume apropriado.
    2. Pipeta a mistura para cima e para baixo, evitando suavemente a formação de bolhas de ar, e transferi-la para os tubos ultracentrifuuge apropriados.
    3. Cubra os tubos com parafilm, transfira-os para um banho de água a 30 °C e incubar por 20 minutos.
    4. Centrifugar os tubos a 150.000 × g, 30 °C por 30 min. A pelota (P6) contém microtúbulos polimerizados e o SN6 supernante contém pequenas quantidades de tubulina não polimerizada.
      NOTA: As pelotas de microtúbulos podem ser congeladas e armazenadas a -80 °C por até 1 ano.
    5. Pegue 1-4 μL e adicione 9 volumes de tampão laemmli 2x, ferva por 5 min e armazene a -20 °C para novas análises.
  7. Terceira Depolimerização
    1. Despolimerizar microtúbulos adicionando BRB80 gelado à pelota P6, e deixar no gelo por 5 min: para tubulina de células, adicione 1/100 (120 μL) e para tubulina de cérebros, adicione 1/40(300 μL) do volume do SN1.
    2. Pipeta para cima e para baixo com uma ponta p200 a cada 5 minutos, por 20 minutos (cinco ciclos de pipetação).
    3. Transfira a solução para os tubos de ultracentrifuagem apropriados e gire a 150.000 × g, 4 °C por 20 min. Transfira o SN7 para um novo tubo de ultracentrifuagem de 1,5 mL. A pelota (P7) contém pequenas quantidades de microtúbulos não descolorizados. O supernatante (SN7) contém microtúbulos exclusivamente despomerizados (tubulina solúvel).
    4. Pegue 1-4 μL e adicione 9 volumes de tampão laemmli 2x, ferva por 5 min e armazene a -20 °C para novas análises.
    5. Resuspende a pelota P7 no BRB80 (mesmo volume de SN7), pegue 1-4 μL e adicione 9 volumes de tampão laemmli 2x, ferva por 5 min e armazene a -20 °C para novas análises.
    6. Quantifique a quantidade de tubulina (ver Resultados Representativos) e aliquot SN7 em pequenos volumes, snap-freeze e armazenar a -80 °C.

Resultados

O principal objetivo deste método é produzir tubulina de alta qualidade e competente para montagem em quantidades suficientes para realizar experimentos in vitro repetidos com os componentes purificados. Microtúbulos montados a partir deste tubúnel pode ser usado em ensaios de reconstituição baseados na técnica total de microscopia de reflexão interna (TIRF) com microtúbulos dinâmicos ou estáveis, em experimentos testando dinâmicas de microtúbulos, interações com MAPs ou motores moleculares, e geração de...

Discussão

O método descrito aqui fornece uma plataforma para gerar rapidamente tubulina de alta qualidade e competente para montagem em quantidades médias-grandes de linhas celulares e cérebros de camundongos únicos. Baseia-se no protocolo padrão-ouro da purificação de tubulinas de cérebros bovinos usados no campo por muitos anos16,17. Uma vantagem particular da abordagem é o uso de culturas de suspensão das células HeLa S3, que, uma vez estabelecidas, produzem ...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo ANR-10-IDEX-0001-02, o LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 e o Institut de convergência Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ é apoiado pelo Institut Curie, a Agência Nacional de Pesquisa Francesa (ANR) concede ANR-12-BSV2-0007 e ANR-17-CE13-0021, o Institut National du Cancer (INCA) concede 2014-PL BIO-11-ICR-1, e a Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) concede de desconto deQ20170336756. O MMM é apoiado pela fondation vaincre Alzheimer grant FR-16055p, e pela França Alzheimer grant AAP SM 2019 n°2023. A JAS foi apoiada pelo programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie nº 675737, e a concessão da FRM FDT201904008210. A SB foi apoiada pela subvenção FRM FDT201805005465.

Agradecemos a todos os membros do laboratório Janke, em especial J. Souphron, bem como g. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) e A. Gautreau (Ecole Polytechnique) pela ajuda durante a criação do protocolo. Gostaríamos de agradecer à instalação animal do Institut Curie pela ajuda com a criação e cuidado dos camundongos.

O anticorpo 12G10, desenvolvido por J. Frankel e M. Nelson, foi obtido do Banco hybridoma de estudos de desenvolvimento desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1 M MgCl2 Sigma#M1028
1-L cell culture vesselsTechne F7610 Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol Sigma #M31482-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride Sigma #A8456
40% Acrylamide Bio-Rad #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS)Sigma#A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10 Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowadilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335 AdipoGen #AG-20B-0020dilution: 1/20,000
Aprotinin Sigma #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifugeFor collecting spinner cultures
Biological stirrer Techne MCS-104L Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide Bio-Rad #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax® For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA)Sigma #A7906
Bromophenol blue Sigma #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA)Sigma#C9268Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma #D8418DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium Life Technologies #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol Sigma #D9779
EDTAEuromedex#EU0007-C
EGTASigma #E3889
Ethanol absolute Fisher Chemical #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)Sigma #F7524
French pressure cell press Thermo electron corporation #FA-078Awith a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol VWR Chemicals #24388.295
GlycineSigma#G8898
GTP Sigma #G8877
Heating block Stuart #SBH130D
Hela cells ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells ATCCATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl )VWR#20252.290
Inverted microscope With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol VWR #20842.298
jetPEIPolyplus #101
JLA-8.1000 rotor For collecting spinner cultures
KOH Sigma #P1767KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine Life Technologies #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubesSigma4-16 K 
Leupeptin Sigma#L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
MicropestlesEppendorf#0030 120.973
Mouse brain tissue Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mmTerumo#18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mmTerumo#20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mmB.Braun#466 5643
Parafilm
PBS Life Technologies #14190169
Penicillin-Streptomycin Life Technologies #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)Sigma #P7626PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES Sigma #P6757
Pipette-boy
RotorsBeckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment Bio-Rad #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate VWR #442444HFor preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate Sigma #L5750For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator Branson#101-148-070Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubesEppendorf5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine Sigma#9281
Trichostatin A (TSA)Sigma#T8552
Triton X-100 Sigma #T9284
Trizma base (Tris)Sigma #T1503
Trypsin Life Technologies#15090046
Ultracentrifuge rotors TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotorsSet at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes Beckman#357448 for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes Beckman#349622for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes Beckman#355631 for using with 70.1 Ti rotor
UltracentrifugesBeckmanOptima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent)Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holdersSet at 30°C 

Referências

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