Funcionalização de Compósitos de Prata/Dióxido de Titânio em Revestimentos à Base de Quitosana e seus Desempenhos de Preservação de Ovos

Resumo

Para aumentar a estabilidade e a esterilizabilidade dos revestimentos à base de quitosana e expandir a aplicação de nanopartículas específicas na preservação de alimentos, os compósitos Ag/TiO₂ são sintetizados para funcionalizar os revestimentos de quitosana para preservação de ovos. A morfologia da casca do ovo, a perda de massa, a unidade Haugh e o pH do albúmen são utilizados para caracterizar o desempenho de preservação dos revestimentos.

Resumo

Os ovos são uma excelente fonte de proteínas, minerais e vitaminas, que têm sido popularmente consumidos na dieta diária em todo o mundo. Os microporos e microfissuras nas cascas dos ovos, no entanto, levam à perda de umidade e ao escape de CO_2, resultando na aceleração da deterioração dos ovos e na perda econômica. Para aumentar a estabilidade e a esterilizabilidade dos materiais de revestimento à base de quitosana existentes e desenvolver novos nanocompósitos multifuncionais para preservação antibacteriana e de ovos, compósitos de prata/dióxido de titânio (Ag/TiO₂) são sintetizados e aplicados para modificar a quitosana para prolongar a vida útil do ovo. Imagens de microscópio eletrônico (MEV) são usadas para analisar a estrutura e morfologia de partículas compostas e a morfologia de cascas de ovos revestidas. Os desempenhos de preservação de revestimentos compósitos são avaliados por vários parâmetros: perda de massa, unidade Haugh, pH do albúmen e morfologias da casca do ovo das amostras. A adoção de compósitos Ag / TiO₂ contribui para um efeito sinérgico da quitosana, o que pode prolongar ainda mais o período de preservação. Os desempenhos do revestimento de quitosana, no entanto, são atualmente limitados pelas espécies e concentrações de partículas existentes, o que requer otimização em estudos futuros. Os métodos neste estudo examinam novos materiais de revestimento, que podem ser criados pela adição de nanopartículas específicas ao precursor do revestimento, para obter os efeitos combinativos da nanopartícula e do precursor, bem como para preparar novos revestimentos multifuncionais no campo da preservação de alimentos.

Introdução

Como excelentes e populares fontes de proteína, sal inorgânico e vitaminas, os ovos são fornecedores populares para a nutrição humana, que estão sendo produzidos e consumidos em todo o mundo em larga escala ^1,2. Embora as cascas dos ovos sejam barreiras protetoras naturais, elas são muito frágeis para manter sua integridade durante o transporte e armazenamento dos ovos. As trocas gasosas e a penetração microbiana entre o albúmen do ovo e o ambiente, que podem ocorrer facilmente através de minúsculos poros nas cascas dos ovos, levariam à perda de CO₂, bem como à deterioração da qualidade dos ovos ^3,4. Além disso, pequenas rachaduras nas cascas dos ovos aumentariam o risco de contaminação microbiana. Portanto, métodos eficazes de preservação de óvulos devem ser desenvolvidos com urgência para benefício econômico e saúde humana.

Atualmente, existem dois tipos de rotas para preservação de óvulos. A primeira maneira é desativar os microrganismos nas cascas dos ovos 5,6,7,8. O processo de desativação estende o período de preservação do ovo, limpando a superfície da casca do ovo da erosão de microrganismos ambientais e umidade. Por outro lado, revestir os minúsculos poros e rachaduras na casca do ovo com materiais funcionais específicos também pode servir como um excelente método para evitar a perda de vapor de água e CO₂ do albúmen do ovo, bem como para proteger a casca do ovo da destruição de microrganismos. Por serem simples, eficazes e economizarem energia, os revestimentos estão atraindo cada vez mais atenção para a preservação dos ovos. Os princípios básicos que os materiais de revestimento adequados devem atender são estabilidade química, permeabilidade efetiva, ampla disponibilidade e segurança confiável. Os materiais de revestimento mais amplamente estudados são óleo ^9,10, proteínas¹¹, biopolímeros³ e quitosana¹².

A quitosana tem sido considerada um material de revestimento popular devido às suas excelentes propriedades de formação de filme, atividade antibacteriana e segurança¹³. As alterações físico-químicas dos ovos e a contaminação microbiana provaram ser protegidas por um revestimento de quitosana, que tem servido como uma forma eficiente para a preservação dos ovos. No entanto, como um polímero hidrofílico com baixa barreira ao vapor de água e adsorção de umidade, a quitosana é instável em um ambiente de alta umidade, limitando os efeitos de preservação e reduzindo a vida útil dos ovos até certo ponto.

Para superar esse problema e promover o desempenho de preservação da quitosana, nanopartículas específicas têm sido usadas como adulterantes em revestimentos à base de quitosana. Assim, como um nano enchimento com caráter antibacteriano¹⁴, a nano prata (Ag) foi dopada em quitosana. A adição de Ag pode não apenas aumentar a propriedade de barreira do filme de quitosana, mas também aumentar seu efeito antibacteriano, que comprovadamente melhora o efeito de preservação do revestimento. A fácil agregação e a estrutura simples das partículas de Ag, no entanto, podem diminuir a estabilidade e durabilidade do filme de quitosana, que foram verificadas como melhoradas pela deposição de nanopartículas específicas. O dióxido de titânio (TiO₂) é um composto típico de óxido metálico com excelentes propriedades, como estabilidade química, baixa toxicidade e custos razoáveis. Essas propriedades funcionais conferem ao TiO₂ um grande potencial em muitos campos de pesquisa¹⁵. Por exemplo, as partículas de TiO₂ podem servir como aditivos em dispositivos médicos e biomateriais devido à sua adesividade e atividades bactericidas. A aplicação real das partículas de TiO₂ , no entanto, é amplamente limitada por sua termodinâmica instável e tendências de aglomerados. Portanto, a dopagem de materiais funcionais específicos em TiO₂ foi proposta para alcançar o efeito combinativo de atividade antibacteriana, melhor dispersibilidade e termoestabilidade.

Neste estudo, compósitos antibacterianos Ag/TiO₂ são sintetizados e aplicados em um revestimento de quitosana para preservação de ovos. Imagens de MEV são usadas para analisar a estrutura e morfologia das partículas Ag / TiO₂ e das cascas dos ovos. O desempenho de preservação do revestimento é avaliado e comparado por meio de perda de massa, unidade Haugh, pH do albúmen e morfologias da casca do ovo. Este estudo demonstra a possibilidade e o potencial de revestimentos de quitosana misturados com nanocompósitos na preservação de alimentos.

Protocolo

1. Síntese de compósitos nano Ag / TiO₂

1. Para preparar o sol de nano-prata, combine 100 mL de solução de AgNO₃ , 100 mL de agente protetor e 50 mL de NaBH₄ em um disjuntor de 500 mL.
   1. Misture ácido acético e ácido metanóico (grau analítico) na proporção de volume de 1:1 para obter 100 mL de solução ácida complexa como precursor do agente protetor. Dilua a solução ácida com água deionizada (18 MΩ • cm) a 500 mL como agente protetor.
   2. Adicione a solução de AgNO₃ (0,3 mol / L) no agente protetor resultante sob agitação vigorosa, até que os solutos de AgNO₃ estejam uniformemente dispersos na solução protetora. Adicionar 0,4 g de NaBH₄ para obter o Ag sol bem disperso após reagir a mistura durante 1 h à temperatura ambiente.
      CUIDADO: O tamanho da partícula da nanoprata pode ser ajustado pela concentração do agente protetor e pela taxa de agitação na etapa 1.1.2.
2. Combine Ag em solução de titanato de tetrabutila (TBOT)-etanol sob agitação e, em seguida, adicione 80 mL de catalisador ácido gota a gota.
   1. Combine 500 μL de ácido benzenossulfônico (BA) e ácido acético glacial (AA) para obter a solução mista (BA e AA na proporção de volume de 1:2). Diluir a solução em 100 ml de água desionizada (18 MΩ•cm) para preparar o catalisador ácido.
   2. Adicione o Ag sol resultante na solução pré-dispersa de titanato de tetrabutilo (TBOT)-etanol (2,5 de TBOT em 100 mL de solução de etanol) e agite por 1 h para obter o sol misturado. Em seguida, adicione o sol gota a gota em 80 mL de catalisador ácido e mexa por 4 h a 70 °C.
   3. Agitar continuamente a mistura durante 48 h à temperatura ambiente para obter o compósito Ag/TiO₂ final.
      CÁTION: A agitação vigorosa pode causar respingos de gotas de solução. Use dispositivos de proteção para garantir a segurança, como uma máscara oral-nasal protetora, um avental de laboratório e luvas. Não existe um padrão estrito para a velocidade de rotação nos procedimentos acima mencionados.

2. Preparação do revestimento de quitosana

1. Dissolva a quitosana em ácido acético a 1% (vol) e mexa por 24 h a 25 ° C para preparar a solução de revestimento (certifique-se de que a concentração de quitosana seja de 0,5% (peso) na solução resultante.
2. Adicionar separadamente as partículas de Ag/TiO₂ à suspensão (0, 0,5, 1 e 1,5 g de Ag/TiO₂ em 50 g de solução de quitosana, respetivamente), para obter soluções de 2-quitosana de Ag/TiO_a 0%, 1%, 2% e 3% (em peso), designadas por Ag/TiO 2-CS0, Ag/TiO_2-CS1, Ag/TiO_2-CS2 e Ag/TiO_2-CS3, respectivamente.
   CUIDADO: Não existe um padrão estrito para a velocidade de rotação nos procedimentos acima mencionados.

3. Observação de microscopia eletrônica de varredura (MEV)

1. Corte a casca do ovo experimental em pedaços (dimensões quadradas de cerca de 2-3 mm).
2. Imobilize os pedaços de casca de ovo em um toco de metal com um adesivo condutor (ou seja, fita condutora de carbono dupla face ou outros materiais semelhantes). Use luvas durante a preparação da amostra para evitar qualquer contaminação da amostra pelas mãos. Marque a amostra (por exemplo, com um arranhão em forma de L usando um cortador de caneta de diamante).
3. Como alternativa, aplique um revestimento pulverizado com material condutor (~ 10 nm de espessura) para evitar efeitos de carga.
4. Adquira pelo menos três micrografias SEM de alta resolução (idealmente, um mínimo de cinco) a partir de uma vista superior da amostra. Certifique-se de que cada imagem exiba uma área de pelo menos 25 μm x 25 μm, com uma taxa de resolução de 20 μm. Evite tirar imagens de regiões de superfície com defeitos de superfície macroscópicos.
5. Use os seguintes parâmetros SEM: tensão de operação de 30 kV. A resolução da segunda imagem eletrônica pode chegar a 2 nm usando um canhão de elétrons de emissão de campo em um microscópio eletrônico de varredura de alta qualidade (a densidade de corrente do feixe de íons é de cerca de 10⁵ A / cm²).
6. Observe a posição exata de cada imagem em relação ao marcador em forma de L.

4. Experimentos de preservação de óvulos

NOTA: Os ovos recém-postos são ovos de galinha fornecidos por uma fazenda local em Shenzhen, China.

1. Filtre os ovos experimentais excluindo os ovos com rachaduras, máculas ou areias em suas superfícies para garantir um processo experimental de preservação de ovos propício.
2. Divida os ovos recém-postos em cinco grupos com 30 ovos em cada grupo. Projete os quatro grupos revestidos, que são revestidos pela quitosana, Ag / TiO 2-quitosana dopada com 0%, 1%, 2% e 3% (peso) como Ag / TiO_2-CS0, Ag / TiO_2-CS1, Ag / TiO_2-CS2 e Ag / TiO_2-CS3, respectivamente.
3. Realize o processo de revestimento para imergir os ovos em diferentes soluções de revestimento por 5 min e seque em condições ambientais por 24 h. Defina os ovos lavados com água (WE) como um experimento de controle. Após os tratamentos acima mencionados, conservar os ovos tratados a 25 °C. Pegue os cinco ovos marcados para medir a perda de peso, unidade Haugh, pH do albúmen e morfologias da casca do ovo para avaliar e comparar o desempenho da preservação.
   1. Obtenha a perda de peso (%) do ovo calculando a diferença de peso em porcentagem do ovo em relação ao primeiro dia. Meça o peso dos ovos em cada grupo a cada 5 dias.
   2. Calcule a unidade Haugh para relacionar o peso do ovo com a espessura do albúmen (Equação 1)¹².
      HU = 100 log (H-1,7W^0,37+7,6) (1)
      onde H representa a altura do albúmen (mm) e W representa o peso do ovo (g).
      1. De acordo com o valor da unidade Haugh, classifique os ovos para os graus AA, A e B quando a unidade Haugh de um ovo estiver acima de 72, entre 71-60 e abaixo de 60, respectivamente (os Padrões dos Estados Unidos para Qualidade de Ovos de Casca Individual).
   3. Separe o albúmen da gema e use um medidor de pH digital para medir os valores de pH do albúmen.
   4. Observe as morfologias das superfícies das cascas de ovos usando um microscópio eletrônico de varredura após a pulverização catódica de platina das amostras.
      CATION: As cascas dos ovos são substâncias quebradiças que não suportam impactos violentos. Portanto, tome cuidado para evitar danos às cascas dos ovos. Além disso, os procedimentos na etapa 4.3.4 são os mesmos da etapa 3.

Resultados

O tamanho das partículas dos compósitos Ag/TiO₂ varia de 100 a 300 nm, o que é afetado pelas condições de síntese (Figura 1).

Figura 1: Imagens SEM de partículas compostas Ag / TiO₂ em diferentes proporções de resolução (500 nm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As perdas de peso de diferentes amostras de ovos durante o armazenamento são mostradas na Tabela 1. O aumento contínuo da perda de peso é devido ao escape do albúmen CO₂ e do vapor de água através dos poros das cascas dos ovos, o que leva à deterioração da qualidade dos ovos. As perdas de peso dos ovos WE são muito maiores do que para outros grupos, indicando a capacidade protetora dos revestimentos à base de quitosana para a qualidade dos ovos. Após o revestimento por quitosana, as rachaduras na casca do ovo são visivelmente diminuídas, o que limita a perda de CO₂ e vapor de água.

Tempo de armazenamento (dia)	Perda de peso (% em peso)
	NÓS	Ag/TiO 2-CS0	Ag/TiO 2-CS1	Ag/TiO 2-CS2	Ag/TiO 2-CS3
6	0,78±0,09c	0,69±0,09c	0,53±0,12a	0,49±0,21a,b	0,48±0,06A
11	1,85±0,13 bilhões	1,54±0,18c	1,34±0,15a	1.28±0.13a,b	1,26±0,21a
16	2,53±0,21 bilhões	2,34±0,27c	1,95±0,21 bilhões	1,93±0,35	1,89±0,38
21	4.01±0.25c	3,63±0,32 bilhões	3.21±0.09b	3.18±0.22a	3.09±0.16a
26	4,86±0,34 bilhões	4.18±0.25b	4.09±0.39b	4.05±0.29a	3,98±0,21a,b
31	5.62±0.41a	5.01±0.51b	4.76±0.48UMA	4.69±0.17a	4.58±0.35a
Na mesma linha com diferentes letras sobrescritas são significativamente diferentes.

Tabela 1: A variação da perda de peso de diferentes ovos durante o tempo de armazenamento.

Além disso, os revestimentos de quitosana dopados com partículas de Ag/TiO₂ são mais eficazes na vedação dos poros e na formação de camadas densas, levando a uma perda de peso consideravelmente inibida. Quanto maior a dosagem das partículas de Ag/TiO₂ , mais forte é o efeito do revestimento correspondente para reduzir o CO₂ e a perda de vapor (Figura 2).

Figura 2: Imagens de MEV das superfícies da casca do ovo cru e das superfícies da casca do ovo tratadas com quitosana nos dias 0, 11, 16 e 31. (A) as superfícies cruas da casca do ovo; (B) superfícies de casca de ovo tratadas com quitosana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A unidade Haugh é calculada pelas mudanças relacionadas à idade das proteínas brancas, refletindo a variação do afinamento do albúmen, que está intimamente relacionada à proteólise da proteína e ao pH da albumina. A diminuição mais rápida e os valores invariavelmente mais baixos da unidade Haugh no grupo WE do que nos grupos de revestimento de quitosana indicam a capacidade protetora efetiva da quitosana. Os ovos nos grupos tratados com quitosana mantêm o grau superior A por 26 dias, enquanto o grupo WE se degrada para o grau B após o dia 6. Os valores da unidade Haugh em Ag/TiO 2-CS1 são sempre os mais altos entre todos os grupos tratados, indicando que: (i) a adição de partículas de Ag/TiO₂ contribui para um efeito sinérgico com a quitosana, que são mais eficazes para a estabilização do revestimento e controle bacteriano; enquanto (ii) o excesso de partículas de Ag/TiO₂ destruiria a estrutura em camadas do revestimento de quitosana, levando a uma menor capacidade de preservação. De acordo com os resultados da Tabela 2, a quitosana dopada com partículas de Ag/TiO₂ a 1% (peso) apresenta o melhor desempenho para retardar a deterioração das proteínas do albúmen, prolongando assim a vida útil em até 30 dias.

Tempo de armazenamento (dia)	Unidade Haugh
	NÓS	Ag/TiO 2-CS0	Ag/TiO 2-CS1	Ag/TiO 2-CS2	Ag/TiO 2-CS3
6	73,23±0,68c	80,32±0,59b	83.34±0.12a,b	81.60±1.41a	77.06±0.35a
11	69,86±3,25c	75,64±1,27 bilhões	77.18±2.45a,b	76.05±3.13a,b	74.32±1.41a
16	67.31±2.43b	73.88±2.06b	75.36±1.34a	75.61±2.15a	71.53±2.18a
21	62,93±5,32c	71.06±3.88c	73.20±3.09a	72.94±3.52a	69.35±1.34a,b
26	58.55±2.89b	69,85±1,53c	71.85±2.39a	70.34±4.19a,b	66.21±2.10a
31	55.24±3.04a	65.26±0.51a	69.31±3.18a	68.96±1.17a	62.64±4.03a
Na mesma linha com letras sobrescritas diferentes são significativamente diferentes

Tabela 2: A variação da unidade Haugh de diferentes ovos durante o tempo de armazenamento.

A variação do pH do albúmen é causada pela evacuação do CO₂, levando a um aumento lento dos valores de pH com o tempo de armazenamento. O pH do albúmen dos ovos WE aumenta acentuadamente em 10 dias e chega a 9,5 no dia 30. A degradação de proteínas em gordura e peptona leva a uma diminuição do pH. Após ser protegido por um revestimento de quitosana, o pH do albúmen apresenta tendências semelhantes em 20 dias, que se estabilizam em torno de pH 8,0-8,2. Após o dia 20, os valores de pH de Ag/TiO 2-CS0 e Ag/TiO_2-CS1 mostram ligeira flutuação em torno de pH 8,2 e se estabilizam entre pH 7,5-8,0 para Ag/TiO_2-CS2 e Ag/TiO_2-CS3. O pH do albúmen relativamente estável dos grupos tratados em comparação com o grupo WE ilustra a redução efetiva da perda de CO₂ no albúmen (Figura 3). A adição da partícula Ag/TiO₂ promove a estabilidade da quitosana, que pode manter boa estabilidade até 31 dias (Figura 4).

Figura 3: Mudanças no pH do albúmen de diferentes ovos durante o tempo de armazenamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens de MEV de superfícies de casca de ovo revestidas com Ag / TiO_2-CS nos dias 0, 11, 16 e 31. (A) Ag/TiO 2-CS1; (B) Ag/TiO 2-CS2; (C) Ag / TiO 2-CS3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Problemas de preservação da qualidade da proteína do ovo podem ser aliviados pelo revestimento de quitosana, que provou ser uma maneira eficaz de prolongar a vida útil do ovo. O uso de um único revestimento de quitosana, no entanto, cria vários problemas, como instabilidade, limitando o período de preservação e a aplicação real de revestimentos à base de quitosana. Notavelmente, a dopagem de nanopartículas antibacterianas específicas em quitosana foi proposta para estender ainda mais a vida útil. Neste estudo, as partículas de Ag/TiO₂ são sintetizadas e dopadas com sucesso em um revestimento de quitosana, o que pode estender o período de preservação para pelo menos 30 dias.

Imagens de MEV são usadas para analisar a estrutura e morfologia das partículas de Ag/TiO₂ , bem como a morfologia das cascas de ovos revestidas. Os desempenhos de preservação dos revestimentos compósitos são avaliados pela perda de massa, unidade Haugh, pH do albúmen e morfologias da casca do ovo das amostras. A adoção de compósitos Ag / TiO₂ contribui para um efeito sinérgico da quitosana, o que pode prolongar ainda mais o período de preservação.

Os tamanhos de partícula dos compósitos Ag/TiO₂ estão na faixa de 100-300 nm (controlados pela condição de síntese), o que pode bloquear os poros na parte superior da casca do ovo e melhorar o desempenho de preservação. No entanto, o excesso de partículas de Ag / TiO₂ destruiria a estrutura em camadas do revestimento de quitosana, resultando em uma menor capacidade de preservação.

Atualmente, os desempenhos do revestimento de quitosana neste estudo, no entanto, são limitados pelas espécies e concentrações de partículas existentes, o que requer otimização em estudos futuros.

Os métodos neste estudo demonstram novos materiais de revestimento, que podem ser misturados por nanopartículas específicas no precursor do revestimento, para obter efeitos combinativos da nanopartícula e do precursor, bem como para preparar novos revestimentos multifuncionais no campo da preservação de alimentos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetate	Aladdin	64-19-7	GR, 99.8%
Benzenesulfonic acid	Aladdin	03/11/1998	98%
Chitosan	Aladdin	9012-76-4	<200 mPa•s
Deionized water	prepared by ourselves	-	18 MΩ•cm
Electronic precision balance	Sartorius	BSA124S-CW
Ethanol	Aladdin	64-17-5	≥99.8%
Formate	Aladdin	64-18-6	Standard for GC, >99%
pH meter	HeYi	PHS-25
Scanning electron microscope	Hiatchi	SU8010
Silver nitrate (AgNO3)	Aladdin	7761-88-8	≥99.9%
Sodium borohydride (NaBH4 )	Aladdin	16940-66-2	98%
Temperature humidity chamber	YiHeng	LHS-50CH
Titanium butoxide (TBOT)	Aladdin	5593-70-4	CP,98%