Doxycycline carregado de colágeno-chitosan andaime composto para a cura acelerada de feridas diabéticas

Resumo

O andaime DOX-CL preparado satisfazia os pré-requisitos de um curativo DW ideal em resistência mecânica, porosidade, absorção de água, taxa de degradação, liberação sustentada, antibacteriano, biocompatibilidade e propriedades anti-inflamatórias, que são consideradas essenciais para a recuperação de tecido danificado em DWs.

Resumo

Uma complicação maior do diabetes mellitus são as feridas diabéticas (DW). A fase prolongada de inflamação no diabetes obstrui os estágios adicionais de uma lesão que leva à cicatrização tardia da ferida. Selecionamos a doxiciclina (DOX), como uma droga potencial de escolha, devido às suas propriedades antibacterianas, juntamente com suas propriedades anti-inflamatórias relatadas. O presente estudo visa formular andaimes de colágeno-chitosan carregados do DOX (NCL) e crosslinked (CL) e avaliar sua capacidade de cura em condições diabéticas. O resultado da caracterização dos andaimes revela que o andaime DOX-CL possui porosidade ideal, baixa taxa de inchaço & degradação e uma liberação sustentada de DOX em comparação com o andaime DOX-NCL. Os estudos in vitro revelam que o andaime DOX-CL era biocompatível e melhorou o crescimento celular em comparação com os grupos de controle e tratamento do andaime CL. Os estudos antibacterianos mostraram que o andaime DOX-CL foi mais eficaz do que o andaime CL contra as bactérias mais comuns encontradas na DW. Utilizando a estreptozotocina e o modelo DW induzido pela dieta de alto teor de gordura, observou-se uma taxa significativamente (p≤0,05) mais rápida de contração de feridas no grupo tratado do andaime DOX-CL em comparação com aqueles em grupos de tratamento e controle de andaimes CL. O uso do andaime DOX-CL pode ser uma abordagem promissora para o tratamento local para DWs.

Introdução

Diabetes mellitus (DM) é uma condição em que a falha do corpo em fornecer insulina ou reagir aos seus resultados na digestão anormal de açúcares simples provoca um aumento da glicemia ¹. O emaranhado mais consecutivo e esmagador do DM é a ferida diabética (DW). Cerca de 25% dos pacientes com DM têm a oportunidade de construir um DW em sua vida ¹. A cura dificultada da DW é credenciada a uma triopatia de DM: imunopatia, vasculopatia e neuropatia. Sempre que a DW não for tratada, pode resultar em desenvolvimento de gangrena, levando, portanto, à remoção do órgão em causa ².

Muitos tratamentos, como instruir os pacientes (inspecionar a ferida diariamente, limpar a ferida, evitar atividades que criam pressão sobre a ferida, monitoramento periódico de glicose, etc.), controlar sua glicemia, desbridamento de feridas, descarga de pressão, procedimento médico, oxigenoterapia hiperbárica e terapias avançadas são na prática ^3,4. A maioria desses medicamentos não consegue atender a todos os pré-requisitos vitais para o cuidado da DW à luz das condições fiofofosiológicas multifatoriais e despesas inesperadas relacionadas a esses medicamentos ⁵. Embora a patogênese dw seja multifatorial, a inflamação persistente com o manejo inadequado do tecido é declarada como a verdadeira razão para a cicatrização retardada em DWs ^5,6.

Níveis aumentados de mediadores inflamatórios e pró-inflamatórios na DW resultam em fatores de crescimento diminuídos responsáveis pela cicatrização tardia da ferida ^2,6. A formação inadequada de matriz extracelular (ECM) em DWs é credenciada ao aumento dos níveis de metaloproteinases matricial (MMPs) responsáveis pela rápida degradação do ECM formado. Nos MMPs, o MMP-9 é relatado como um dos principais intermediários responsáveis pela inflamação prolongada e degradação rápida do ECM ⁷. Afirma-se que o tratamento local com um medicamento anti-inflamatório que diminui os níveis elevados de MMP-9 restabelece homeostase cutânea, arranjo de estrutura e solicita melhor cicatrização de DWs ^8,9.

A doxiciclina (DOX), inibidora de MMP-9, foi escolhida para suprimir os níveis elevados de MMP-9, um dos principais mediadores inflamatórios responsáveis pela inflamação persistente em DWs ^10,11,12. Além disso, o DOX possui antioxidantes (produzem radicais hidroxi e fenoxidos livres capazes de se ligar com espécies reativas de oxigênio) ¹³ e anti-apoptótico (inibir a expressão caspase e estabilização mitocondrial) ¹⁴ atividades essenciais para o tratamento da DW. Foi escolhido o arranjo de quadros contendo DOX, colágeno (COL) e chitosan (CS). A escolha do COL depende da forma como ajuda a fornecer a estrutura necessária responsável pela resistência mecânica e regeneração tecidual ¹⁵. Por outro lado, a CS é estruturalmente homóloga ao glicosaminoglicano, associada a várias fases de cicatrização de feridas. Também é relatado que a CS possui uma propriedade antibacteriana significativa ¹⁵. Assim, o andaime COL/CS do DOX é formulado para suprimir a inflamação prolongada, seguido por apoiar a formação matricial para cicatrização bem sucedida da ferida em condições de DM.

Protocolo

Todos os procedimentos animais realizados foram aprovados pelo comitê institucional de ética animal da JSS College of Pharmacy, Ooty, Índia.

1. Preparação de andaimes porosos carregados do DOX pelo método de secagem congelante

1. Adicione 1,2 g de COL a 100 mL de água (por exemplo, Millipore) e mantenha-se de lado para o inchaço.
2. Mexa a dispersão do COL inchado a 2000 rpm durante a noite para garantir a dissolução completa do COL.
3. Prepare a solução CS dissolvendo aproximadamente 0,8 g de CS em 100 mL de ácido acético de 1%.
4. Mexa a solução CS durante a noite a 2000 rpm para garantir a dispersão uniforme.
5. Mix DOX (1% c/v), seguido da solução CS, para a solução COL, e mexa por 30 min.
6. Filtre a mistura física obtida usando um pano de musselina para remover a matéria particulada.
7. Congele profundamente o filtrado obtido a -85 °C ± 4 °C por cerca de 24 h.
8. Lyophilize a mistura de congelamento profundo a -85 °C ± 4 °C por 72 h.
9. Armazene os andaimes obtidos em um desiccator para análise posterior ^16,17.

2. Crosslinking de andaime

1. Dissolver MES (0,488 g) em 50 mL de água.
2. Mergulhe 50 mg do andaime carregado DOX em 20 mL do buffer MES por 30 min.
3. Misture 19,5 mL de buffer MES com 0,1264 g de EDC e 0,014 g de NHS em um béquer separado.
4. Mergulhe o andaime na mistura de tampão por 4h para alcançar o crosslinking ¹⁶.
5. Armazene o DOX carregado de andaimes cruzados (CL) e andaimes não-cruzados (NCL) para avaliação posterior.

3. Caracterização de andaimes

1. Exame morfológico usando uma microscopia eletrônica de varredura (SEM)
   1. Caracterize os andaimes para análise morfológica utilizando SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).
   2. Colora a superfície transversal e externa do andaime com a delicada camada de ouro (~150 Å).
   3. Capture a imagem fotográfica na tensão de excitação de 5 kV e 10 kV.
   4. Coloque as amostras em alumínio e coloque-as com o ouro a aproximadamente 9 V.
   5. Meça o andaime utilizando SEM com a resolução aumentada em 10 kV.
2. Determinação porosidade
   1. Meça a porosidade dos andaimes utilizando o método de deslocamento líquido (etanol) ¹⁸.
   2. Calcule a porosidade dos andaimes usando as fórmulas abaixo.
      
      W_w = Peso molhado do andaime
      W_d = Peso seco do andaime
      W_v = Volume do andaime
3. Determinando a capacidade de absorção da água
   1. Meça o peso seco do andaime.
   2. Incubar o andaime pesado a 37 °C por 24 h em salina tampão fosfato (PBS) pH 7.4.
   3. Remova o excesso de PBS sobre o andaime usando papel filtro.
   4. Meça a capacidade de absorção de água utilizando a fórmula ^{abaixo 17}.
      
      W_S = Porcentagem de absorção de água
      W₁=Peso molhado do andaime
      W₀= Peso seco do andaime
4. Degradação do andaime
   1. Incubar o andaime (1cm x 1cm) a 37 °C durante 7 dias em um PBS de pH 7.4 contendo lysozymes.
   2. Lave o andaime para remover quaisquer íons aderidos na superfície.
   3. Congele o andaime lavado ¹⁷.
   4. Calcule a taxa de degradação usando fórmulas.
      
      Ww = Peso inicial do andaime
      Wd = Peso do andaime após a secagem congelante
5. Estudos de liberação in vitro
   1. Determine o comportamento de liberação do DOX do andaime usando o método de saco de diálise.
   2. Disperse o andaime em alguns mililitros de fluido de ferida simulado (pH 7.4) e transfira-o para um saco de diálise.
   3. Feche bem as extremidades do saco de membrana e mergulhe nos 500 mL de solução simulada de fluido de ferida.
   4. Mexa a solução de fluido de ferida contendo o saco de diálise a 200-250 rpm.
   5. Colete a solução sobrenante e substitua-a por uma quantidade igual de solução tampão fresca em intervalos de tempo definidos.
   6. Determine a porcentagem de liberação DOX dos andaimes da solução sobrenante usando um espectrômetro visível UV a 240 nm.

4. Estudos antibacterianos in vitro

1. Determine a concentração inibitória mínima (MIC) dos andaimes CL e DOX-CL contra o S. aureus, S. epiderme, E. coli, P. aeruginosa usando o método de diluição do micro-caldo.
2. Prepare as culturas bacterianas usando caldo Mueller-Hinton a uma proporção de 1:1000 para obter 0,5 turbidez McFarland.
3. Adicione d-glicose (800 mg/dL) às culturas bacterianas para hiperglicação ^19,20.
4. Mince e solubilize o CL e DOX-CL em DMSO (controle negativo).
5. Diluir em série a suspensão bacteriana hiperglicada (100 μL) e testar amostras (100 μL de solução de andaimes) em placa de 96 poços.
6. Incubar a placa a 37 °C para 20-24 h.
7. Regisso recorde a absorvância em um comprimento de onda de 600 nm ²¹.

5. Estudos de biocompatibilidade in vitro

1. Avalie a biocompatibilidade dos andaimes preparados usando MTT [(3-(4, 5 dimetil thiazole-2 yl) -2, 5-difenil tetrazolium brometo)] ensaio.
2. Esterilize os andaimes de dimensão padrão e coloque-os em 24 placas de poço.
3. Adicione células 3T3-L1 à placa de 24 poços e incubada por 72 h.

6. Estudos em animais in vivo

1. Indução de DM e ferida de excisão
   1. Alimente o animal com uma dieta rica em gordura por duas semanas e administre uma única dose de estreptozotocina (STZ) (50 mg/kg de peso corporal) em solução tampão citrato intraperitoneal para ratos albinos Wistar (180-200 g) para a indução de diabetes tipo 2.
   2. Escolha os animais com uma glicemia constante de 250 mg/dL para o estudo.
   3. Randomize os animais selecionados para a indução de feridas de excisão.
   4. Anestesiar os ratos diabéticos usando éter dietil (5 mL foi adicionado à câmara de anestesia saturada anteriormente) e confirmar usando o método de beliscar o dedo do pé e a cor da membrana mucosa.
   5. Raspe a área dorsal (torácica dorsal, região lombar) utilizando um aparador asséptico e lâminas (A40).
   6. Esterilize a área raspada com um cotonete alcoólico.
   7. Extite a pele (2 x 2 cm² e uma profundidade de 1 mm) com uma lâmina A40 cirúrgica asséptica na área raspada para criar uma ferida aberta.
   8. Divida os animais em três grupos (Grupo 1- Controle de Doenças (Controle), Andaime do Grupo 2- CL (Placebo), Andaime CL do Grupo 3- DOX), cada grupo composto por 6 ratos.
   9. Afixe os andaimes CL e DOX CL usando fita cirúrgica e cubra o grupo controle com gaze estéril por 21 dias.
   10. Rastreie a área da ferida em uma folha de OHP estéril e meça a redução percentual da ferida utilizando o método de rede nos dias 0, 7, 14 e 21 para todos os grupos.
   11. Calcule a redução percentual da ferida usando a fórmula abaixo.
       

7. Estudos histopatológicos

1. Isole a área de ferida curada nos dias 7, 14 e 21, armazene em solução de formalina (10%).
2. Seção os tecidos usando um microtoma para obter uma espessura de 6 μm.
3. Monte as seções em um escorregador de vidro e colora usando Hematoxilina e eosina ¹⁷.
4. Capture as imagens sob ampliação de 40x usando um microscópio digital.

8. Estimativa de hidroxiprolina

1. Isole a área da ferida curada nos dias 0, 7, 14 e 21 para avaliação.
2. Estime o teor de hidroxiprolina utilizando o procedimento descrito por Reddy G et al., 1996 ²².

9. Teste de Elisa

1. Estime os níveis de MMP-9 utilizando o kit Elisa de acordo com as instruções do fabricante.
2. Isole as amostras de tecido da área da ferida curada no dia 21 e pica-se usando um homogeneizador de tecido.
3. Centrifugar o homogeneizar obtido e coletar o supernante.
4. Diluir o supernatante em 100 vezes usando tampão de ensaio.
5. Escaneie a placa usando um leitor de placas múltiplas.

10. Análise estatística

1. Representam os resultados obtidos como Média ± SD.
2. Realize a análise estatística utilizando Graph pad prism v5.01.
3. Atinja a significância estatística usando a Análise de Variância de Uma Via (ANOVA) e o teste pós-hoc de Dunnet.
4. Considere os valores com p≤0,05 como significativos.

Resultados

Caracterização do DOX carregado NCL e andaime CL
No exame visual, verificou-se que o andaime NCL e CL era de cor creme. Além disso, ambos os andaimes parecem ser como uma esponja, duro e inelástico quando examinados fisicamente. As imagens SEM dos andaimes NCL e CL são mostradas na Figura 1. A partir da figura, ficou claro que houve uma diminuição no tamanho dos poros após a ligação cruzada, formando ligações intermoleculares. Além disso, a porosidade dos and...

Discussão

O principal objetivo deste estudo foi determinar o efeito do andaime COL-CS carregado de DOX na cicatrização de DW em ratos. CL e NCL foram preparados e avaliados em termos de morfologia, índice de inchaço, cinética de liberação in vitro e biocompatibilidade.

Caracterização do DOX carregado NCL e andaime CL
Os andaimes preparados foram encontrados porosos com poros interligados. Esses poros interconectados asseguram a natureza porosa e esponjosa que ajuda na difus?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Merck Millipore, Mumbai, India	E7750
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)	Merck Millipore, Mumbai, India	137074
3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)	Thermo Fisher, Mumbai, India	M6494
Deep freezer verticle	Labline Instruments, Kochi, India
Dialysis sack	Merck Millipore, Mumbai, India	D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da
Doxycycline	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	D9891
Elisa kit	R&D Systems	RMP900
Escherichia coli (E. coli)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2567
Ethanol	Merck Millipore, Mumbai, India	100983
Lyophilizer-SZ042	Sub-Zero lab instruments, Chennai, India
Mechanical Stirrer-RQ-122/D	Remi laboratory instruments, Mumbai, India
Medium molecular weight Chitosan	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	18824
Microtome-RM2135	Leica, U.K
Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1)	National Centre for Cell Sciences, Pune, India
Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro	Tecan Instruments, Switzerland
N-hydroxy succinimide (NHS)	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	130672
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2036
Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800	Hitachi, India
Sodium hydroxide (NaOH) pellets	Qualigen fine chemicals, Mumbai, India	Q27815
Staphylococcus aureus (S. aureus)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5022
Staphylococcus epidermis (S. epidermis)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5270
Streptozotocin (STZ)	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	14653
Type-1 rat Collagen	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	C7661
Ultraviolet–visible spectroscopy-1700	Shimadzu