Доксициклиновый композитный каркас с коллагеном и хитозаном для ускоренного заживления диабетических ран

Резюме

Подготовленный каркас DOX-CL удовлетворил предпосылки идеальной DW-повязки по механической прочности, пористости, водопоглощению, скорости деградации, замедленному высвобождению, антибактериальной, биосовместимости и противовоспалительным свойствам, которые считаются необходимыми для восстановления поврежденных тканей у ДВ.

Аннотация

Одним из основных осложнений сахарного диабета являются диабетические раны (DW). Длительная фаза воспаления при диабете препятствует дальнейшим стадиям травмы, что приводит к задержке заживления ран. Мы выбрали доксициклин (DOX) в качестве потенциального препарата выбора из-за его антибактериальных свойств наряду с его противовоспалительными свойствами. Текущее исследование направлено на формулирование doX-нагруженных коллаген-хитозаном несшитых (NCL) и сшитых (CL) каркасов и оценку их заживляющей способности в диабетических состояниях. Результат характеристик каркасов показывает, что каркас DOX-CL обладает идеальной пористостью, низкой скоростью набухания и деградации и устойчивым высвобождением DOX по сравнению с каркасом DOX-NCL. Исследования in vitro показывают, что каркас DOX-CL был биосовместимым и усиливал рост клеток по сравнению с клетками, обработанными КАРКАСОМ CL, и контрольными группами. Антибактериальные исследования показали, что каркас DOX-CL был более эффективным, чем каркас CL против наиболее распространенных бактерий, обнаруженных в DW. Используя стрептозотоцин и модель DW с высоким содержанием жиров, наблюдалась значительно (p≤0,05) более высокая скорость сокращения раны в группе, обработанной каркасом DOX-CL, по сравнению с группами, обработанными каркасами CL, и контрольными группами. Использование каркаса DOX-CL может оказаться перспективным подходом для местного лечения ДМ.

Введение

Сахарный диабет (СД) - это состояние, при котором неспособность организма доставлять инсулин или реагировать на его результаты при аномальном переваривании простых сахаров приводит к всплеску уровня глюкозы в крови ^1. Наиболее последовательным и сокрушимающим запутыванием СД является диабетическая рана (DW). Примерно 25% пациентов с СД имеют возможность создать DW в течение своей жизни ^1. Затрудненное заживление DW относится к триопатии СД: иммунопатии, васкулопатии и нейропатии. Всякий раз, когда DW не лечат, это может привести к развитию гангрены, что приводит к удалению соответствующего органа ^2.

Множество методов лечения, таких как инструктаж пациентов (ежедневно осматривать рану, очищать рану, избегать действий, которые создают давление на рану, периодический мониторинг глюкозы в крови и т. Д.), Контроль уровня глюкозы в крови, санация ран, разгрузка давления, медицинская процедура, гипербарическая кислородная терапия и передовые методы лечения находятся в практике ^3,4. Большинство из этих препаратов не учитывают все предпосылки, жизненно важные для ухода dw в свете многофакторных патофизиологических условий и непредвиденных расходов, связанных с этими лекарствами ⁵. Несмотря на то, что патогенез DW является многофакторным, стойкое воспаление с ненадлежащим управлением тканями считается фактической причиной задержки заживления в DW ^5,6.

Увеличение уровня воспалительных и провоспалительных медиаторов в DW приводит к уменьшению факторов роста, ответственных за задержку заживления ран ^2,6. Неправильное образование внеклеточного матрикса (ECM) в ДВ относится к повышенным уровням матричных металлопротеиназ (MMP), ответственным за быструю деградацию сформированных ECM. В MMP MMP-9 сообщается как основной посредник, ответственный за длительное воспаление и быструю деградацию ECM ^7. Утверждается, что местное лечение противовоспалительным препаратом, снижающим повышенный уровень ММП-9, восстанавливает кожный гомеостаз, каркасное расположение и побуждает к лучшему заживлению ^{ДМО 8,9.}

Доксициклин (DOX), ингибитор MMP-9, был выбран для подавления повышенных уровней MMP-9, основного медиатора воспаления, ответственного за стойкое воспаление в DWs ^10,11,12. Кроме того, DOX обладают антиоксидантными (продуцируют свободные гидрокси и феноксирадики, способные связываться с активными формами кислорода) ¹³ и антиапоптотическими (ингибируют экспрессию каспазы и стабилизацию митохондрий) ¹⁴ активностями, которые необходимы для лечения DW. Было выбрано расположение фреймворков, содержащих DOX, коллаген (COL) и хитозан (CS). Выбор COL зависит от того, каким образом он помогает в обеспечении необходимых рамок, отвечающих за механическую прочность и регенерацию тканей ^15. С другой стороны, CS структурно гомологичны гликозаминогликану, связанным с несколькими фазами заживления ран. Также сообщается, что КС обладает значительным антибактериальным свойством ^15. Следовательно, каркас COL / CS DOX разработан для подавления длительного воспаления с последующей поддержкой формирования матрицы для успешного заживления ран в условиях СД.

протокол

Все выполненные процедуры для животных были одобрены институциональным этическим комитетом по защите животных Фармацевтического колледжа JSS, Ути, Индия.

1. Подготовка пористых лесов, загруженных DOX методом сублимационной сушки

1. Добавьте 1,2 г COL к 100 мл воды (например, Millipore) и держите в стороне для набухания.
2. Перемешайте набухшие дисперсии COL со скоростью 2000 об/мин в течение ночи, чтобы обеспечить полное растворение COL.
3. Готовят раствор КС, растворяя примерно 0,8 г КС в 100 мл 1% уксусной кислоты.
4. Перемешайте раствор CS в течение ночи со скоростью 2000 об/мин для обеспечения равномерного диспергирования.
5. Смешайте DOX (1% мас./об.), а затем раствор CS, с раствором COL, и перемешайте в течение 30 мин.
6. Фильтруйте полученную физическую смесь с помощью муслиновой ткани для удаления твердых частиц.
7. Глубоко замораживают полученный фильтрат при -85 °C ± 4 °C в течение примерно 24 ч.
8. Лиофилизируйте смесь глубокой заморозки при -85 °C ± 4 °C в течение 72 ч.
9. Хранят полученные строительные леса в адсорбаторе для дальнейшего анализа ^16,17.

2. Сшивание строительных лесов

1. Растворить MES (0,488 г) в 50 мл воды.
2. Замочите 50 мг нагруженного DOX каркаса в 20 мл буфера MES в течение 30 мин.
3. Смешайте 19,5 мл буфера MES с 0,1264 г EDC и 0,014 г NHS в отдельном заквасе.
4. Погрузите каркас в буферную смесь на 4 ч для достижения сшивки ^16.
5. Храните загруженные DOX сшитые (CL) и несшитые каркасы (NCL) для дальнейшей оценки.

3. Характеристика строительных лесов

1. Морфологическое исследование с использованием сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)
   1. Охарактеризовать каркасы для морфологического анализа с помощью SEM (1 см × 1 см × 0,5 см).
   2. Окрасить поперечное сечение и внешнюю поверхность каркаса тонким слоем золота (~150 Å).
   3. Захват фотографического изображения при напряжении возбуждения 5 кВ и 10 кВ.
   4. Поместите образцы в алюминиевые заглушки и заключите их в золото при длине около 9 В.
   5. Измерьте каркас с помощью SEM с увеличенным разрешением при 10 кВ.
2. Определение пористости
   1. Измеряют пористость каркасов с помощью метода вытеснения жидкости (этанола) ^18.
   2. Рассчитайте пористость каркасов, используя приведенные ниже формулы.
      
      W_w = Мокрый вес строительных лесов
      W_d = Сухой вес каркаса
      W_v = Объем каркаса
3. Определение водопоглощающей способности
   1. Измерьте сухой вес строительных лесов.
   2. Инкубировать взвешенный каркас при 37 °C в течение 24 ч в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) pH 7,4.
   3. Удалите излишки PBS над каркасом с помощью фильтровальной бумаги.
   4. Измерьте водопоглощающую способность, используя приведенную ниже формулу ^17.
      
      W_S = Процент водопоглощения
      W₁= Мокрый вес строительных лесов
      W₀= Сухой вес каркаса
4. Деградация строительных лесов
   1. Инкубируют каркас (1 см х 1 см) при 37 °C в течение 7 дней в PBS рН 7,4, содержащей лизоцимы.
   2. Вымойте каркас, чтобы удалить все прилипшие ионы на поверхности.
   3. Сублимационная сушка вымытых лесов ^17.
   4. Рассчитайте скорость деградации с помощью формул.
      
      Ww = Начальный вес каркаса
      Wd = Вес строительных лесов после сублимационной сушки
5. Исследования высвобождения in vitro
   1. Определите поведение высвобождения DOX из каркаса с помощью метода диализного мешка.
   2. Рассейте каркас в нескольких миллилитрах моделируемой раневой жидкости (рН 7,4) и перенесите его в диализный мешок.
   3. Плотно закройте концы мембранного мешка и погрузите в 500 мл смоделированного раствора раневой жидкости.
   4. Размешайте раствор раневой жидкости, содержащий диализный мешок, со скоростью 200-250 об/мин.
   5. Соберите раствор супернатанта и замените его равным количеством свежего буферного раствора через определенные промежутки времени.
   6. Определите процент высвобождения DOX из каркасов в растворе супернатанта с помощью УФ-видимого спектрометра при 240 нм.

4. Антибактериальные исследования in vitro

1. Определить минимальную ингибируемую концентрацию (МИК) каркасов CL и DOX-CL в отношении S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa с помощью метода микро-разведения отвара.
2. Готовят бактериальные культуры с помощью бульона Мюллера-Хинтона в соотношении 1:1000 для получения 0,5 мутности Макфарланда.
3. Добавляют D-глюкозу (800 мг/дл) в бактериальные культуры для гипергликации ^19,20.
4. Измечить и солюбилизировать CL и DOX-CL в ДМСО (отрицательный контроль).
5. Последовательно разбавляют гипергликированную бактериальную суспензию (100 мкл) и испытуемые образцы (100 мкл раствора каркасов) в 96-й пластине скважины.
6. Инкубировать пластину при 37 °C в течение 20-24 ч.
7. Запись поглощения на длине волны 600 нм ²¹.

5. Исследования биосовместимости in vitro

1. Оценить биосовместимость подготовленных каркасов с помощью анализа MTT [(3-(4, 5 диметилтиазол-2 ил)-2, 5-дифенилтетразолия бромида)].
2. Стерилизуйте каркасы стандартного размера и поместите их в 24 плиты скважины.
3. Добавляют клетки 3T3-L1 в пластину 24 лунки и инкубировали в течение 72 ч.

6. Исследования in vivo на животных

1. Индукция ДМ и иссечение раны
   1. Кормят животное с высокожировой диетой в течение двух недель и вводят однократную дозу стрептозотоцина (СТЗ) (50 мг/кг массы тела) в цитратном буферном растворе внутрибрюшинно крысам-альбиносам Wistar (180-200 г) для индукции диабета 2 типа.
   2. Выберите животных с постоянным содержанием глюкозы в крови 250 мг/дл для исследования.
   3. Рандомизировать отобранных животных для индукции иссеченных ран.
   4. Обезболивают крыс с диабетом с помощью диэтилового эфира (5 мл добавляли в ранее насыщенную анестезируемую камеру) и подтверждали с помощью метода защемления носком и цвета слизистой оболочки.
   5. Сбрить дорсальную область (дорсальная грудная, поясничная область) с помощью асептического триммера и лопастей (А40).
   6. Стерилизуйте выбритый участок спиртовой тампон.
   7. Иссекайте кожу (2 х 2^см2 и глубиной 1 мм) асептическим хирургическим лезвием А40 на бритой области для создания открытой раны.
   8. Разделите животных на три группы (Группа 1 - Контроль заболевания , Группа 2 - Каркас CL (Плацебо), Группа 3 - Каркас DOX CL), каждая группа состоит из 6 крыс.
   9. Прикрепите каркасы CL и DOX CL хирургическим скотчем и накройте контрольную группу стерильной марлей в течение 21 дня.
   10. Проследите область раны на стерильном листе OHP и измерьте процентное уменьшение раны с помощью сетчатого метода в дни 0, 7, 14 и 21 для всех групп.
   11. Рассчитайте процент уменьшения раны, используя следующие формулы.
       

7. Гистопатологические исследования

1. Изолируют заживчивую рану на 7, 14 и 21 день, хранят в растворе формалина (10%).
2. Срез тканей с помощью микротома получают толщину 6 мкм.
3. Установите секции на стеклянную горку и пятно с помощью гематоксилина и эозина ^17.
4. Захват изображений под 40-кратным увеличением с помощью цифрового микроскопа.

8. Оценка гидроксипролина

1. Изолируйте заживливую рану на 0, 7, 14 и 21 день для оценки.
2. Оцените содержание гидроксипролина с помощью процедуры, описанной Reddy G et al., 1996 ²².

9. Ифа-тест

1. Оцените уровни MMP-9 с помощью комплекта Elisa в соответствии с инструкциями производителя.
2. Изолируйте образцы тканей из зажившей раны на 21-й день и измерзайте с помощью гомогенизатора ткани.
3. Центрифугируют полученный гомогенат и собирают супернатант.
4. Разбавить супернатант в 100 раз с помощью пробирного буфера.
5. Сканируйте пластину с помощью устройства считывания нескольких пластин.

10. Статистический анализ

1. Представить полученные результаты как среднее ± УР.
2. Выполните статистический анализ с помощью призмы Графовой панели v5.01.
3. Достигайте статистической значимости с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA) и пост-специального теста Даннета.
4. Рассмотрим значения с p≤0,05 как значимые.

Результаты

Характеристика скафолдов NCL и CL, загруженных DOX
При визуальном осмотре было обнаружено, что каркасы NCL и CL кремового цвета. Кроме того, оба каркаса кажутся похожими на губку, жесткими и неэластичными при физическом осмотре. SEM-изображения каркасов NCL и CL показаны на р?...

Обсуждение

Основной целью этого исследования было определение влияния нагруженного DOX каркаса COL-CS на заживление DW у крыс. CL и NCL были подготовлены и оценены с точки зрения морфологии, индекса набухания, кинетики высвобождения in vitro и биосовместимости.

Характеристика скафолдов NC...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Merck Millipore, Mumbai, India	E7750
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)	Merck Millipore, Mumbai, India	137074
3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)	Thermo Fisher, Mumbai, India	M6494
Deep freezer verticle	Labline Instruments, Kochi, India
Dialysis sack	Merck Millipore, Mumbai, India	D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da
Doxycycline	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	D9891
Elisa kit	R&D Systems	RMP900
Escherichia coli (E. coli)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2567
Ethanol	Merck Millipore, Mumbai, India	100983
Lyophilizer-SZ042	Sub-Zero lab instruments, Chennai, India
Mechanical Stirrer-RQ-122/D	Remi laboratory instruments, Mumbai, India
Medium molecular weight Chitosan	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	18824
Microtome-RM2135	Leica, U.K
Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1)	National Centre for Cell Sciences, Pune, India
Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro	Tecan Instruments, Switzerland
N-hydroxy succinimide (NHS)	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	130672
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2036
Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800	Hitachi, India
Sodium hydroxide (NaOH) pellets	Qualigen fine chemicals, Mumbai, India	Q27815
Staphylococcus aureus (S. aureus)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5022
Staphylococcus epidermis (S. epidermis)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5270
Streptozotocin (STZ)	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	14653
Type-1 rat Collagen	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	C7661
Ultraviolet–visible spectroscopy-1700	Shimadzu