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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a purificação dos complexos de peptídeos classe I e CLASSE II da classe I, fornecendo dados de imunopeptidomias de alta qualidade. O protocolo se concentra na preparação da amostra usando anticorpos disponíveis comercialmente.

Resumo

A imunopeptidomia é um campo emergente que alimenta e orienta o desenvolvimento de vacinas e imunoterápicos. Mais especificamente, refere-se à ciência de investigar a composição de peptídeos apresentados pelas principais moléculas de classe I e classe II do complexo de histocompatibilidade (MHC) e moléculas classe II usando plataformas tecnológicas de espectrometria de massa (MS). Denúltico de todas as etapas de um fluxo de trabalho de imunopeptidomia baseado em MS, a preparação da amostra é criticamente importante para a captura de dados de alta qualidade de relevância terapêutica. Aqui, instruções passo a passo são descritas para isolar peptídeos associados ao MHC classe I e II por purificação de imunoaffinity a partir de amostras de controle de qualidade, de linhas celulares de camundongos (EL4 e A20) e linhas celulares humanas (JY) mais especificamente. Os vários reagentes e anticorpos específicos são descritos minuciosamente para isolar peptídeos associados ao MHC dessas linhas celulares, incluindo as etapas para verificar a eficiência vinculante de contas do anticorpo e a eficiência de eluição dos complexos MHC-peptídeos das contas. O protocolo pode ser usado para estabelecer e padronizar um fluxo de trabalho imunopeptidomico, bem como para avaliar novos protocolos. Além disso, o protocolo representa um grande ponto de partida para qualquer não-especialista, além de promover a reprodutibilidade intra e interseto do procedimento de preparação da amostra em imunopeptidomia.

Introdução

Na última década, o interesse em investigar o repertório de peptídeos associados ao MHC ultrapassou o setor acadêmico e atingiu as indústrias biotecnológica e farmacêutica. De fato, no câncer, a descoberta de neoantígenos acionáveis específicos do tumor representa um grande foco de pesquisa no setor industrial para desenvolver imunoterápicos clínicos levando a oncologia personalizada1,2,3. Fundamentalmente, os peptídeos associados ao MHC são apresentados em todo o corpo, refletem o estágio intracelular da célula e são significativos em várias condições da doença, como autoimunidade, transplante, doenças infecciosas, inflamação, câncer e alergias1,4. Assim, os peptídeos associados ao MHC, ou ligantes de antígeno leucócito humano (HLA) em humanos, são de grande interesse médico e são coletivamente referidos como imunopeptidome5.

A ESM é uma abordagem analítica poderosa para caracterizar o imunopeptidome6,7, incluindo a descoberta de neoantígenos específicos do tumor8,9,10,11. Um fluxo de trabalho típico para realizar um experimento de imunopeptidomia inclui três passos principais: 1) preparação amostral para o isolamento de peptídeos associados ao MHC, 2) aquisição de dados por MS e 3) análise de dados usando várias ferramentas de software computacional12. A geração de amostras de alta qualidade descritas neste protocolo visualizado é fundamental para o sucesso de qualquer projeto em imunopeptidomia baseada em MS. O protocolo descrito abaixo se concentra na isolação de peptídeos associados ao MHC classe I e II de linhas celulares bem estabelecidas que são adequados para gerar dados de imunopeptidomia de alta qualidade. Os resultados representativos dessas linhas celulares são mostrados no protocolo atual.

Protocolo

O protocolo aqui fornecido foi adaptado dos protocolos estabelecidos13,14,15,16,17,18,19,20. O procedimento geral para a purificação do imunoaffinity (IP) dos peptídeos classe I e II mhc é ilustrado na Figura 1. Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes sobre as linhas celulares e anticorpos utilizados.

1. Acoplamento de contas com os anticorpos (Dia 1): Acoplamento de anticorpos às contas ativadas pelo CNBr

NOTA: Prepare novas soluções para cada novo experimento. Consulte a Tabela de Materiais e Tabela Suplementar 1 para a lista de receitas de reagentes e soluções. Todas as etapas são realizadas em temperatura ambiente (RT). Ao usar um novo anticorpo, verifique a eficiência de vinculação coletando alíquotas-chave (veja a indicação OPCIONAL) e executando o SDS-PAGE de coloração azul Coomassie (Figura 2).

  1. Ativação das contas sepharose CNBr
    1. Pese 80 mg de contas ativadas pelo CNBr por amostra e transfira-as para um tubo cônico de 15 mL.
    2. Para facilitar a resuspensão de contas secas, primeiro, adicione 5 mL de 1 mM HCl e pipeta para cima e para baixo 5 vezes. Em seguida, encha o tubo cônico com um adicional de 8,5 mL de 1 mM HCl.
    3. Gire a 20 rpm (revoluções por minuto) por 30 min no RT usando um dispositivo rotador. Centrifugar as contas a 200 x g por 2 min no RT e remover o supernatante por aspiração.
    4. Adicione 500 μL de tampão de acoplamento à pelota de contas e transfira para um novo tubo de centrífuga de 2,0 mL e mantenha-se de lado para o passo 1.2.2.
  2. Acoplamento de anticorpos às contas ativadas pelo CNBr
    1. Prepare o anticorpo selecionado para o isolamento dos peptídeos classe I ou II do MHC em um novo tubo de microcentrifusagem de 2,0 mL adicionando 2 mg do anticorpo (de acordo com a concentração especificada pelo fabricante). Complete o volume a 1 mL com a solução tampão de acoplamento para obter uma concentração final de 2 mg/mL.
    2. Centrifugar as contas do passo 1.1.4 a 200 x g por 2 min no RT e, em seguida, remover o sobrenatante por aspiração.
    3. Adicione a solução de anticorpos ao tubo de microcentrifuus de 2,0 mL contendo as contas ativadas.
    4. (OPCIONAL) Pegue uma alíquota de 18 μL (INPUT), adicione 6 μL de buffer SDS-PAGE 4x e congele imediatamente.
    5. Gire o tubo de microcentrifuge da etapa 1.2.3 a 20 rpm por 120 min usando um dispositivo rotador. Centrifugar as contas a 200 x g por 2 min e, em seguida, remover o supernaspeso.
    6. (OPCIONAL) Pegue uma alíquota de 18 μL do supernatante (anticorpo não ligado), adicione 6 μL de buffer SDS-PAGE 4x e congele imediatamente.
  3. Bloqueio e lavagem de anticorpos acoplado
    1. Adicione 1 mL de glicina de 0,2 M ao tubo de microcentrífuga contendo as contas acoplado a anticorpos a partir da etapa 1.2.5. Gire a 20 rpm por 60 min no RT usando um dispositivo rotador.
    2. Centrifugar as contas a 200 x g por 2 min, depois remova o supernatante. Adicione 1 mL de PBS (salina tamponada com fosfato).
    3. Centrifugar as contas a 200 x g por 2 min, depois remova o supernatante.
    4. (OPCIONAL) Pegue uma alíquota de 18 μL do supernatante (anticorpo sem saída, última lavagem), adicione 6 μL de tampão 4x SDS-PAGE e congele imediatamente.
    5. Adicione 1 mL de PBS às contas na etapa 1.3.3.
    6. (OPCIONAL) Pegue uma alíquota de 18 μL de mistura de contas (contas acopladas com anticorpos), adicione 6 μL de tampão 4x SDS-PAGE e congele imediatamente.
    7. Mantenha-se a 4 °C até usar no mesmo dia na etapa 2.5.
      NOTA: As contas podem ser preparadas um dia antes da imunocaptura, mas o armazenamento mais longo não foi testado.

2. Lise celular e imunocaptura com contas acopladas de anticorpos (Dia 1)

NOTA: O nível de moléculas de MHC varia de um tipo de célula para outro, e a quantificação de moléculas de MHC/HLA por célula é sugerida21 (Figura 4A). Recomendamos um mínimo de 1 x 108 células para cada IP. Este número de células corresponde a 6-10 mg de proteína de células JY, EL4 e A20 solubilizadas com tampão chaps de 0,5%. Para preparar pelotas de células para IPs, as células devem ser colhidas, centrifugadas e lavadas duas vezes com 5 mL de PBS. Em seguida, as pelotas celulares podem ser armazenadas em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL ou em um tubo cônico de 15 mL a -80 °C até a hora do IP. Observe que os IPs podem ser realizados em pelotas de células colhidas ou congeladas.

  1. Para isolar os peptídeos classe I ou II do MHC, descongele uma pelota congelada de 1 x 108 células aquecendo o fundo do tubo com a palma. Adicione 500 μL de PBS à pelota e pipeta para cima e para baixo até que a suspensão seja homogênea.
    NOTA: Dependendo do tipo de célula, o volume de pelotas celulares pode variar substancialmente. Se 500 μL de PBS não for suficiente para dissolver a pelota celular, use mais PBS até que as células desagregem facilmente enquanto pipet up and down.
  2. Meça o volume total da pelota resuspendida em PBS e transfira para um novo tubo de microcentrifuge de 2 mL. Divida em mais tubos, se necessário.
  3. Adicione um volume de tampão de lise celular (1% tampão de chaps em PBS contendo inibidores de protease, 1 pelota/10 mL de tampão) equivalente ao volume de pelotas de célula resuspendida em PBS medido na etapa anterior. A concentração final do tampão de lise é de 0,5% Chaps.
  4. Gire a 10 rpm por 60 min a 4 °C usando um dispositivo rotador. Centrifugar a célula lysate a 18.000 x g por 20 min a 4 °C com freio completo e transfira o supernante (contendo os complexos MHC-peptídeos) em um novo tubo de microcentrifutura de 2,0 mL.
  5. Recupere as contas acoplado de anticorpos da etapa 1.3.7 por centrifugação a 200 x g por 2 min e remova o supernatante.
  6. Transfira o supernasce de célula na etapa 2.4 para as contas acopladas a anticorpos e incubar com rotação (10 rpm) por 14-18 h (durante a noite) a 4 °C usando um dispositivo rotador.

3. Elução de peptídeos MHC (Dia 2)

NOTA: A coluna de polipropileno permite a eluição de complexos de peptídeos MHC, mantendo as contas na coluna. Para avaliar a proporção de complexos MHC-peptídeos limitados às contas antes e depois da elução ácida com 1% de TFA (ácido trifluoroacético), é possível realizar uma mancha ocidental com alíquotas tomadas em etapas-chave durante o protocolo (ver a indicação OPCIONAL). A mancha ocidental mostrada na Figura 3 revela o enriquecimento dos complexos de peptídeos MHC após a eluição ácida com 1% de TFA. A ausência de sinal nesta fração indicaria que a etapa de elução não foi bem sucedida. Observe que a proporção de complexos MHC-peptídeos desvinculados para as contas também pode ser avaliada em paralelo pela mancha ocidental usando uma alíquota descrita na etapa 3.1.6.

  1. Elução de complexos de peptídeos MHC acoplado das contas de anticorpos acoplado
    1. Remova a tampa inferior da coluna de polipropileno, coloque a coluna no rack da coluna de polipropileno e instale um recipiente vazio por baixo para coletar o fluxo.
      NOTA: É necessária uma coluna por amostra.
    2. Enxágüe a coluna de polipropileno com 10 mL de tampão A e deixe-a drenar pela gravidade. Se a velocidade de fluxo da elução líquida for muito lenta, corte ainda mais a ponta inferior da coluna de polipropileno.
    3. Meça e colete a mistura de contas-lysato (~2 mL) da etapa 2.5 e transfira-a para a coluna de polipropileno.
    4. (OPCIONAL) Pegue uma alíquota de 20 μL (ou 1/100 do volume total) para a mancha ocidental e congele imediatamente. Esta fração corresponde ao total de complexos MHC-peptídeos incubados com as contas.
    5. Deixe a mistura líquida elute pela gravidade.
    6. (OPCIONAL) Colete e meça o fluxo e pegue uma alíquota de 20 μL (ou 1/100 do volume total) para a mancha ocidental e congele imediatamente. Esta fração representa os complexos residuais de peculatos MHC.peptídeos.
    7. Para recuperar a mistura de contas-lysate tanto quanto possível, enxágue o tubo da etapa 3.1.3 com 1 mL de tampão A e transfira-o para a coluna de polipropileno.
    8. Lave as contas retidas na coluna de polipropileno adicionando 10 mL de tampão A. Deixe o tampão de lavagem elute pela gravidade.
    9. Repita a etapa de lavagem com 10 mL de tampão B, 10 mL de tampão A e, em seguida, 10 mL de tampão C.
    10. Remova a coluna de polipropileno do rack e coloque-a na parte superior de um novo tubo de microcentrífa de 2,0 mL. Segure a coluna e o tubo junto com a mão.
    11. Adicione 300 μL de 1% TFA à coluna de polipropileno e misture as contas por pipetar para cima e para baixo 5 vezes.
      NOTA: As contas serão mantidas na coluna de polipropileno, e os peptídeos ligados ao MHC serão eluto no tubo de microcentrifutura de 2,0 mL.
    12. Transfira o eluato em um novo tubo de microcentrífuga de 2,0 mL. Repita o passo 3.1.11 e acumule os 2 elunatos (os elunatos contendo os complexos MHC-peptídeos devem corresponder a um total de 600 μL e serão utilizados na etapa 3.2.4).
    13. (OPCIONAL) Colete uma alíquota de 6 μL (ou 1/100 do volume total) para mancha ocidental e congele imediatamente. Esta fração corresponde aos complexos MHC-peptídeos elucidos das contas.
  2. Dessacação e eluição de peptídeos MHC
    NOTA: A desalagem e a eluição das etapas de peptídeos MHC poderiam ser feitas instalando a coluna C18 em um tubo de microcentrifuuge de 2,0 mL. Para um ajuste melhor, instale as anneals fornecidas pelo fabricante entre a coluna C18 e o tubo de microcentrifus de 2,0 mL. Neste protocolo, uma coluna C18 é usada com uma capacidade de volume de 5-200 μL (6-60 μg). Todas as etapas são realizadas na RT.
    1. Adicione 200 μL de metanol em cima da coluna C18, depois centrífuga a 1546 x g por 3 min. Descarte o fluxo.
    2. Adicione 200 μL de 80%ACN (acetonitrile)/0,1%TFA em cima da coluna C18, depois centrífuga a 1546 x g por 3 min. Descarte o fluxo.
    3. Adicione 200 μL de 0,1% TFA em cima da coluna C18 e, em seguida, centrífuga a 1546 x g por 3 min. Descarte o fluxo.
    4. Carregar 200 μL dos complexos MHC-peptídeos a partir da etapa 3.1.12 em cima da coluna C18. Centrifugar a 1546 x g por 3 min e descartar o fluxo através.
    5. Repita o passo 3.2.4 duas vezes até que o volume completo tenha sido carregado. Observe que os peptídeos MHC são mantidos na coluna C18.
    6. Adicione 200 μL de 0,1%TFA à coluna C18 e, em seguida, centrífuga a 1546 x g por 3 min. Descarte o fluxo.
    7. Transfira a coluna C18 para um novo tubo de microcentrifusagem de 2,0 mL. Peptídeos Elute MHC da coluna C18 adicionando 150 μL de 28%ACN/0,1%TFA.
    8. Centrifugar a 1546 x g por 3 min.
    9. Transfira o fluxo em um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Tenha cuidado para não descartar o fluxo- through; contém os peptídeos isolados da classe I ou II do MHC.
    10. Repetição de passos 3.2.7-3.2.9 duas vezes para um volume total de 450 μL.
    11. Congele os 450 μL de eluato (peptídeos mSC ou II purificados) a -20 °C até que as amostras sejam analisadas por LC-MSMS.
    12. Antes da análise LC-MS/MS, os peptídeos purificados da classe I ou II da etapa 3.2.11 são evaporados para o ressecamento usando um concentrador de vácuo com predefinições de 45 °C para 2 h, nível de vácuo: 100 mTorr e rampa de vácuo: 5.
      NOTA: A evaporação de amostras congeladas é altamente eficiente. Peptídeos secos podem ser regeluizados até a análise.

4. Identificação de peptídeos classe I e II da MHC pela LC-MS/MS

NOTA: Analise o imunopeptidome classe I e II do MHC usando um Orbitrap de alto desempenho e espectrômetros de massa quadrupole de alta resolução6. As seguintes informações são dadas apenas como uma indicação, tendo em conta que os vários instrumentos de espectrometria de massa existentes operam de acordo com diferentes padrões operacionais. Um breve esboço das etapas são discutidos abaixo:

  1. Solubilize as amostras secas (a partir do passo 3,2,12) em 50 μL de ácido fórmico (FA).
  2. Carregue três injeções de 16 μL para cada amostra e separe em uma coluna de fase inversa caseira (150-μm i.d. por 250 mm de comprimento, Júpiter 3 μm C18 300 Å) com um gradiente de 5%-30% ACN-0,1% FA e uma taxa de fluxo de 600 nL/min em um UHPLC de nano-fluxo conectado a um MS.
  3. Adquira cada espectro MS completo em uma resolução de 120000, um AGC de 4 x 105 com modo automático para o tempo de injeção e espectros usando tandem-MS (MS-MS) nos íons precursores mais abundantes por um máximo de 3 s.
    NOTA: Os experimentos de Tandem-MS são realizados utilizando dissociação collisional de maior energia (HCD) com uma energia de colisão de 30%, uma resolução de 30.000, um AGC de 1,5 x 105 e um tempo de injeção de 300 ms.
  4. Processe os arquivos de dados a partir das três injeções/amostra usando um software de análise proteômica LC-MS/MS (por exemplo, PEAKS X) usando os bancos de dados do mouse e humano (UniProtKB/Swiss-Prot (2019_09)).
  5. Selecione 'Digestão enzimada não especificada' para o parâmetro enzim, e 10 ppm e 0,01 Da para tolerâncias de massa em íons precursores e fragmentados, respectivamente.
    NOTA: Modificações variáveis são desamidação (QN) e oxidação (M). Todos os outros parâmetros de pesquisa são os valores padrão. As listas finais de peptídeos são filtradas usando ALC de 80% e com uma taxa de descoberta falsa (FDR) de 1 % usando o software de análise proteômica LC-MS/MS.

5. Visualização de dados de imunopeptidomia

NOTA: A qualidade dos dados de imunopeptidomia gerados pela ESM pode ser avaliada de múltiplas formas, como descrito recentemente22,23. Para visualizar os dados e avaliar sua qualidade geral, composição e especificidade do MHC, a ferramenta de software MhcVizPipe (MVP) pode ser usada.

  1. Siga todas as instruções e documentação relacionada para instalar e executar o software MVP disponível no site do Caron Lab GitHub24.
    NOTA: O MVP fornece uma visão rápida e consolidada da qualidade da amostra, composição e especificidade do MHC. O MVP faz um paralelo com o uso de algoritmos imunopeptidomics bem estabelecidos (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26 e GibbsCluster27) e gera relatórios organizados e fáceis de entender no formato HTML (HyperText Markup Language). Os relatórios são totalmente portáteis e podem ser visualizados em qualquer computador com um navegador web moderno. Consulte dados complementares 1-4 para exemplos de relatórios HTML.

Resultados

O fluxo de trabalho geral para isolar complexos mhc-peptídeos para a análise de imunopeptidomes por MS é ilustrado na Figura 1. Resultados representativos para a verificação da eficiência vinculante de contas do anticorpo (Figura 2) (utilizando o anticorpo Y3 anti-H2Kb) e a eficiência de eluição dos complexos mhc-peptídeos das contas (Figura 3) (utilizando o anticorpo anti-HLA-ABC W6/32). Os ensaios de quantificação baseados em citometria de fluxo21 também foram aplicados para medir o número absoluto de moléculas de MHC classe I por célula EL4 (H2Kb e H2Db) e célula JY (HLA-ABC), como mostrado na Figura 4A.

A reprodutibilidade intra e inter-individual dos resultados utilizando o protocolo atual é mostrada na Figura 4B-E. Os resultados representativos são mostrados para peptídeos classe I mhc identificados de 1 x 108 células EL4 e células 1 x 108 JY. Os resultados foram gerados a partir de dois membros de laboratório diferentes (Usuário 1 e Usuário 2). Para o Usuário 1, o número médio de peptídeos específicos de MHCI detectados a partir de células EL4 e JY foi 1341 e 6361, respectivamente; para Usuário 2, 1933 e 7238, respectivamente (Figura 4B,D). O coeficiente médio de variação (CV) para o número de peptídeos detectados em três diferentes réplicas/experimentos biológicos varia de 1,9%-11% (Figura 4B,D). Embora os CVs para o número de peptídeos detectados nos três experimentos diferentes fossem relativamente pequenos, a identidade dos peptídeos variou consideravelmente (Figura 4C,E). De fato, os diagramas representativos de Venn mostram que a proporção de peptídeos que foram reproduzidos em três réplicas biológicas variou de 39% (Usuário 2, células EL4) a 63% (Usuário 1, células JY) (Figura 4C,E e Tabela Suplementar 2).

Os heatmaps gerados pelo software MVP mostram a força de ligação MHC dos peptídeos identificados usando as ferramentas do conjunto NetMHCpan25,26,28. Duas opções de rotina gibbscluster, que são chamadas de 'GibbsCluster não supervisionado' e 'Allele-Specific GibbsCluster', também são realizadas por MVP para extrair motivos de ligação de peptídeos MHC. Note que o MVP tem limitações; seu objetivo principal não é extrair motivos específicos de alelo e annotendo peptídeos de forma altamente precisa, mas sim fornecer uma visão de olho de pássaro sobre a qualidade geral, composição e especificidade do MHC das amostras.

Para peptídeos mhc classe I (H2Db e H2Kb) em células EL4 (Figura 5A; painéis superiores e Dados Suplementares 1), um mapa de calor representativo mostra que 89% de todos os peptídeos detectados de 8-12-mer são previstos como Binders Fortes (SB: NetMHCpan %Rank <0.5) ou Weak Binders (WB: NetMHCpan %Rank <2) para moléculas de H2Db ou H2Kb. Os clusters de sequência gerados a partir dos peptídeos de 8-12-mer estão em concordância com logotipos relatados para H2Db (asparagine em P5 e Leucina em P9) e H2Kb (fenilalanina em P5 e leucina em P8) (Figura 5)29. Vale ressaltar que um terceiro motivo dominante (histidina em P7 e leucina em P9) bem como motivos adicionais 'artefactuais' podem ser observados usando o anticorpo M1 (Dados Suplementares 1). Na verdade, o anticorpo M1 é conhecido por reagir cruzadamente com a molécula qa2 não clássica e, portanto, peptídeos associados a Qa2 também são detectados por MS (Dados Suplementares 1). Aqui, para a simplicidade, a Figura 5 se concentra em mostrar os motivos de ligação de peptídeos bem estabelecidos para os dois alelos clássicos de H2b (ou seja, H2Db ou H2Kb) expressos em células EL4.

Para peptídeos humanos classe I (HLA-ABC) em células JY (Figura 5A; painéis inferiores e Dados Suplementares 2), um mapa de calor representativo mostra que 97% de todos os peptídeos detectados 8-12-mer são previstos para ser SB ou WB para HLA-A*0201, -B*0702 ou -C*0702. Os peptídeos foram agrupados para visualizar motivos de ligação de peptídeos para HLA-A*0201 e -B*0702. O motivo de vinculação para HLA-C*0702 não é mostrado na Figura 5A porque o alelo C*0702 tem um nível de expressão relativamente baixo. Portanto, poucos peptídeos C*0702 foram isolados e identificados para gerar um motivo representativo C*0702. Observe que o motivo C*0702 pode ser visualizado em outros estudos30,31,32 ou no site NetMHCpan 4.1 Motif Viewer33.

Para peptídeos hla-dr humanos classe II (HLA-DR) em células JY (Figura 5B; painéis superiores e Dados Suplementares S3), um mapa de calor representativo mostra que 70% de todos os peptídeos detectados de 9-22-mer são previstos como SB ou WB para HLA-DRB1*0404 e -DRB1*1301. Motivos de ligação de peptídeos para estes dois alelos são mostrados (Figura 5B). Observe que os motivos de ligação de peptídeos aqui mostrados podem não estar em total concordância com os logotipos recentemente relatados para HLA-DRB1*0404 e -DRB1*130134. Essa discrepância destaca a incapacidade atual do MVP/NetMHCpan de anotar precisamente peptídeos aos alelos classe II HLA que são menos caracterizados, como HLA-DRB1*0404 e -DRB1*1301 expressos em células JY. Informações adicionais sobre motivos de ligação de peptídeos classe II podem ser encontradas em outros estudos34,35 e no site NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer36.

Finalmente, para peptídeos mhc classe II (H2-IAd e H2-IEd) em células A20 (Figura 5B; painéis inferiores e Dados Suplementares 4), um mapa de calor representativo mostra que 87% de todos os peptídeos detectados de 9-22-mer são previstos para ser SB ou WB para H2-IAd ou H2-IEd. Os motivos de ligação de peptídeos para estes dois alelos estão em concordância com os logotipos relatados37.

Relatórios HTML completos gerados pelo software MVP para avaliar a qualidade geral e a especificidade do MHC das amostras estão disponíveis nos Dados Suplementares 1-4.

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Figura 1: Esquema do procedimento completo para o isolamento dos peptídeos classe I e II da MHC. (A-B)100 milhões de células são pelotas e lysed com tampão Chaps de 0,5%. (C) O lisecelular é centrifuuro, e o supernante é adicionado às contas CNBr-sepharose acopladas ao anticorpo desejado de antemão e (D) incubado 14-18 h a 4 °C. (E) Após a imunocaptura, as contas são transferidas para uma coluna de polipropileno e lavadas, e os complexos de peptídeos MHC são elucidos com uma solução TFA de 1%. (F) Os peptídeos são desálidos e elucidos usando uma coluna C18. (G) Posteriormente, os peptídeos são secos e analisados por espectrometria de massa tandem. (H) A qualidade dos peptídeos isolados MHC classe I e II pode ser avaliada com base nos subtipos HLA usando o software MhcVizPipe disponível livremente. Figura criada com BioRender.com (NT22ZL8QSL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Coloração de gel coomassie para rastrear a eficiência de ligação de anticorpos para contas ativadas pelo SEpharose CNBr. As alíquotas de volumes equivalentes foram carregadas em gel SDS-PAGE de 12%, seguido por coloração azul Coomassie: contas + pré-acoplamento de anticorpos (1), anticorpo desvinculado após passo de acoplamento (2), supernante após a última lavagem após o acoplamento (3) e contas acopladas com anticorpos (4). A eficiência da ligação é ilustrada por uma diminuição significativa na intensidade de coloração de sinal das cadeias leves e pesadas de H2Kb quando as contas são covalentemente ligadas (Pista 4) às contas CNBr em comparação com o anticorpo antes do acoplamento (Pista 1). A figura foi reimpressa e adaptada do bioRxiv38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Mancha ocidental para rastreamento de complexos de peptídeos MHC após elução ácida de contas ativadas por CNBr acoplados a anticorpos. As alíquotas retiradas das etapas indicadas no protocolo (1/100 do volume total medido) foram carregadas em um gel SDS-PAGE de 12% e transferidas para a membrana nitrocelulose: Contas + lisato após imunocaptação e última lavagem (A); supernante dos complexos de última lavagem (B) e MHC-peptídeos elucidos das contas (C). O forte sinal de detecção dos complexos MHC-peptídeos em (C) usando anticorpos de cadeia pesada anti-HLA-ABC (Abcam, #ab 70328, 1:5000) confirmou o isolamento dos complexos MHC-peptídeos após eluição ácida. Note-se que é possível avaliar a proporção de complexos de peptídeos MHC que não foram capturados pelas contas acopladas de anticorpos coletando o fluxo da etapa 3.1.6. Uma alíquota pode ser adicionada à mancha ocidental (não mostrada neste gel). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Identificação de peptídeos classe I da CLASSE I de JY e EL4. (A) Histograma mostrando o número absoluto de moléculas de superfície celular H2Db e H2Kb por célula EL4 e de moléculas de HLA-ABC por célula JY. A quantificação foi realizada por citometria de fluxo. Erro médio e padrão da média foram obtidos a partir de três réplicas biológicas. (B, D) Histograma mostrando o número médio e o desvio padrão da média dos peptídeos classe I da MHC identificados por dois usuários independentes (USER_1 [U1] e USER_2 [U2]). O número médio e o desvio padrão da média dos peptídeos classe I mhc detectados a partir de células EL4 do rato (B) e células JY humanas (D) são mostrados. São indicados coeficientes de variação (CV) em três réplicas biológicas independentes. (C, E) Diagramas de Venn mostrando o número de peptídeos que foram reproduzidos em células EL4 (C) e JY (E) por dois usuários independentes (U1 e U2) em três réplicas biológicas independentes. A Figura 4A foi reimpressa e adaptada do bioRxiv38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-12723
Figura 5: Visualização de dados imunopeptidomicos usando a ferramenta de software MVP. Análise de dados de peptídeos de mouse e humano (A) MHC classe I e (B) MHC classe II. São mostrados mapas de afinidade de ligação representativa (painéis esquerdos) e motivos de ligação de peptídeos (painéis à direita). As cores do heatmaps representam a afinidade de ligação MHC prevista pelo NetMHCpan 4.1 (%rank). Os Aglutinantes Fortes são vermelhos (%rank <0.5), Weak Binders são azuis (%rank <2) e Non-Binders são amarelos (%Rank >2). A proporção (%) de peptídeos de 8-12mer (A) e peptídeos de 9-22mer (B) que são SB ou WB é indicada entre parênteses. Motivos de ligação de peptídeos foram gerados por MVP usando a opção 'Allele-specific Gibbscluster'. Estes resultados representativos foram obtidos a partir de 1 x 108 células e utilizando os seguintes anticorpos e linhas celulares: anticorpoS M1 e células EL4 para peptídeos mhc tipo I do rato; Anticorpos W6/32 e células JY para peptídeos humanos classe I da CLASSE I; Anticorpo M5 e células A20 para peptídeos classe II do mouse MHC; Anticorpos L243 e células JY para peptídeos humanos classe II. Consulte os Dados Suplementares 1-4 para acessar os relatórios HTML completos gerados pelo software MVP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dados Complementares 1-4: Clique aqui para baixar este Arquivo.

Dados complementares 1: Relatório HTML gerado pelo software MVP a partir de peptídeos que foram isolados de células 1 x 108EL4 usando o anticorpo M1. Três réplicas biológicas são mostradas. Este relatório está relacionado com a Figura 4 e Figura 5 e os peptídeos representativos estão listados na Tabela Suplementar 2.

Dados complementares 2: Relatório HTML gerado pelo software MVP a partir de peptídeos que foram isolados de células 1 x 108JY usando o anticorpo W6/32. Três replas biológicos são mostrados. Este relatório está relacionado com a Figura 4 e a Figura 5, e os peptídeos representativos estão listados na Tabela Suplementar 2.

Dados complementares 3: Relatório HTML gerado pelo software MVP a partir de peptídeos que foram isolados de células 1 x 108JY usando o anticorpo L243. Este relatório está relacionado com a Figura 5, e os peptídeos representativos estão listados na Tabela Suplementar 2.

Dados complementares 4: Relatório HTML gerado pelo software MVP a partir de peptídeos que foram isolados de células 1 x 108A20 usando o anticorpo M5. Este relatório está relacionado com a Figura 5, e os peptídeos representativos estão listados na Tabela Suplementar 2.

Tabela suplementar 1: Lista de buffers. São descritas receitas para todos os buffers usados no protocolo. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela suplementar 2: Listas representativas de peptídeos associados a H2Db/Kb, HLA-ABC, HLA-DR e H2-IAd/IEd. Esta tabela contém as listas de peptídeos representativos MHC classe I e II isolados das linhas celulares MOUSE EL4 e A20, respectivamente, e HLA classe I e II da linha celular JY humana. Esses dados foram depositados no ProteomeXchange (PXD028633). Clique aqui para baixar esta Tabela.

DISPONIBILIDADE DE DADOS:

Os conjuntos de dados utilizados neste manuscrito foram depositados no ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset): PXD028633.

Discussão

Duas linhas celulares de camundongos (EL4 e A20), uma linha de células humanas (JY) e cinco anticorpos disponíveis comercialmente [M1 (anti-H2Db/Kb), Y3 (anti-H2Kb), M5 (anti-H2-IAD/IEd), W6/32 (anti-HLA-ABC) e L243 (anti-HLA-DR)] foram testados e validados no contexto deste protocolo e fornecem dados de imunopeptidomia de alta qualidade. Outros anticorpos anti-HLA estão disponíveis (por exemplo, anti-HLA-A2 BB7.2), mas não foram testados aqui. Note que o anticorpo W6/32 é amplamente utilizado e o anticorpo mais estabelecido no campo; permite o isolamento de peptídeos apresentados por todas as moléculas de HLA-ABC em humanos e foi previamente relatado por laboratórios especializados para trabalhar a partir de várias fontes biológicas, como tecidos frescos ou congelados8,39, células mononucleares de sangue periféricos e células mononucleares de medula óssea40, biópsias41, xenots de enxerto41,42, autópsias43 e amostras de plasma44,45.

A preparação de novas soluções que são utilizadas ao longo do protocolo é fundamental. Em particular, o uso de soluções ácidas frescas em garrafas de vidro é fundamental para evitar a contaminação subsequente das amostras analisadas pela ESM. Além disso, quando o protocolo é feito pela primeira vez e/ou com um novo anticorpo, é importante avaliar que o anticorpo está de fato acoplado às contas CNBr Sepharose usando um gel Coomassie azul. As etapas de lavagem das contas acopladas de anticorpos após a imunocaptura dos complexos de peptídeos MHC também são fundamentais para evitar a contaminação de peptídeos não-MHC. Por fim, é necessário um cuidado especial para não descartar os elunatos após a eluição dos complexos MHC-peptídeos com 1% de TFA e a eluição dos peptídeos da coluna C18 com ACN28%/0,1% FA.

Os protocolos existentes disponíveis na literatura descrevem etapas adicionais para purificar ainda mais os peptídeos no final do procedimento de isolamento, por exemplo, fracionamento de peptídeos por diferentes métodos14,46 ou ultrafiltração usando filtros de 10-30 kDa13,47. O protocolo atual não fornece detalhes sobre essas etapas adicionais e é suficiente para fornecer dados de imunopeptidomia de alta qualidade. No entanto, tais medidas poderiam ser consideradas por não-especialistas para modificar e solucionar problemas para otimizar ainda mais o procedimento de isolamento do peptídeo.

O tipo de contas e o tipo de tampão de eluição ácida que são usados para elute complexos DE MHC das contas também podem ser modificados para solução de problemas13,14,15,16,17,18,19. Nesse sentido, as contas ativadas pelo SEPHArose CNBr são geralmente um bom ponto de partida, uma vez que são relativamente baratas, além de mostrar flexibilidade em termos de ligação com vários tipos de anticorpos. No protocolo atual, as contas ativadas pelo SEPHAROSE CNBr apresentaram um desempenho relativamente bom usando cinco anticorpos disponíveis comercialmente diferentes (ou seja, M1, Y3, W6/32, L243 e M5). Além das contas ativadas pelo SEPHArose CNBr, as contas de sepharose A ou G ou A/G 4 Fast Flow também são fáceis de manusear, e embora relativamente mais caras, podem gerar resultados semelhantes. Outro fator a considerar é a afinidade do anticorpo para a proteína A ou G. Além disso, contas magnéticas sepharose também são muito fáceis de usar, mas são relativamente caras. Independentemente do tipo de contas selecionadas por não-especialistas, é encorajado a coletar alíquotas em etapas críticas do protocolo e executar géis SDS-PAGE manchados de Coomassie azuis para rastrear a eficiência vinculante do anticorpo às contas, como mostrado na Figura 2.

Outro fator importante que influencia o sucesso do isolamento dos peptídeos MHC refere-se ao tipo de tampão de eluição ácida usado para isolar os complexos de peptídeos MHC das contas. Diferentes buffers foram relatados, incluindo 0,1%, 1% ou 10% TFA, 0,2% FA e 10% ácido acético. 1% TFA foi o tampão de eluição trabalhando para todos os anticorpos testados. Esta etapa também pode ser traçada por manchas ocidentais contra as moléculas de MHC usadas para capturar peptídeos MHC, como mostrado na Figura 3.

Todos os tampões contendo acetonitrilo (ACN) e/ou ácido trifluoroacético (TFA) são agressivos e podem levar à contaminação da amostra com pequenas substâncias moleculares e poliméricas, como plastificantes, se em contato com plástico. Para evitar tais problemas, todas as soluções que contenham um solvente orgânico e/ou TFA são preparadas diariamente e armazenadas em uma garrafa de vidro até o uso. A maioria das etapas são realizadas no tubo plástico Protein LoBind. Estes tubos são especificamente projetados para proteômica e são feitos da mais alta qualidade, polipropileno virgem livre de biocidas, plastificantes e látex. Eles também são produzidos com moldes otimizados e altamente polidos sem o uso de agentes de deslizamento. Essas precauções são importantes a considerar para permitir a geração de dados de imunopeptidomia de alta qualidade.

O anticorpo é uma limitação importante para o isolamento de peptídeos ligados ao MHC. O anticorpo W6/32 permite o isolamento de peptídeos apresentados por todas as moléculas classe I HLA-ABC em humanos e é o anticorpo mais amplamente utilizado e estabelecido no campo. A digitação hla de alta resolução de linhas celulares humanas ou bioespecimens não é uma necessidade na aplicação do anticorpo W6/32, mas é, no entanto, recomendada para certas aplicações para facilitar a interpretação de dados48. As informações de digitação HLA/MHC também podem ser encontradas em recursos públicos para várias linhas celulares e modelos de mouse49. Além do anticorpo W6/32, os outros quatro anticorpos (M1, M5, Y3 e L243) que foram testados e validados no contexto deste protocolo estão todos disponíveis comercialmente. Por outro lado, muitos outros anticorpos que foram relatados em estudos anteriores de imunopeptidomia não foram amplamente adotados pela comunidade e não estão disponíveis comercialmente ou estão disponíveis através da cultura de linhas celulares hybridoma, que é relativamente cara.

Outra limitação importante para o isolamento dos peptídeos ligados ao MHC é a quantidade de material inicial necessário. A quantidade necessária é inversamente proporcional ao nível de expressão das moléculas de MHC na superfície celular, que podem ser quantificadas por citometria de fluxo (Figura 4A). As células que mostram altos níveis de expressão de moléculas de MHC (por exemplo, células dendríticas e células hematopoiéticas em geral) geralmente produzem dados de imunopeptidomias de alta qualidade. Laboratórios especializados usam de até 50 milhões de células 50, mas 100 milhões a 1 bilhão de células são recomendadas para não especialistas. Também foram relatados uso de biópsia tecidual (<13 mg)41, xenoenxerto42,43, autópsia44 e plasma45,46 amostras, mas permanecem desafiadoras para laboratórios não especializados. Além disso, o número total de peptídeos associados ao MHC é bem documentado para linhas celulares estabelecidas (aqui, entre ~2000 e ~10000 peptídeos dependendo da linha celular e anticorpo utilizado), mas as quantidades absolutas de peptídeos naturalmente apresentados que são eficientemente puxados para baixo pela técnica permanecem debatidas. De fato, estudos anteriores estimaram que a eficiência do procedimento de isolamento é dependente de peptídeos e pode ser de 0,5%-2%51. Outras limitações na imunopeptidomia são a reprodutibilidade dos métodos e a incapacidade das ferramentas do conjunto NetMHCpan de anotar corretamente peptídeos aos alelos MHC menos caracterizados. Nesse sentido, o desenvolvimento e a aplicação de métodos de aquisição relativamente novos e independentes de dados MS 7,32,52, bem como novos algoritmos de previsão de vinculação de peptídeos e de peptídeos MHC31,34,53,54 espera-se que melhore a reprodutibilidade e a precisão da anotação de peptídeos em imunopeptidomics. A imunopeptidomia está enfrentando outras limitações quanto à aquisição de EM e análise computacional de peptídeos associados ao MHC e são cobertos em outros lugares1,6,55.

O isolamento dos peptídeos associados ao HLA-ABC a partir de amostras humanas usando o anticorpo W6/32 é bem estabelecido e amplamente aplicado por muitos grupos de pesquisa, o isolamento dos peptídeos associados ao MHC do rato classe I e II é relativamente menos estabelecido. Por isso, são necessários protocolos robustos para o isolamento de ligantes MHC do mouse. Aqui, fornecemos um protocolo otimizado para o isolamento dos peptídeos classe I do MHC e peptídeos classe II MHC de duas linhas de células de mouse de origem C57BL/6 e BALB/c, respectivamente. Especificamente, o protocolo permite o isolamento de peptídeos associados à classe I H2Kb e H2Db usando o anticorpo M1, bem como peptídeos associados à classe II H2-IAd e H2-IEd usando o anticorpo M5. Assim, a divulgação e aplicação do protocolo atual deve facilitar a pesquisa de imunopeptidomia básica e translacional em diversos modelos de mouse.

O protocolo pode ser usado para estabelecer e padronizar um fluxo de trabalho imunopeptidomico, bem como para avaliar novos protocolos. Por exemplo, ele pode ser adaptado e otimizado para realizar a triagem imunopeptidômica em várias matrizes biológicas que vão do sangue/plasma ao tecido fresco ou congelado ao FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded). Além disso, o protocolo promoverá a reprodutibilidade intra e intersetiva do procedimento de preparação da amostra em imunopeptidomia e, portanto, espera-se encontrar ampla aplicação em pesquisas básicas e clínicas.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos a Pierre Thibault, Eric Bonneil, Joël Lanoix, Caroline Côté (Instituto de Pesquisa em Imunologia e Câncer, Université de Montréal) e Anthony Purcell (Universidade Monash) por seus comentários perspicazes. Este trabalho foi apoiado por financiamento do Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), da Fundação Cole, chu Sainte-Justine, e das Fundações Charles-Bruneau, Fundação Canadá para Inovação, Conselho Nacional de Ciências e Engenharia (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) e do Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (#174924).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
A20 cell lineATCCTIB-208mouse B lymphoblast
Acetonitrile, LC/MS GradeFisherScientificA955-4
anti-Human HLA A, B, C (W6/32) - MHC class IBioXcellBE0079
anti-Human/Monkey HLA-DR (L243) - MHC class IIBioXcellBE0308
anti-Mouse H2 (M1/42.3.9.8) - MHC class IBioXcellBE0077
anti-Mouse H2-IAd/IEd (M5/114) - MHC class IIBioXcellBE00108
anti-Mouse H2Kb (Y3) - MHC class IBioXcellBE0172
BupH Phosphate Buffered Saline Packs (PBS)ThermoFisher28372Pouch contents dissolved in a final volume of 500 mL deionized water (FisherScientific, W64)
CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)EMDMilipore220201-10MG
CNBr-activated SepharoseCytivia# 17-0430-01
EL4 cell lineATCCTIB-39mouse T lymphoblast
epTIPS LoRetention Tips, 1000 µL/EppendorfFisherScientific02-717-352Better results with low retention material
epTIPS LoRetention Tips, 200 µL/EppendorfFisherScientific02-717-351Better results with low retention material
Formic Acid, LC/MS GradeFisherScientificA117-50
GlycineFisherScientificRDCG0250500
Hydrochloric acid solutionFisherScientific60-007-11
JY cell lineSigma Aldrich94022533-1VLEBV-immortalised B cell lymphoblastoid line
Methanol, LC/MS GradeFisherScientificA456-4
Poly prep chromatography columns (polypropylene column)Bio-Rad731-1550referred as polypropylene column in the protocol
Proteases inhibitorThermoFisherA329631 pellet per 10 mL of cell lysis buffer
QifikitDakoK007811-8
Sodium BicarbonateAmresco# 0865-1kg
Sodium ChlorideFisherScientificMSX04201
Solid phase extraction disk, ultramicrospin column C18The nest groupSEMSS18Vcapacity of 6–60 µg, max volume of 200 µL
Trifluoroacetic Acid (TFA), LC-MS GradeFisherScientificPI85183
TrisFisherScientificT395-500
Tris-HClFisherScientific#10812846001
Tube LoBind 1.5 mL/EppendorfFisherScientificE925000090Better results with low retention material
Tube LoBind 2 mL/EppendorfFisherScientific13-698-795Better results with low retention material
Water, LC/MS GradeFisherScientificW64

Referências

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