Avaliação do viés de julgamento do rato através de uma tarefa de escavação olfativa

Resumo

Este artigo fornece uma descrição detalhada de um novo protocolo de viés de julgamento do mouse. Evidências da sensibilidade dessa tarefa olfativa de escavação ao estado afetivo também são demonstradas e sua utilidade em diversos campos de pesquisa é discutida.

Resumo

Os vieses de julgamento (JB) são diferenças na forma como os indivíduos em estados afetivos/emocionais positivos e negativos interpretam informações ambíguas. Esse fenômeno tem sido observado há muito tempo em humanos, com indivíduos em estados positivos respondendo à ambiguidade "otimista" e aqueles em estados negativos, em vez disso, mostrando "pessimismo". Pesquisadores com o objetivo de avaliar o afeto animal têm aproveitado essas respostas diferenciais, desenvolvendo tarefas para avaliar o viés de julgamento como indicador de estado afetivo. Essas tarefas estão se tornando cada vez mais populares em diversas espécies e campos de pesquisa. No entanto, para camundongos de laboratório, os vertebrados mais utilizados na pesquisa e uma espécie fortemente dependente para modelar distúrbios afetivos, apenas uma tarefa JB foi validada com sucesso como sensível às mudanças no estado afetivo. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada desta nova tarefa murine JB, e evidências de sua sensibilidade ao efeito do rato. Embora os refinamentos ainda sejam necessários, a avaliação do mouse JB abre as portas para responder tanto questões práticas sobre o bem-estar do rato, quanto questões fundamentais sobre o impacto do estado afetivo na pesquisa translacional.

Introdução

Medir viés de julgamento afetivamente modulado (a partir de agora JB) provou ser uma ferramenta útil para estudar os estados emocionais dos animais. Essa abordagem inovadora toma emprestado da psicologia humana, uma vez que os seres humanos que experimentam estados afetivos positivos ou negativos (emoções e humores de longo prazo) demonstram de forma confiável diferenças na maneira como processam informações ^1,2,3. Por exemplo, humanos que experimentam ansiedade ou depressão podem interpretar expressões faciais neutras como negativas, ou frases neutras como^{ameaçadoras 4,5}. É provável que esses vieses tenham um valor adaptativo e, portanto, sejam conservados entre as espécies ^6,7. Pesquisadores que pretendem avaliar o afeto animal têm se aproveitado inteligentemente desse fenômeno, operacionalizando o otimismo como o aumento da expectativa de recompensa em resposta a pistas neutras ou ambíguas, e o pessimismo como o aumento da expectativa de punição ou ausência de recompensa ^8,9. Assim, em um cenário experimental, respostas otimistas e pessimistas a estímulos ambíguos podem ser interpretadas como indicadores de efeito positivo e negativo, respectivamente^10,11.

Em comparação com outros indicadores de afeto animal, as tarefas de JB têm o potencial de serem ferramentas particularmente valiosas, pois são capazes de detectar tanto a valência quanto a intensidade dos estados afetivos^10,11. A capacidade das tarefas de JB de detectar estados positivos (por exemplo, Rygula et ^al.12) é especialmente útil, uma vez que a maioria dos indicadores de afeto animal estão limitados à detecção de estados negativos¹³. Durante as tarefas de JB, os animais são tipicamente treinados para responder a uma sugestão discriminativa positiva que prevê recompensa (por exemplo, tom de alta frequência) e uma sugestão discriminatória negativa prevendo punição (por exemplo, tom de baixa frequência), antes de serem apresentados com uma sugestão ambígua (por exemplo, tom intermediário)⁸. Se em resposta a pistas ambíguas um animal "otimista" realiza a resposta treinada para a sugestão positiva (como se esperasse recompensa), isso indica um viés de julgamento positivo. Alternativamente, se os animais demonstrarem a resposta negativa treinada para evitar punição, isso indica um viés de 'pessimismo' ou de julgamento negativo.

Desde o desenvolvimento da primeira tarefa bem sucedida de JB para animais por Harding e colegas⁸, várias tarefas de JB foram desenvolvidas para uma ampla gama de espécies em diversos campos de pesquisa⁷. Mas, apesar de sua crescente popularidade, as tarefas de JB animal são muitas vezes intensivas em mão-de-obra. Além disso, talvez por serem metodologicamente diferentes das tarefas humanas que as inspiraram, às vezes produzem resultados nulos ou contra-intuitivos^{14 e geralmente} produzem apenas pequenos tamanhos de efeito de tratamento¹⁵. Como resultado, as tarefas jb podem ser desafiadoras para desenvolver e implementar. De fato, para ratos de laboratório, os vertebrados mais utilizados em pesquisa^16,17 e uma espécie fortemente dependente para modelar distúrbios afetivos¹⁸, apenas uma tarefa JB foi validada com sucesso como sensível às mudanças no estado afetivo¹⁹, apesar de muitas tentativas na última década (ver material suplementar de Resasco et ^al.19  para um resumo). Este artigo descreve a tarefa murine JB recentemente validada, detalhando seu design biologicamente relevante, e destacando as maneiras que essa tarefa humana pode ser aplicada para testar hipóteses importantes relevantes para o efeito do rato. No geral, o protocolo pode ser implementado para investigar os efeitos afetivos de qualquer variável de interesse em JB em camundongos. Isso incluiria variáveis de tratamento categóricos como descrito aqui (efeitos de drogas ou doenças, condições ambientais, antecedentes genéticos, etc.), ou relações com variáveis contínuas (alterações fisiológicas, comportamentos de gaiola doméstica, etc.).

Protocolo

Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Guelph (AUP #3700), realizados em conformidade com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais, e relatados de acordo com a ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)²⁰ requisitos.

1. Preparação do experimento

1. Design experimental (ver Tabela 1).
   NOTA: Este teste comportamental é uma tarefa de escavação go/go baseada em perfume, na qual os ratos têm que cavar para recompensas de alto ou baixo valor. Ele usa uma arena retangular (Figura 1), com dois braços, em que um braço é perfumado enquanto o outro não é perfumado. Como descrito abaixo, os camundongos são treinados para discriminar entre sinais de odor positivo e negativo antes de serem apresentados com uma mistura de odor ambígua.
   1. Pseudorandomly atribui gaiolas a grupos de estímulo discriminativo positivo de menta ou baunilha (DS+) da seguinte forma.
      NOTA: Este protocolo só foi validado para camundongos atribuídos à mistura de odor DS+ baunilha (ver Resultados Representativos e Resasco et ^al.19 para obter detalhes). No entanto, os testes piloto são fortemente recomendados para confirmar que as misturas DS+, DS e ambíguas atendem aos requisitos para avaliação válida do JB (etapas 4.7.3 e 5.3). Assim, os métodos aqui descritos incluem o teste de uma baunilha e um DS+de menta, para fornecer um exemplo de um grupo que atende com sucesso aos requisitos para avaliação de JB (os camundongos DS+ de baunilha) e um grupo que não consegue fazê-lo (os ratos de menta DS+). Testes pilotos anteriores identificariam este tipo de problema com antecedência.
   2. Ratos de menta DS+: para esses ratos, durante a configuração da arena para treinamento (veja o passo 1.4 abaixo), marque distribuidores de perfume e potes contendo uma recompensa de alto valor com a sugestão de odor de menta, e aqueles que não contêm recompensa com a deixa de odor de baunilha.
   3. Ratos de baunilha DS+: para esses ratos, durante a configuração da arena para treinamento (veja o passo 1.4 abaixo), marque distribuidores de perfume e potes contendo uma recompensa de alto valor com a sugestão de odor de baunilha, e aqueles que não contêm recompensa com a sugestão de odor de menta.
      NOTA: Esta tarefa consiste em ensaios de treinamento reforçados e ensaios de teste não reforçados. Durante testes não forçados, nenhuma recompensa é acessível aos ratos (ver passo 1.4.3 abaixo) e a deixa de odor ambígua para ratos de hortelã e baunilha DS+ é a mesma mistura de hortelã/baunilha 1:1.
   4. Pseudorandomly atribui gaiolas a grupos de braço perfumados à esquerda ou à direita (contrabalanciamento em grupos de odor DS+) da seguinte forma.
   5. Esquerda: para estes ratos, durante a configuração da arena para treinamento e testes (ver passo 1.4 abaixo), marque o braço esquerdo com a sugestão de odor DS+ ou DS apropriado e garanta que o braço direito esteja sempre semcenido (marcado apenas com água destilada).
   6. À direita: para estes ratos, durante a configuração da arena para treinamento e testes (veja o passo 1.4 abaixo), marque o braço direito com a sugestão de odor DS+ ou DS apropriada e garanta que o braço esquerdo esteja sempre semcenente (marcado apenas com água destilada).
   7. Atribua aleatoriamente a cada animal um "código cego" da seguinte forma.
      NOTA: A cegueira permite que o pesquisador manuseando os camundongos e pontuando seu comportamento permaneça inconsciente da identidade ou tratamento animal, evitando viés subjetivo indesejável. Trata-se de uma etapa obrigatória para cumprir as diretrizes DO ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) e outros documentos de referência²⁰.
   8. Adicione uma coluna para código cego em uma planilha contendo cada ID animal e o tratamento correspondente a que foram atribuídos.
   9. Atribua aleatoriamente a cada animal um código único (por exemplo, uma combinação de letras e números "A2") que não está relacionado ao número da gaiola ou tratamento.
      NOTA: Toda a randomização deve ser realizada usando um gerador de números aleatórios (por exemplo, Random.org). Durante esta etapa de randomização, contra-equilíbrio entre o tratamento, a tensão, etc., quando aplicável. Que isso seja feito por um assistente de pesquisa que permanecerá "sem cegos" para o tratamento durante os experimentos. Este indivíduo não deve coletar dados durante os testes, para evitar avaliações tendenciosas.
   10. Durante toda a coleta de dados, forneça ao pesquisador "cego" que está em latência de pontuação ao vivo e por vídeo para cavar e cavar a duração com apenas o código cego do animal para manter o pesquisador cego ao tratamento.
       NOTA: As planilhas utilizadas durante a coleta de dados incluirão apenas o código cego do animal e a latência correspondente para escavar e cavar a duração de cada ensaio. Ao final dos experimentos, as informações correspondentes de RG e tratamento animal podem ser adicionadas à planilha, assim" pesquisadores "sem cegueira" para análises de dados.
2. Preparação material.
   1. Recompensas alimentares de alto valor: quebre chips de banana adoçados secos em aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm à mão.
   2. Recompensas alimentares de baixo valor: usando uma tábua de corte e uma faca, corte a comida de roedor (da dieta regular dos animais) em aproximadamente 0,125 cm³ pedaços.
      NOTA: Testes piloto para identificar recompensas de alto e baixo valor devem ser realizados antes de iniciar a tarefa.
   3. Essências de hortelã e baunilha: Utilizando uma seringa de 1 mL ou micropipette, adicione hortelã e extrato de baunilha em tubos de centrífuga rotulados. Diluir extratos 1:4 com água destilada e misturar invertendo várias vezes. Faça isso diariamente e inverta repetidamente antes de usar para garantir que as misturas sejam frescas e consistentes.
   4. Mistura de odor ambíguo: depois que as essências de hortelã e baunilha foram diluídas, adicione volumes iguais a um tubo de centrífuga (criando uma mistura 1:1 das essências diluídas). Faça isso no dia do teste de respostas à mistura de odor ambíguo, e inverta repetidamente antes de usar para garantir que a mistura seja fresca e consistente.
      NOTA: Os testes piloto para identificar diluições adequadas e misturas intermediárias de odor são fortemente incentivados para garantir a utilidade de sondas ambíguas, uma vez que a intensidade pode variar entre fabricantes, lotes, etc. Se várias pistas ambíguas forem oferecidas, atribua aleatoriamente ratos ao ponto médio próximo, próximo ao negativo. Consulte Discussão para obter mais detalhes.
   5. Almofadas de algodão: corte cada almofada de algodão circular em seis pedaços iguais (permitindo que eles se encaixem dentro das fitas de tecido usadas como distribuidores de perfume).
      NOTA: O número de recompensas alimentares de alto e baixo valor, almofadas de algodão e volumes de misturas de odor dependerá do número de indivíduos que estão sendo testados. Consulte a Tabela 1 para o número de ensaios por assunto em cada fase e a Tabela 2 para os materiais necessários em cada tipo de ensaio.
   6. Identifique a área experimental: Realize treinamento e testes em um banco na sala da colônia ou em outro lugar. Realize todos os ensaios sob luz vermelha durante a fase escura quando os ratos estiverem ativos.
3. Pré-treinamento (1 semana antes dos experimentos) para escavação na gaiola doméstica.
   1. Para cada gaiola que está sendo testada, despeje uma pequena quantidade de cama corncob em duas panelas de escavação (apenas o suficiente para cobrir o fundo da panela) para ajudar as guloseimas a permanecer no centro da panela quando estiver enterrada.
   2. Em um pote, coloque pedaços de recompensa de alto valor em cima da camada de corncob para que cada rato na gaiola possa ter uma peça (por exemplo, três pedaços de chips de banana para uma gaiola de três ratos). No outro pote, coloque pedaços de recompensa de baixo valor em cima da camada de corncob para que cada rato na gaiola possa ter uma peça (por exemplo, três pedaços de comida para uma gaiola de três ratos).
   3. Despeje lentamente a cama de corncob sobre as guloseimas em cada panela, cobrindo-as e enchendo os potes a uma altura de 3 cm.
   4. Simultaneamente coloque um pote de alto valor e um pote de baixo valor em cada gaiola por 10 minutos. Depois de 10 minutos, remova os potes de todas as gaiolas.
   5. Descarte qualquer corncob e guloseimas restantes na panela. Limpe todos os potes completamente com 70% de etanol para evitar que odores de animais e gaiolas influenciem futuros ensaios.
   6. Repetição de passos 1.3.1-1.3.5 uma vez por dia durante 5 dias consecutivos.
      NOTA: O objetivo desta fase é permitir a todos os companheiros de gaiola a oportunidade de cavar e comer um mimo antes do início do treinamento formal. Isso também facilita a habituação de recompensas alimentares.
4. Arena montada para treinamento e testes.
   1. Coloque a arena em uma bancada sob a luz vermelha. Limpe todos os componentes da arena, as panelas de escavação e os distribuidores de perfumes completamente com 70% de etanol para remover poeira e quaisquer odores de ensaios anteriores.
   2. Prepare as panelas de escavação da seguinte forma.
   3. Coloque as recompensas alimentares apropriadas no "compartimento inacessível" (ver Figura 1).
      NOTA: As recompensas incluídas neste compartimento dependem de quais guloseimas (se houver) estão enterradas em um determinado ensaio (ver Tabela 2). Assim, cada pote sempre conterá um pedaço de chip de banana e um pedaço de comida nos dois compartimentos.
      1. Potes de odor DS+: durante ensaios reforçados, coloque um pedaço de chow no compartimento inacessível e enterre um pedaço de chip de banana na área acessível da panela.
      2. Potes de odor DS: durante ensaios reforçados, coloque um pedaço de chow e um pedaço de chip de banana no compartimento inacessível. Não haverá recompensas alimentares na área acessível da panela.
      3. Potes não perfumados: durante os ensaios reforçados, coloque um pedaço de chip de banana no compartimento inacessível e enterre um pedaço de comida na área acessível da panela.
      4. Durante todos os ensaios de teste não forçados (positivo, negativo e ambíguo), coloque um pedaço de comida e um pedaço de chip de banana no compartimento inacessível. Não haverá recompensas alimentares na área acessível da panela.
         NOTA: Este passo é evitar que o cheiro das guloseimas enterradas revele qual pote é recompensado. Como tal, a barreira entre os dois compartimentos é perfurada para facilitar a transmissão do odor.
   4. Despeje uma pequena quantidade de cama de milho em cada pote para manter as recompensas alimentares centradas ao serem enterradas. Coloque um pedaço da recompensa alimentar apropriada (ver Tabela 2) em cima da camada de corncob e despeje lentamente a cama corncob sobre as guloseimas, cobrindo-as e enchendo os potes até uma altura de 3 cm.
   5. Usando uma seringa de 1 mL ou micropipette, elabove 0,1 mL da mistura de odor apropriada (ou seja, hortelã, baunilha ou misturas ambíguas) ou água destilada (ver Tabela 2) e injete-a diretamente em cima do corncob em movimento circular.
   6. Preparem os distribuidores de perfume.
      1. Coloque uma peça de algodão na base da fita de tecido. Utilizando uma seringa ou micropipette de 1 mL, elas reúna 0,1 mL da mistura de odor apropriada (ou seja, misturas de hortelã, baunilha ou ambígua) ou água destilada (ver Tabela 2) e injete-a na peça de algodão. Cubra o de tecido com sua tampa para incluir o algodão perfumado criando um dispensador de perfume.
   7. Coloque as panelas de escavação nas extremidades dos braços e distribuidores de perfume no início de cada braço. Insira a "porta" removível imediatamente antes das ranhuras do para bloquear a entrada nos braços da arena e para criar o compartimento de partida (ver Figura 1).
      NOTA: Escavar panelas, distribuidores de perfume e seringas deve ser claramente rotulado e usado apenas para um perfume ao longo de experimentos para evitar a mistura não intencional de sinais de odor (ou seja, use um conjunto diferente de materiais para hortelã, baunilha, misturas sem perfume e ambíguas por toda parte).

2. Treinamento de escavação: 5 dias, dois ensaios positivos por dia (Tabela 2)

1. Ratos rápidos por 1h antes do treinamento em sua gaiola de casa, removendo alimentos do funil.
2. Configure a arena para um teste positivo reforçado seguindo as instruções de configuração da arena acima (passo 1.4).
3. No primeiro dia de treinamento de escavação, coloque as recompensas alimentares em cima da cama de 3 cm em vez de enterrá-las.
4. Enterre progressivamente as recompensas sob o corncob nos 4 dias seguintes, até que estejam localizadas no fundo da cama de 3 cm até o dia 5 (ou seja, dia 1: em cima da espiga de milho, dia 2: enterrada por uma fina camada de milho-espiga, dia 3: enterrada a meio caminho até o fundo da panela, dia 4: enterrado três quartos do caminho para o fundo da panela, e dia 5: enterrado no fundo da panela).
5. Mova ratos de sua gaiola para uma gaiola de transporte vazia. Coloque um cartão com o código cego do animal em cima da gaiola de transporte para que o pesquisador que conduz experimentos permaneça cego para identificação animal e tratamento. Leve ratos para a área experimental.
   NOTA: As etapas 2.1 e 2.5 devem ser completadas por um assistente de pesquisa familiarizado com os ratos. As etapas subsequentes durante os ensaios serão conduzidas por um pesquisador cego à Y animal (e tratamento, se aplicável). Lide sempre com ratos usando manuseio de copos (mão aberta) ou manuseio de túnel (com um copo de papel ou túnel plástico) para evitar os efeitos aversivos do manuseio tradicional da cauda²¹.
6. Mova ratos da gaiola de transporte para o compartimento inicial da arena. Remova a "porta" de partida, abaixe imediatamente a tampa do plexiglass sobre a arena e inicie o temporizador de ensaio de 5 minutos.
   NOTA: Se vários camundongos da mesma gaiola estiverem sendo testados, isso deve ser feito simultaneamente. No entanto, o número de animais que estão sendo testados ao mesmo tempo dependerá do número de observadores cegos disponíveis; idealmente, um pesquisador observará e manuseará um animal de cada vez, mas um indivíduo pode observar e manusear dois animais simultaneamente, se necessário.
7. Latência de pontuação ao vivo para cavar e latência para comer a recompensa em ambos os braços.
   1. Registo da latência para escavação como o momento em que a primeira ocorrência de escavação é observada. A escavação é descrita como um rato ativamente empurrando ou manipulando a cama de corncob com as previs e/ou focinheira.
   2. Registo da latência para comer como o momento em que a primeira ocorrência de alimentação é observada. Comer é descrito como um rato que consome uma recompensa enquanto o segura nas paradas e sentado em haunches.
8. Quando o ensaio terminar, levante a tampa do plexiglass e mova o mouse de volta para sua gaiola de transporte.
9. Descarte todas as roupas de cama de corncob e guloseimas deixadas nos potes. Abra de tecido e descarte pedaços de algodão. Limpe todos os componentes da arena e os potes de escavação e perfume bem os distribuidores com 70% de etanol.
10. Montar a arena para um segundo teste positivo (passo 1.4). Repita os passos 2.6-2.9 para um teste positivo reforçado.
11. Devolva a gaiola de transporte ao assistente de pesquisa para que os ratos possam ser colocados de volta em sua gaiola.
12. Repetir as etapas 2.1-2.11 por 5 dias consecutivos.

3. Treinamento de discriminação : 10 dias, quatro ensaios por dia

1. Configure a arena para um teste positivo ou negativo (ver Tabela 2) seguindo instruções na etapa 1.4.
2. Realizar dois ensaios positivos e dois negativos por dia seguindo a ordem descrita na Tabela 2 (ou seja, alternando ensaios positivos e negativos nos dias 1-5 e ordem pseudorandom nos dias 6-10).
3. Siga as instruções na etapa 2.1 no início de cada dia de treinamento e, em seguida, siga os passos 2.5-2.10. Repita até que os ratos tenham passado por quatro testes no total.
4. Devolva a gaiola de transporte ao assistente de pesquisa para que os ratos possam ser colocados de volta em sua gaiola.
5. Repetir passos 3.1-3.4 uma vez por dia durante 10 dias no total (ou seja, duas semanas de trabalho consecutivas de 5 dias, separadas por um fim de semana de 2 dias).

4. Teste

NOTA: A duração do teste é de 3 a 5 dias (dependendo do tempo necessário para cada mouse atender aos critérios de aprendizagem), cinco ensaios por dia para as sessões em que são realizados testes positivos e negativos e três ensaios por dia quando o teste ambíguo é realizado.

1. Ratos rápidos por 1h antes do treinamento/teste em sua gaiola doméstica, removendo alimentos do funil.
2. Realize um teste positivo e um teste negativo em uma ordem aleatória (ver Tabela 1) seguindo as instruções de configuração da arena na etapa 1.4 e instruções de ensaio reforçadas nas etapas 2.5-2.10.
3. Realize um teste não forçado gravado em vídeo.
   NOTA: Os ensaios não reforçados são idênticos aos ensaios reforçados, exceto para o local em que as recompensas são colocadas. Portanto, no ensaio não forçado, uma parte de cada recompensa de alto e baixo valor é colocada no compartimento inacessível tanto para os potes perfumados quanto para os não perfumados.
   1. Realize um teste positivo ou negativo para cada mouse diariamente até que os critérios de aprendizagem sejam atendidos (máximo de 4 dias; os critérios de aprendizagem são descritos na etapa 4.7.3). Certifique-se de que os testes positivos e negativos sejam realizados em ordem alternada ao longo dos dias (por exemplo, dia 1: teste positivo, dia 2: teste negativo, dia 3: teste positivo, etc.).
   2. Siga as instruções de configuração da arena na etapa 1.4.
   3. Mova ratos da gaiola de transporte para o compartimento inicial da arena. Configure uma câmera de vídeo em um tripé para que ambos os potes nas extremidades dos braços estejam à vista, e comece a gravar. Certifique-se de que o cartão de sinalização com o código cego do animal e o tipo de ensaio (Teste Positivo ou Teste Negativo) seja gravado no vídeo (para referência durante a pontuação de vídeo).
   4. Remova a "porta" de partida, abaixe imediatamente a tampa do plexiglass sobre a arena e inicie o temporizador de teste de 2 minutos.
   5. Quando o teste terminar, pare de gravar, mova a câmera para o lado, levante a tampa do plexiglass, mova o mouse de volta para sua gaiola de transporte.
   6. Descarte todas as roupas de cama de corncob e guloseimas deixadas nos potes. Abra de tecido e descarte pedaços de algodão. Limpe todos os componentes da arena, as panelas de escavação e os distribuidores de perfumes com 70% de etanol.
4. Realize um teste positivo e um teste negativo em uma ordem aleatória (ver Tabela 1) seguindo as instruções de configuração da arena na etapa 1.4 e instruções de ensaio reforçadas nas etapas 2.5-2.10.
5. Devolva a gaiola de transporte ao assistente de pesquisa para que os ratos possam ser colocados de volta em sua gaiola.
6. Uma vez que todos os ratos tenham concluído seus cinco testes diários, transfira vídeos do cartão de memória da câmera para um computador para pontuação de vídeo.
7. Pontuação positiva e negativa vídeos de teste no dia do teste para avaliar se os ratos atenderam aos critérios de aprendizagem. Certifique-se de pontuação de vídeo no mesmo dia, uma vez que os animais que atenderem aos critérios de aprendizagem serão submetidos a testes ambíguos no dia seguinte.
   1. Usando um software de gravação de eventos ou um cronômetro, o pesquisador que é cego para o tratamento gravar a latência de cada rato para cavar e cavar a duração em cada panela durante o primeiro minuto de testes positivos e negativos.
   2. Registo da latência para escavação como o momento em que a primeira ocorrência de escavação é observada. A escavação é descrita como um rato ativamente empurrando ou manipulando a cama de corncob com as previs e/ou focinheira. Recorde a duração da escavação como o tempo total que um rato passa cavando.
   3. Compare a duração da escavação no braço perfumado entre ensaios positivos (DS+) e negativos (DS-) para cada rato para determinar se os animais podem discriminar a tarefa. Considere o critério de aprendizagem a ser cumprido se a duração da escavação no braço perfumado DS+ for pelo menos o dobro do que para o braço com cheiro de DS durante o primeiro minuto de teste (com uma duração mínima de escavação DS+ de 3 s).
8. Repita os passos 4.1-4.7 diariamente até que os ratos tenham atingido o critério de aprendizagem.
   1. Exclua indivíduos que não atenderam ao critério até o dia 4 de julgamentos ambíguos (e, portanto, avaliação de viés de julgamento).
9. Para camundongos que atenderam aos critérios de aprendizagem, teste as respostas à mistura de odor ambígua.
   1. Ratos rápidos por 1h antes do treinamento/teste em sua gaiola doméstica, removendo alimentos do funil.
   2. Realize um teste reforçado positivo e um negativo em uma ordem aleatória seguindo as instruções de configuração da arena nas etapas 1.4 e instruções de ensaio reforçadas nas etapas 2.5-2.10.
   3. Realize um teste não fornecido por vídeo, conforme descrito na etapa 4.3 usando a mistura de odor ambígua (ver Tabela 2).
10. Marque vídeos de julgamento ambíguos para avaliar viés de julgamento.
    1. Usando um software de gravação de eventos ou um cronômetro, tenha um pesquisador cego para a ID animal e o tratamento registrem a latência de cada rato para cavar (ver o passo 4.7.2) em cada pote durante os primeiros 1 min e 2 min de testes.

5. Análise de dados

NOTA: As análises exatas necessárias dependerão dos detalhes do projeto experimental. Uma visão geral é descrita aqui, mas os pesquisadores são fortemente encorajados a se referir ao Gygax²² ao planejar análises para experimentos de JB animal, e para Gaskill e Garner²³ ao selecionar o tamanho da amostra (uma vez que as análises necessárias são muitas vezes muito complexas para análises de energia a priori ).

1. "Sem cegos" o pesquisador adicionando as informações correspondentes de RG e tratamento animal (por exemplo, habitação enriquecida ou convencional; droga ou placebo etc.) para cada código cego à planilha. Certifique-se de que a planilha resultante inclua três linhas para cada animal que atendesse aos critérios de aprendizagem (ou seja, para os ensaios de teste positivos, negativos e ambíguos) indicando latências para cavar no braço perfumado.
2. Execute um modelo misto linear generalizado de medidas repetidas, utilizando software estatístico preferido. Aqui, a variável desfecho será latência para cavar. Certifique-se de que o modelo inclui tratamento (ou variável contínua de interesse), Tipo de Ensaio e interação Tratamento x Tipo de Ensaio como efeitos fixos. Inclua o Mouse ID (aninhado dentro do tratamento) como um efeito aleatório. Os termos adicionais incluídos no modelo dependerão do desenho experimental aplicado.
   NOTA: Se os camundongos são agrupados (como é apropriado para esta espécie social²⁴) e os companheiros de gaiola são testados, então a gaiola aninhada dentro do tratamento (se presente) deve ser incluída no modelo como um efeito aleatório (e o ID do Rato deve ser posteriormente aninhado dentro da gaiola).
3. Traçar o meio de latência menos quadrado em cada tipo de ensaio para confirmar que a sugestão ambígua apresentada foi interpretada como intermediária (ou seja, a estimativa de meios menos quadrados para o ensaio ambíguo deve cair em um ponto médio entre as latências positivas e negativas). Avalie o mouse JB somente se esse requisito for atendido.
4. Avalie o simples efeito do tratamento (ou variável contínua de interesse) na latência para cavar no ensaio ambíguo, investigando a interação Treatment x Trial Type para determinar se os camundongos exibem JB modulado por afeto.

Figura 1: Diagrama de aparelho experimental. O aparelho JB inclui uma arena retangular com dois braços. Cada braço contém um dispensador de perfumes localizado no início e uma panela de escavação colocada no final. Reimpresso da Resasco et ^al.19 com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fase:	Experimental Design
Todo	Recompensa de alto valor	Chip de banana
	Recompensa de baixo valor	Comida de roedor
	DS+	Hortelã ou baunilha (contrabalanceado)
	DS-	Hortelã ou baunilha (contrabalanceado)
Treinamento de escavação	Cronograma de treinamento de escavação	5 dias: 2 testes de Pos/dia
	Duração do ensaio de escavação	5 min.
Treinamento de Discriminação	Cronograma de treinamento de discriminação	10 dias: 4 ensaios/dia
	Ordem de julgamento de escavação	Dias 1-5: 4 ensaios/dia
		Julgamento 1: Pos
		Julgamento 2: Neg
		Julgamento 3: Pos
		Julgamento 4: Neg
		Dias 6-10: 4 ensaios/dia*
	Duração do julgamento de discriminação	5 min.
Teste	Cronograma de testes	3-5 dias (dependendo do tempo para atender aos critérios de aprendizagem)
		5 testes/dia
	Ordem de fase de teste	Ensaios 1 e 2: Pos ou Neg**
		Teste 3: teste de teste
		Ensaios 4 e 5: Pos ou Neg**
	Duração do teste	2 min.
* Os ensaios foram pseudorandomizados para que os ratos sempre tivessem dois Gambás e dois testes neg por dia
** Os ensaios foram pseudorandomizados para que os ratos sempre tivessem um Gambá e um teste neg antes e depois do teste

Tabela 1: Resumo do projeto experimental e cronograma para treinamento e testes. Número e ordem de ensaios por dia para treinamento de escavação, treinamento de discriminação e fases de teste, além de detalhes de design experimental. Reimpresso da Resasco et ^al.19 com permissão da Elsevier.

Detalhes do julgamento
Fase	Tipo de teste	Braço Perfumado			Braço semcenido
		Sugestão de odor	Recompensa Enterrada	Recompensa inacessível	Sugestão de odor	Recompensa enterrada	Recompensa inacessível
Treinamento de escavação e discriminação	Treinamento pos	DS+	Banana	Chow	Água	Chow	Banana
	Treinamento Neg	DS-	Sem recompensa	Banana + chow	Água	Chow	Banana
Teste	Teste de Pos	DS+	Sem recompensa	Banana + chow	Água	Sem recompensa	Banana + chow
	Teste neg	DS-	Sem recompensa	Banana + chow	Água	Sem recompensa	Banana + chow
	Teste ambíguo	Hortelã/ mistura de baunilha	Sem recompensa	Banana + chow	Água	Sem recompensa	Banana + chow
Critério de aprendizagem	Os ratos devem cavar o dobro do tempo no pote DS+ (teste de Pos) do que o DS-pot (teste neg), e cavar para um mínimo de 3 s

Mesa 2. Resumo dos detalhes do julgamento. Sugestões de odor e recompensas apresentadas em cada tipo de teste durante as fases de Treinamento de Escavação, Treinamento de Discriminação e Teste. DS(+): estímulo discriminativo positivo, DS(-): estímulo discriminativo negativo, Pos: positivo, Neg: negativo. Reimpresso da Resasco et ^al.19 com permissão da Elsevier. Consulte a Tabela Suplementar S2 no artigo original para a tabela ampliada.

Resultados

Os resultados aqui apresentados refletem os achados relevantes do Experimento 1 da Resasco et ^al.19. Os sujeitos neste experimento foram 18 camundongos C57BL/6NCrl feminino ('C57') e 18 camundongos Balb/cAnNCrl ('Balb'). Os animais chegaram à instalação com 3-4 semanas de idade e foram aleatoriamente atribuídos a tratamentos habitacionais ambientalmente enriquecidos ou convencionais (EH ou CH, respectivamente) em quartetos de cepas mistas²⁵. Cada gaiola continha um C57 ...

Discussão

O protocolo de escavação baseado em perfume e os resultados aqui descritos demonstram a capacidade desta nova tarefa JB de detectar alterações no estado afetivo do rato. A tarefa apresenta, assim, uma ferramenta valiosa para diversos campos de pesquisa. Semelhante a qualquer tarefa de JB, avaliar o afeto animal é fundamental que os animais aprendam primeiro a discriminar entre as pistas (etapa 4.7.3) e que o estímulo ambíguo seja interpretado como intermediário (passo 5.3). Embora simples, atender a esses requisi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Commercial alcohol	P016EAAN	Dilute to 70% with distilled water, for cleaning
Centrifuge tubes	Fischer	55395	15 mL tubes used to dilute essences here. However, size may be selected based on total volume required for sample size
Cheerios (original)	Cheerios	N/A	Commercially available. Used as reward to train animals to enter annex cage for handling
Corncob bedding	Envigo	7092	Teklad 1/8 corncob bedding used in digging pots and animal cages
Cotton pads	Equate	N/A	Commercially available. Modified in lab to fit within tissue cassettes for scent dispensing
Digging pots	Rubbermaid	N/A	Commercially available. Containers were modified to fit the apparatus in the lab
Dried, sweetened banana chips	Stock and Barrel	N/A	Commercially available. High value reward in JB task
JB apparatus		N/A	The apparatus was made in the lab
JWatcher event recording software	Animal Behavior Laboratory, Macquarie University	Version 1.0	Freely available for download online. Used to score digging behavior during JB task
Mint extract	Fleibor	N/A	Commercially "Menta (Solución)". Discriminative stimulus odor
Rodent Diet	Envigo	2914	Teklad global 14% protein rodent maintenance diets. Low value reward in JB task and regular diet in home cage
SAS statistical software	SAS	Version 9.4	Other comparable software programs (e.g. R) are also appropriate
Vanilla extract	Fleibor		Commercially available "Vainilla (Solución)". Discriminative stimulus odor
Video camera	Sony	DCR-SX22	Sony handycam.