Métodos in vitro de baixo para cima para avaliar a organização ultraestrutural, remodelação da membrana e comportamento de sensibilidade da curvatura dos septinos

Resumo

Septinas são proteínas citoesqueléticos. Eles interagem com membranas lipídicas e podem sentir, mas também gerar curvatura de membrana na escala de míces. Descrevemos neste protocolo metodologias in vitro para analisar deformações de membrana, ligação de septina sensível à curvatura e ultraestrutura de filamento de septina.

Resumo

A remodelagem da membrana ocorre constantemente na membrana plasmática e dentro de organelas celulares. Para dissecar totalmente o papel do ambiente (condições iônicas, composições proteicas e lipídicas, curvatura de membrana) e os diferentes parceiros associados a processos específicos de remodelação de membrana, realizamos abordagens in vitro de baixo para cima. Nos últimos anos, tem havido grande interesse em revelar o papel das proteínas septinas associadas às principais doenças. As septinas são proteínas citoesqueléticas essenciais e onipresentes que interagem com a membrana plasmática. Eles estão implicados na divisão celular, motilidade celular, neurofogênese e espermaogênese, entre outras funções. É, portanto, importante entender como os septins interagem e se organizam nas membranas para induzir posteriormente deformações de membranas e como elas podem ser sensíveis a curvaturas de membrana específicas. Este artigo tem como objetivo decifrar a interação entre a ultraestruturagem de septinas a nível molecular e a remodelação da membrana que ocorre em escala de mícticos. Para isso, os complexos de leveduras e septinas de mamíferos foram recombinantemente expressos e purificados. Uma combinação de ensaios in vitro foi então usada para analisar a auto-montagem de septinas na membrana. Bicamadas lipídicas suportadas (SLBs), vesículas unilamellar gigantes (GUVs), vesículas unilamellar grandes (LUVs) e substratos ondulados foram usados para estudar a interação entre automontagem de septina, remodelação da membrana e curvatura da membrana.

Introdução

As septinas são proteínas citoesqueletal que formam filamentos que interagem com membranas lipídicas. Os septinos são onipresentes em eucariotes e essenciais para inúmeras funções celulares. Eles foram identificados como os principais reguladores da divisão celular em leveduras e mamíferos ^1,2. Eles estão envolvidos em eventos de remodelação de membrana, ciliogênese³ e espermaiogênese⁴. Dentro das células mamíferas, os septinos também podem interagir com actina e microtúbulos ^5,6,7

Protocolo

1. Determinação da remodelagem da membrana usando vesículas unilamellar gigantes (GUVs)

NOTA: Nesta seção, os GUVs são gerados para imitar as deformações de membrana possivelmente induzidas por septinas em um contexto celular. De fato, nas células, os septinos são frequentemente encontrados em locais com curvaturas de micrômetros. Os GUVs têm tamanhos que variam de alguns a dezenas de micrômetros e podem ser deformados. Assim, são apropriados para avaliar quaisquer deformações induzidas por septina em escala de micrômetros. Lipídios fluorescentes, bem como septinas fluorescentes rotuladas (usando Proteína Fluorescente Verde [....

Resultados

Deformações de GUVs
Imagens típicas de fluorescência confocal de GUVs remodeladas após serem incubadas com septinas são exibidas na Figura 3, em condições onde os septins polimerizam. GuVs nus (Figura 3A) eram perfeitamente esféricos. Após a incubação com mais de 50 nM de filamentos de levedura, as vesículas pareciam deformadas. Até uma concentração de octamers de levedura de 100 nM, as vesículas apareceram facetted, e as def.......

Discussão

Como dito acima, tem sido utilizada uma mistura lipídica que melhora a incorporação de PI(4,5)P₂ dentro da bicamadas lipídica e facilita assim as interações septina-membrana. De fato, mostramos em outros lugares²⁵ que os septinos de levedura brotante interagem com vesículas de forma específica de PI(4,5)P₂. Esta composição lipídica foi ajustada empiricamente a partir da triagem de múltiplas composições e agora é amplamente utilizada pelos autores. Pi(4,5)P_.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids	840035
Bath sonicator	Elma		Elmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramide	invitrogen, Thermo Fischer scientific	11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol	Sigma Aldrich
Confocal microscope	nikon		spinning disk or confocal
Critical point dryer	Leica microsystems		CPD300
Deionized water generator	MilliQ	F1CA38083B	MilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051
Field Emission Gun SEM (FESEM)	Carl Zeiss		Gemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution	Thermo Fischer scientific	50-262-19
High vacuum grease, Dow corning	VWR
IMOD software	https://bio3d.colorado.edu/imod/		software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids	Eloise	01883-F
Lipids	Avanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate	Avanti Polar Lipids	840046
Metal evaporator	Leica microsystems		EM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81	Norland Products	NOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4%	delta microscopies	19170
Osmometer	Löser		15 M
Plasma cleaner	Alcatel		pascal 2005 SD
Plasma generator	Electron Microscopy Science
Plunge freezing equipment	leica microsystems		EMGP
Transmission electron microscope	Thermofischer		Tecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22451	this product is not available for purchase any longer
Wax plates, Vitrex	VWR