Métodos in vitro de baixo para cima para avaliar a organização ultraestrutural, remodelação da membrana e comportamento de sensibilidade da curvatura dos septinos

Resumo

Septinas são proteínas citoesqueléticos. Eles interagem com membranas lipídicas e podem sentir, mas também gerar curvatura de membrana na escala de míces. Descrevemos neste protocolo metodologias in vitro para analisar deformações de membrana, ligação de septina sensível à curvatura e ultraestrutura de filamento de septina.

Resumo

A remodelagem da membrana ocorre constantemente na membrana plasmática e dentro de organelas celulares. Para dissecar totalmente o papel do ambiente (condições iônicas, composições proteicas e lipídicas, curvatura de membrana) e os diferentes parceiros associados a processos específicos de remodelação de membrana, realizamos abordagens in vitro de baixo para cima. Nos últimos anos, tem havido grande interesse em revelar o papel das proteínas septinas associadas às principais doenças. As septinas são proteínas citoesqueléticas essenciais e onipresentes que interagem com a membrana plasmática. Eles estão implicados na divisão celular, motilidade celular, neurofogênese e espermaogênese, entre outras funções. É, portanto, importante entender como os septins interagem e se organizam nas membranas para induzir posteriormente deformações de membranas e como elas podem ser sensíveis a curvaturas de membrana específicas. Este artigo tem como objetivo decifrar a interação entre a ultraestruturagem de septinas a nível molecular e a remodelação da membrana que ocorre em escala de mícticos. Para isso, os complexos de leveduras e septinas de mamíferos foram recombinantemente expressos e purificados. Uma combinação de ensaios in vitro foi então usada para analisar a auto-montagem de septinas na membrana. Bicamadas lipídicas suportadas (SLBs), vesículas unilamellar gigantes (GUVs), vesículas unilamellar grandes (LUVs) e substratos ondulados foram usados para estudar a interação entre automontagem de septina, remodelação da membrana e curvatura da membrana.

Introdução

As septinas são proteínas citoesqueletal que formam filamentos que interagem com membranas lipídicas. Os septinos são onipresentes em eucariotes e essenciais para inúmeras funções celulares. Eles foram identificados como os principais reguladores da divisão celular em leveduras e mamíferos ^1,2. Eles estão envolvidos em eventos de remodelação de membrana, ciliogênese³ e espermaiogênese⁴. Dentro das células mamíferas, os septinos também podem interagir com actina e microtúbulos ^5,6,7 em uma pasta de Rho GTPases (BORG) de forma dependente⁸. Em vários tecidos (neurônios⁹, cilia³, espermatozoides¹⁰), os septinos foram identificados como reguladores de barreiras de difusão para componentes ligados à membrana¹¹. As septinas também foram demonstradas para regular a saliência da membrana e a formação de saliência¹². Os septinos, sendo proteínas multitarefas, estão implicados no surgimento de várias doenças prevalentes¹³. Sua desregulação está associada ao surgimento de cânceres¹⁴ e doenças neurodegenerativas¹⁵.

Dependendo do organismo, várias subunidades de septina (duas em Caenorhabditis elegans a 13 em humanos) se reúnem para formar complexos cuja organização varia de forma dependente de tecidos¹⁶. O bloco básico de construção de septin reúne de duas a quatro subunidades, presentes em duas cópias e auto-montados de forma palindômica semelhante a uma vara. Na levedura brotante, os septins são octamericos ^17,18. In situ, os septins são frequentemente localizados em locais com curvatura de micrômetros; eles são encontrados em locais de constrição de divisão, na base de cílios e dendritos, e no anulo de espermatozoides^19,20. Na membrana, o papel dos septinos parece ser duplo: eles estão implicados na remodelação do bicamadorão lipídial e na manutenção da integridade da membrana²¹. Assim, investigar as propriedades biofísicas das proteínas formadoras de filamentos de septina e/ou subunidades na membrana é crucial para entender seu papel. Para dissecar propriedades específicas de septinas em um ambiente bem controlado, abordagens in vitro de baixo para cima são apropriadas. Até agora, apenas alguns grupos descreveram as propriedades biofísicas dos septinos in vitro 20,22,23. Assim, em comparação com outros filamentos citoesqueléticos, o conhecimento atual sobre o comportamento dos septinos in vitro permanece limitado.

Este protocolo descreve como a organização de filamentos de septina, remodelagem de membrana e sensibilidade à curvatura pode ser analisada¹⁹. Para isso, foi utilizada uma combinação de métodos de microscopia óptica e eletrônica (microscopia de fluorescência, microscopia crio-elétron [crio-EM], e microscopia eletrônica de varredura [SEM]). A remodelagem da membrana de vesículas unilamellar gigantes do tamanho de micrômetros (GUVs) é visualizada usando microscopia óptica de fluorescência. A análise do arranjo e ultraestrutura de filamentos de septina ligados a vesículas lipídicas é realizada utilizando-se crio-EM. A análise da sensibilidade à curvatura de septina é realizada utilizando-se o SEM, estudando o comportamento de filamentos de septina vinculados a bicamadas lipídicas de suporte sólido depositadas em substratos ondulados de curvaturas variáveis, o que permite a análise da sensibilidade da curvatura para curvaturas positivas e negativas. Em comparação com a análise anterior^20,24, aqui, propomos usar uma combinação de métodos para analisar minuciosamente como os septins podem se auto-montar, sinérgicamente deformar a membrana e ser sensíveis à curvatura. Acredita-se que este protocolo seja útil e adaptável a qualquer proteína filamentosa que mostre afinidade com membranas.

Protocolo

1. Determinação da remodelagem da membrana usando vesículas unilamellar gigantes (GUVs)

NOTA: Nesta seção, os GUVs são gerados para imitar as deformações de membrana possivelmente induzidas por septinas em um contexto celular. De fato, nas células, os septinos são frequentemente encontrados em locais com curvaturas de micrômetros. Os GUVs têm tamanhos que variam de alguns a dezenas de micrômetros e podem ser deformados. Assim, são apropriados para avaliar quaisquer deformações induzidas por septina em escala de micrômetros. Lipídios fluorescentes, bem como septinas fluorescentes rotuladas (usando Proteína Fluorescente Verde [GFP]), são usados para seguir o comportamento de lipídios e proteínas através de microscopia de fluorescência.

1. Preparação de buffers e soluções
   1. Prepare o tampão de crescimento GUV (50 mM NaCl, 50 mM de sacarose e 10 mM Tris [pH = 7,8]) e o tampão de observação (75 mM NaCl e 10 mM Tris [pH = 7,8]).
   2. Meça (usando um osmômetro comercial) e ajuste a osmolaridade dos buffers de observação e crescimento (170 mOsmol· ^L-1, em teoria) adicionando pequenas quantidades de NaCl até que suas respectivas osmolaridades sejam iguais. Filtre os buffers usando um filtro de 0,2 μm. Aliquot o buffer de crescimento e armazene-o a -20 °C para uso posterior. Armazene o tampão de observação a 4 °C.
      NOTA: A diferença na osmolaridade entre os dois buffers não deve exceder 5%.
   3. Prepare uma solução de 5 mg·^mL-1 β-caseína no buffer de observação. Certifique-se de dissolução completa (após várias horas a 4 °C com agitação magnética). Filtre a solução com um filtro de 0,2 μm, alíquota e armazenamento a -20 °C.
2. Prepare as misturas lipídicas em uma concentração lipídica total de 3 mg·^mL-1 em clorofórmio. Use uma composição (mol%) de 56,8% Ovo L-α-fosfatidylcholina (EggPC), 15% colesterol, 10% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamina (DOPE), 10% 1,2-dioleoyl-sn-glyo-3-3-3-3-3-fosfo-L-serina (DOPS), 8% cérebro L-α-fosfattidylinositol-4,5-bisfosfato (PI(4,5)P₂), e 0,2% Bodipy-TR-Ceramide para melhorar as interações proteína-lipídica e favorecer a incorporação de PI(4,5)P_{2 25}.
   NOTA: Manuseie o clorofórmio sob um capô de fumaça usando luvas de nitrito e óculos de segurança. Soluções de clorofórmio pipeta com seringas de vidro e evitar plástico à medida que o clorofórmio dissolve o plástico. Antes e depois do uso, enxágue as seringas tubondo clorofórmio 5x-10x. Use seringas separadas para pipetizar lipídios fluorescentes específicos para evitar contaminação cruzada. Lipídios podem ser armazenados em clorofórmio a -20 °C em um frasco de vidro âmbar tampado com Teflon. Os frascos devem ser preenchidos com argônio antes de fechar e selados com parafilme para evitar qualquer oxidação lipídica.
3. Eletro-formação de GUVs usando uma configuração de fios de platina
   NOTA: A Figura 1 apresenta o esquema das etapas experimentais e uma imagem da câmara.
   1. Limpe bem a câmara e os fios de platina da seguinte forma para remover quaisquer resíduos lipídulos.
   2. Mergulhe os fios e a câmara em acetona e sonicato por 10 minutos. Limpe-os cuidadosamente com um tecido de papel usando acetona.
   3. Monte a câmara inserindo os fios, mergulhe novamente em acetona e sonicato por 10 minutos. Limpe mais uma vez com acetona, certificando-se de que os fios estejam totalmente limpos. Mergulhe a câmara em etanol, sonicate por 10 minutos, e limpe com etanol.
   4. Finalmente, mergulhe a câmara em água deionizada, sonicato por 10 minutos, e seque com um fluxo de nitrogênio ou ar.
      NOTA: A câmara de Teflon (Figura 1B) foi feita sob medida na oficina interna. Acomoda três compartimentos que podem ser selados em ambos os lados usando tampas de vidro. Os fios de platina podem ser inseridos na câmara através de furos de 1,3 mm de diâmetro.
   5. Após a limpeza da câmara, deposite 3-4 gotas por compartimento (cada gota é de cerca de 0,1 μL)) da mistura lipídica de 3 mg·^mL-1 em cada fio de platina. Gire os fios em 180° e deposite 3-4 gotículas lipídicas por compartimento no lado oposto de cada fio de platina. Certifique-se de que as gotas não entrem em contato entre si. Cerca de 5 μL da mistura lipídica é necessário por câmara inteira.
   6. Coloque a câmara de crescimento em uma câmara de vácuo por 30 minutos para remover qualquer traço de clorofórmio.
      NOTA: O vácuo profundo (0,1 mbar) é o melhor. Quando secos, os lipídios são vulneráveis à oxidação e, portanto, não devem ser deixados no ar por mais de alguns minutos.
   7. Deposite graxa de alto vácuo na parte inferior da câmara (o lado mais próximo dos fios) ao longo da periferia dos três compartimentos usando uma seringa e pressione uma tampa limpa (22 mm x 40 mm) contra a graxa para garantir a vedação perfeita. Sele ambas as extremidades da câmara (ou seja, nos locais de entrada/saída dos fios) utilizando pasta de vedação (placas de cera). Da mesma forma, aplique graxa de vácuo do outro lado da câmara.
   8. Encha os compartimentos com tampão de crescimento (~1 mL por câmara) usando uma pipeta. Não mexa a solução muito rapidamente ou fortemente para evitar qualquer descolamento da filmagem lipídica dos fios. Sele a parte superior da câmara hermeticamente usando uma tampa de 22 mm x 40 mm pressionando-a contra a graxa. Para evitar a formação de bolhas de ar, pressione suavemente a tampa de vidro do centro para as bordas.
      1. Coloque a câmara em uma geladeira de 4 °C e conecte os fios a um gerador de função de onda (função seno a 500 Hz). Estabeleça uma tensão efetiva de 350 mV para um período de crescimento mais curto (ou seja, 6h) ou 250 mV para um período de crescimento mais longo (ou seja, 12-16 h), conforme já apresentado e otimizado em estudo de Beber et ^al.25.
   9. Remova as tampas, limpe o selado e unte e remova os fios. Lave e esfregue a câmara com um tecido de papel usando água e etanol (≥70%) alternadamente.
      NOTA: A tensão ideal e a escala de tempo para o crescimento do GUV dependem de muitos parâmetros, desde a concentração de sal tampão até a geometria da câmara (ou seja, a distância entre os fios e o tamanho da câmara). Use a mesma câmara toda vez que o experimento for repetido para garantir a reprodutibilidade. Os fios estão próximos com a parte inferior da câmara para que os lipídios possam ser imagens usando microscopia fluorescente. Imagem dos lipídios em cada etapa (ver Figura 1C,D) para garantir que o processo de eletro-formação seja bem sucedido.
4. Incubação de septina com as vesículas
   1. Coletar GUVs dos fios usando pontas de pipeta pré-cortadas (abertura~1 mm) que são trazidas nas proximidades dos fios. Então, pipeta a solução o tempo todo o fio. Este procedimento impede a geração de fortes fluxos lamelares que poderiam interromper os GUVs. Após esta etapa, não é mais necessário cortar dicas de pipeta. De fato, os fluxos lamelares não danificam os GUVs na solução.
      NOTA: Devido à presença de PI(4,5)P₂ na mistura lipídica, os GUVs que foram coletados devem ser armazenados por no máximo 2-3 h antes do experimento. De fato, pi(4,5)P₂ é solubilizado rapidamente e septinos não se ligam mais às membranas poucas horas após sua formação. No entanto, uma vez que os septinos estão ligados à membrana, eles permanecem ligados por alguns dias.
   2. Diluir a solução de estoque de septinas em Tris 10 mM (pH 8) exclusivamente para atingir uma osmolaridade igual à do buffer de crescimento; se necessário, diluir ainda mais a solução de septina no tampão de observação. Adicione o volume pretendido de GUVs coletados (50-100 μL para um volume total de 200 μL). Realize a incubação diretamente na câmara de observação após a passivação com β-caseína (veja abaixo). É necessário tempo de espera de 20-30 minutos para alcançar o equilíbrio.
      NOTA: A expressão e purificação dos complexos octaméricos septina (leveduras humanas ou brotantes) são extensivamente descritas em outros artigos¹⁷. Resumidamente, os septinos foram expressos em Escherichia coli, purificado em laboratório usando medidas de afinidade, exclusão de tamanho e cromatografia de troca de íons, e armazenado a -80 °C em uma solução aquosa de 50 mM Tris-HCl (pH 8), 300 mM KCl e 5 mM MgCl₂ a ~1 mg·^mL-1 (3 μM) de concentração. Uma alta concentração de sal é usada para evitar a agregação de septina. Os complexos de septina não devem ser concentrados através de um dispositivo de centrifugação de filtro, que induz a agregação e, portanto, reduz o rendimento da proteína.
5. Imagem com microscópio de disco confocal e/ou giratório
   1. Para evitar que os GUVs grudem na superfície e/ou explodam, passee a câmara de observação incubando-a com uma solução de 5 mg·^mL-1 β-casein por 30 minutos.
   2. Remova a solução de β-caseína e transfira a solução septin-GUV (Passo 1.4.2.) para a câmara de observação usando uma pipeta. Deixe os guvs sedimentares para o fundo da câmara por 10-15 min.
      NOTA: A discrepância de composição entre o interior do GUV e o buffer externo cria uma incompatibilidade de densidade e índice refrativo. Devido à incompatibilidade do índice de refração, os GUVs são visíveis com microscopia óptica de luz de transmissão.
   3. Utilizando microscopia confocal, visualize o sinal fluorescente dos lipídios para verificar se há o estado de qualidade e lamelaridade da membrana dos GUVs. Avalie a densidade de septinas vinculadas aos GUVs registrando o sinal fluorescente dos septinos após a realização de uma calibragem adequada²⁵. Realize aquisições de pilha Z a intervalo espacial de 0,4 μm para analisar e visualizar as deformações 3D das vesículas induzidas pela interação entre os septinos e a membrana.
      NOTA: Foram utilizados objetivos de imersão de óleo com ampliações de 60 ou 100 vezes. Foram utilizados microscópios de disco confocal padrão ou giratório (Tabela de Materiais) com tamanhos de pixels de 250 nm e 110 nm, respectivamente. Deve-se adaptar as condições de imagem a um determinado equipamento. Nenhum agente anti-branqueamento anti-foto específico foi adicionado à solução.

Figura 1: Eletro-formação de GUVs. (A) Representação esquemática do processo de eletro-formação utilizando fios de platina. (B) Imagem do dispositivo caseiro Teflon montado com fios de platina usados para gerar GUVs por eletro-formação. Os fios têm 0,5 mm de diâmetro e 3 mm de distância. (C) GUVs (objetos esféricos) observados por microscopia óptica de transmissão durante o processo de crescimento. A zona opaca na parte inferior da imagem é o fio de platina. (D) GUVs (objetos fluorescentes redondos) observados com microscopia fluorescente durante o crescimento do fio de platina. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Análise da organização ultraestrutural de filamentos de septina por microscopia crio-elétron

NOTA: As vesículas não são adequadas para imagens com métodos padrão de microscopia eletrônica. De fato, as amostras são secas usando métodos de manchas negativas padrão. Após a desidratação, é provável que as vesículas sejam submetidas a deformações inespecíficas, resultando frequentemente em saliências lipídicas. A microscopia crio-elétron é, portanto, uma estratégia muito melhor para observar deformações específicas de vesículas. Usando crio-EM, as amostras são incorporadas dentro de uma fina camada de gelo vitrificado (~100-200 nm), que preserva as amostras próximas ao estado nativo. Os GUVs são, no entanto, muito grandes (várias dezenas de micrômetros) para serem incorporados dentro de gelo fino e, portanto, imagens por microscopia eletrônica de transmissão. Assim, grandes vesículas unilamellar (LUVs), cujos diâmetros variam de ~50-500 nm, são gerados para determinar como os septins podem deformar vesículas e como elas se organizam em vesículas.

1. Geração de grandes vesículas unilamellar (LUVs)
   1. Prepare 50 μg de mistura lipídica solubilizada em clorofórmio com uma composição molar de 57% EggPC, 15% colesterol, 10% DOPE, 10% DOPS e 8% pi cerebral(4,5)P₂), que é otimizado para melhorar a interação septina com a membrana em um frasco de vidro.
   2. Seque a solução sob fluxo de argônio para gerar um filme lipídio seco no frasco. Coloque o frasco sob vácuo por 30 minutos para secar completamente o lipídio.
   3. Resolubilize o filme lipídeco em 50 μL de solução aquosa (50 mM Tris-HCl [pH 8]; 50 mM KCl; 2 mM MgCl₂) para obter uma concentração final de 1 mg·^mL-1, vórtice para 10 s, e transferir a solução para um tubo.
      NOTA: Os LUVs devem ser usados imediatamente para incubação com septinas. Caso contrário, a interação proteína-lipídica será fraca por causa da solubilização PI(4,5)P2. Este processo de ressubilização bruta gera uma população heterogênea de vesículas com diâmetros que variam de 50 nm a 500 nm. Assim, toda uma gama de diâmetros e, portanto, curvaturas são simultaneamente avaliadas.
2. Incubar os septinas com os lipídios solubilizados nas concentrações lipídicas e septinas finais de 0,1 mg·^mL-1 (cerca de 300 nM) e 20 nM, respectivamente, em um tampão de alto sal (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl₂). Incubar a amostra por 1h à temperatura ambiente.
3. Mergulho congelante para vitrifar a amostra
   1. Redes de carbono furado de descarga de brilho (300 malhas) no lado carbono para 30 s a 5 mA usando equipamento de gerador de plasma e inserir a grade dentro de uma máquina de congelamento de mergulho em um ambiente úmido.
   2. Adsorb 4 μL da amostra (Passo 2.2.) no lado de carbono descarregado com brilho da rede. Imediatamente antes da adsorção da amostra, adicione contas de ouro de 5-10 nm na solução, caso as amostras sejam usadas para gerar séries inclinadas por crio-tomografia.
      NOTA: A densidade das contas de ouro deve ser rastreada e ajustada empiricamente e depende do provedor. A densidade otimizada é de 10 a 15 contas de ouro no campo de visão.
   3. Enxugue as amostras do lado nu para aspirar a gota da amostra no lado oposto.
      NOTA: O tempo de mancha é tipicamente 4 s, e a posição do papel filtro e da força de mancha são ajustadas empiricamente por meio de testes e triagem de posições alternativas do papel filtro para otimizar a qualidade do gelo (espessura) e a densidade do material.
   4. Transfira as grades para um microscópio ou armazene-as em um recipiente de nitrogênio líquido.
      NOTA: O uso de redes de carbono furados é essencial para acomodar a polidispersidade no tamanho das vesículas. A mancha da amostra do lado oposto favorece a adsorção aprimorada do material biológico na rede.
4. Imagem de microscopia crio-elétron
   1. Insira as grades em um microscópio eletrônico (EM) equipado para observação crio-EM. Trie toda a grade gerando um mapa de toda a amostra em baixa ampliação (tipicamente em ampliação de 120x) para selecionar áreas que exibem melhor gelo (ou seja, fino e bem vitrificado).
   2. Para a coleta de dados crio-EM 2D, colete imagens com um tamanho de pixel de cerca de 2 Å por pixel para verificar a qualidade da amostra. Certifique-se de que tanto os filamentos de septina quanto o bicamado lipíduo são visíveis.
   3. Para coleta de dados de tomografia crio-elétron, selecione áreas de interesse exibindo vesículas deformadas. Certifique-se de que contas de ouro suficientes (pelo menos 10) estão presentes no campo de visão.
   4. De acordo com o software usado para coleta de dados de séries inclinadas, selecione o foco e as posições de rastreamento para estar longe o suficiente da área de interesse. Colete séries inclinadas variando o ângulo de inclinação de -60° a +60°, coletando uma imagem a cada 2°-3° graus.
      NOTA: A dose total deve ser de cerca de, ou menos, 100 elétrons/Ų. O tamanho do pixel varia de 1,3 Å a 2,1 Å, dependendo do microscópio usado para coleta de dados. Idealmente, um esquema simétrico angular para coleta de dados é preferido da seguinte forma: 0°, -3°, +3°, -6°, +6°, -9°, +9° [...] -60°, +60°. No entanto, os goniômetros dos microscópios de entrada lateral não fornecem estabilidade mecânica suficiente para alcançar esses esquemas simétricos. Alternativamente, a aquisição pode ser iniciada em 0° a 34°, seguida por uma segunda sequência angular de -2° a -60°, e terminou por uma sequência final de 36° a 60°. O objetivo é coletar as primeiras imagens (com os menores danos à radiação) nos ângulos mais baixos. Além disso, para visualizar a ultraestrutura de vesículas e filamentos de septina encadernados, um microscópio crio-EM padrão pode ser usado (200 kV, filamento de hexaboride lanthanum (LaB6) e entrada lateral da amostra). No entanto, se se pretende buscar mais processamento de imagem (média de sub-tomograma, por exemplo), é melhor usar microscópios de última geração de arma de emissão de campo (FEG) equipados com detectores diretos. Neste protocolo, restringimos nossa descrição à aquisição de reconstruções 3D e deixamos de fora a média do sub-tomograma.
5. Reconstrução 3D da crio-tomografia e segmentação
   1. Use o pacote de software IMOD (Tabela de Materiais) para alinhamento de imagem de série inclinada e reconstrução 3D^26,27. Dentro do IMOD, realize o alinhamento da série de inclinação com base no posicionamento fiduciário (contas de ouro). Além disso, se necessário, realize a determinação e correção da função de transferência de contraste (CTF) dentro do IMOD²⁶. Finalmente, realize a reconstrução 3D com IMOD, seguindo cada passo rigorosamente.
   2. Segmente manualmente as bicamadas lipídicas e filamentos de septina usando 3Dmod²⁷ do conjunto de software IMOD, para exibição.

3. Análise da sensibilidade da curvatura do septin utilizando SEM

NOTA: Para entender como os septins podem ser sensíveis às curvaturas de micrômetros, uma abordagem in vitro tem sido usada para incubar complexos de filamento de septina com bicamadas lipídicas de suporte sólido depositadas em padrões ondulados ondulados em escala de micrômetros.

1. Projetando réplica ondulada de NOA (adesivo óptico norland) a partir de padrões ondulados de polidimetiletilaxano (PDMS)
   1. Use padrões ondulados PDMS de amplitude de 250 nm e periodicidade lateral de 2 μm ou outras dimensões para avaliar as curvaturas adequadas para a proteína de interesse.
      NOTA: Os padrões ondulados do PDMS são projetados e gerados conforme descrito em Nánia et ^al.28,29.
   2. Em um ambiente de limpeza, deposite 5 μL de NOA líquido em uma tampa circular de vidro de 1 cm de diâmetro e coloque o modelo PDMS na gota. Trate com luz UV (320 nm) por 5 min para foto-polimerizar o líquido NOA em uma fina película de polímero. Em seguida, retire suavemente o modelo PDMS do deslizamento de tampas com o NOA recém-polimerizado.
      NOTA: NOA é uma cola opticamente transparente comum adequada para imagens de microscopia óptica. Além disso, o NOA é resistente aos processos de fixação química e coloração realizados antes da imagem SEM. Ambas as resinas NOA 71 e NOA 81 podem ser usadas com resultados semelhantes. O padrão PDMS inicial poderia ser usado várias vezes para produzir réplicas NOA. As réplicas NOA obtidas podem ser mantidas em uma caixa à temperatura ambiente por meses.
2. Geração de bicamada lipídica apoiada e incubação de proteínas
   1. Trate os filmes NOA usando um limpador de plasma de ar por 5 minutos para tornar a superfície hidrofílica.
   2. Prepare uma solução de pequenas vesículas unilamellar (SUVs) com uma composição molar de 57% EggPC, 15% de colesterol, 10% DOPE, 10% DOPS e 8% pi cerebral (4,5)P₂ em uma concentração lipídica total de 1 mg·^mL-1. Prepare os SUVs reutilizando uma película lipídica seca no tampão de observação, conforme descrito na Etapa 2.1.3. Sonicar suavemente a solução usando um sônico de banho por 5-10 min até que a solução seja transparente.
      NOTA: A solução de SUVs pode ser armazenada congelada por várias semanas a -20 °C.
   3. Insira as tampas que suportam os padrões NOA dentro dos poços das caixas de cultura celular. Deposite 100 μL de solução de 1 mg·^mL-1 SUV nos padrões NOA recém-lançados por brilho (Passo 3.2.1.) e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Esta etapa induz a fusão de SUVs com a superfície do padrão NOA para gerar uma bicamada lipídica suportada.
   4. Enxágüe as lâminas completamente 6x com o tampão de septina (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂) para remover o SUV não-afusado. Depois de cada lavagem, nunca deixe a amostra completamente seca.
   5. Diluir a solução de estoque de septina octameric em tampão de sal alto septin (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl₂) usando tampão de septina (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂) para concentrações finais que variam de 10 nM a 100 nM, e volumes de 1 mL. Incubar a solução proteica nos slides por ~1 h em temperatura ambiente.
      NOTA: O volume é grande o suficiente para que a evaporação não seja um problema.
3. Preparação da amostra para análise de SEM
   NOTA: Vários protocolos foram desenvolvidos em microscopia eletrônica para analisar estruturas proteicas e sua montagem. O protocolo atual preserva a organização de filamentos de septino, utilizando um protocolo de fixação derivado de Svitkina et al.³⁰ que é fácil de implementar. Além disso, este protocolo otimiza observações sem de alta resolução.
   1. Preparação de reagentes e soluções de estoque
      NOTA: Este protocolo requer vários reagentes e soluções que podem ser preparados com antecedência ou apenas antes da incubação. Siga as instruções fornecidas para evitar quaisquer artefatos ou falta de reatividade química.
      1. Solução de estoque de cacodilato de sódio 0,2 M: Para preparar esta solução de dupla resistência, dissolva 2,14 g de pó de cacodilato de sódio em ~ 40 mL de água destilada sob agitação magnética. Após a dissolução completa, ajuste o pH para 7,4 adicionando suavemente 0,1 M HCl (~1 mL para 50 mL de solução) e compor o volume final com água destilada. Esta solução pode ser armazenada por 24-48 h a 4°C.
      2. 2% glutaraldeído (GA) em 0,1 M de cacodilato de sódio (solução fixativa): Prepare esta solução logo antes do uso diluindo a altamente pura SOLUÇÃO EM grau GA com solução de cacodilato de sódio de 0,2 M (ver acima). Use uma solução comercial de estoque GA de 25%-50% devido à sua capacidade de armazenamento otimizada a 4 °C. Para a preparação de 10 mL de solução fixa, diluir 0,8 mL de solução GA comercial de 25% com 4,2 mL de água destilada e 5 mL de cacodilato de sódio de 0,2 M.
      3. 1% de tetroxida de ósmio (OsO₄) em 0,1 M de cacodilato de sódio: Prepare esta segunda solução fixativa logo antes do uso diluindo a solução comercial de estoque OsO₄ com cacodilato de sódio de 0,2 M (ver acima). Para 4 mL de solução fixativa OsO₄ , diluir 1 mL de solução Comercial OsO₄ com 1 mL de água destilada e 2 mL de cacodilato de sódio de 0,2 M.
         NOTA: Use a solução comercial de estoque OsO₄ em lâmpadas de vidro cleavable devido às suas propriedades de armazenamento e manuseio. Note que o OsO₄ é altamente reativo. Certifique-se de que sua cor é ligeiramente amarela e não escura.
      4. 1% de ácido tânico (TA) na água: Prepare esta solução logo antes do uso. Prepare a solução TA para obter uma concentração final de 1% de TA em água destilada à temperatura ambiente. Dissolva 10 mg em 1 mL de água destilada e vórtice por alguns minutos. A solução TA não pode ser armazenada e deve ser filtrada com um filtro de 0,2 μm antes de ser usada.
      5. Solução de acetato de uranyl (UA) de 1% na água Prepare a solução UA para obter uma concentração final de 1% de UA em água destilada. Dissolva 10 mgs em 1 mL de água destilada e vórtice por pelo menos 30 min a 1 h por vórtice ou agitação à temperatura ambiente. Esta solução pode ser armazenada por 1 mês a 4 °C, mas pode facilmente precipitar e deve, portanto, ser filtrada com um filtro de 0,2 μm antes de usar.
      6. Série classificada de soluções de etanol Prepare 50%, 70%, 95% e 100% soluções de etanol na água. Prepare o banho final de garrafas recém-abertas de 100% etanol ou de 100% de etanol que foi desidratado por pelo menos 24 h com peneiras moleculares (diâmetro nominal do poro = 4 Å) para remover das amostras todos os vestígios de água que possam interferir na secagem e revestimento. Tenha cuidado para não sacudir esta solução, pois ela pode causar resuspensão de partículas de silicato.
         NOTA: Tenha cuidado ao manusear os reagentes químicos utilizados neste protocolo. Glutaraldeído, tetroxida de ósmio, cacodilato de sódio e acetato de urânyl são todos altamente tóxicos, acetato de urânyl sendo radioativo também. Toda a manipulação dos reagentes e seus resíduos deve ser feita utilizando-se individual (luvas, jalecos, óculos de segurança) e proteção coletiva (capuzes de fumaça e escudos de plexiglass), de acordo com os procedimentos específicos do laboratório.
   2. Fixação da amostra
      1. Lave as amostras (ou seja, slides NOA com bicamadas lipídicas fundidas e proteína incubada) com PBS. Substitua o PBS pela solução fixativa GA pré-armada a 37 °C e deixe a reação prosseguir por 15 min. As amostras podem então ser armazenadas a 4 °C.
      2. Remova a solução fixa e lave as amostras fixas 3x com cacodilato de sódio de 0,1 M (5 min por lavagem) com agitação suave.
      3. Incubar as amostras na solução fixativa OsO₄ por 10 minutos com máxima proteção contra luz para permitir a fixação de estruturas membranous e aumentar a condutividade elétrica das amostras. Remova a solução fixa e lave as amostras 3x em água destilada (5 minutos por lavagem) com agitação suave.
      4. Incubar as amostras lavadas na solução fixativa TA filtrada por um máximo de 10 minutos. Remova a solução TA e lave as amostras 3x em água destilada (5 minutos por lavagem) com agitação suave.
      5. Incubar as amostras lavadas em uma solução fixativa UA recém-filtrada por 10 minutos com máxima proteção contra luz. Remova a solução UA e lave as amostras 3x em água destilada (5 minutos por lavagem) com agitação suave.
   3. Desidratação da amostra e secagem de pontos críticos
      NOTA: A secagem de ar não é permitida para evitar amostras prejudiciais através de tensões superficiais indesejadas ao mudar do líquido para o estado gasoso. Dois métodos foram estabelecidos em EM: o método físico de atingir o estado supercrítico do CO₂ e contornar seu ponto crítico (31 °C, 74 bar), ou o método químico de evaporação de hexametileuta (HMDS), um agente de secagem com tensão superficial reduzida. CO₂ e HMDS são mal miscíveis com água. Consequentemente, todos os vestígios de água devem ser substituídos por um solvente transitório (etanol) para evitar qualquer dano posteriormente durante os processos de secagem.
      1. Incubar as amostras por 2-3 min em cada solução de etanol, a partir de 50% a 100% (anidro) banho de etanol.
         NOTA: Como a evaporação do etanol entre os banhos é rápida, o manuseio da amostra também deve ser rápido para evitar qualquer secagem de ar.
      2. Transfira as lâminas de vidro dentro do secador de ponto crítico pré-preenchido com etanol e siga as instruções do fabricante.
         NOTA: Neste protocolo, foi utilizado um aparelho automático, mas qualquer sistema pode ser usado. Os protocolos podem diferir para cada aparelho, mas devem ser otimizados para remover completamente o etanol (25 banhos neste protocolo) e reduzir as velocidades para as diferentes trocas de solventes (entradas de CO₂ e saídas de etanol/CO₂ ) e a despressurização final (quase 1h neste protocolo).
      3. No final da secagem do ponto crítico, armazene amostras imediatamente em um dessecanteto até a montagem e o revestimento. Como as amostras secas são altamente higroscópicas, cubra-as (veja abaixo) o mais rápido possível.
         NOTA: Alternativamente, o HMDS pode oferecer um método mais barato e mais rápido. Embora o HDMS nunca tenha sido testado em nossas amostras, essa abordagem produziu bons resultados para a observação de proteínas na face interna das membranas celulares^31,32.
   4. Montagem e revestimento de amostras.
      NOTA: Uma vez que as amostras biológicas apresentam propriedades de condutividade elétrica precárias, elas precisam ser revestidas com uma película metálica condutiva antes da observação sem. A espirttering de plasma-magnetron é assim usada.
      1. Anexar o deslizamento de tampas aos stubs que serão usados para futuras observações SEM. Use tinta prateada devido à sua condutividade elétrica melhorada, em comparação com discos de carbono. Adicione uma tira de tinta prateada na face superior da tampa e certifique-se de que a conexão com o stub é satisfatória. Evite qualquer aglomerado de tinta.
         NOTA: A tira de tinta prateada deve ser fina para evitar qualquer contato entre a amostra e a lente objetiva do MEI ao trabalhar em altas resoluções (ou seja, baixa distância de trabalho).
      2. Espere o solvente evaporar completamente.
         NOTA: A duração desta etapa pode variar dependendo da quantidade e da espessura do depósito de tinta prateada. Esta etapa pode ser encurtada usando um pote de sino ou o revestimento e um vácuo primário por 10-30 min.
      3. Use um aparelho equipado com uma cabeça de sputtering plasma-magnetron e um estágio rotativo-planetário, e siga os protocolos padrão fornecidos pelo fabricante. Aqui, o aparelho foi evacuado para 2,5 x ^10-5 mbar, purgado 1x com argônio de alta qualidade, e depois ajustado para 8,0 x ^10-3 mbar.
      4. Realize a pré-sputtering (120 mA para 60 s) para remover a camada de óxido na superfície. Em seguida, deposite 1,5 nm de tungstênio (90 mA, distância de trabalho = 50 mm) com o auxílio de um monitor de espessura de filme.
         NOTA: O revestimento deve ser perfeitamente limpo para garantir a reprodutibilidade da evaporação do filme. O revestimento deve ser interrompido assim que a espessura alvo tiver sido atingida. A espessura final do filme é calculada e corrigida depois. Filmes de cerca de 1,5 nm têm, em média, uma pós-correção de 0,7 nm usando nosso aparelho. Como esses valores de correção estão próximos ao alvo, uma série de revestimentos são realizados para avaliar e, em seguida, subtrair essa correção do valor-alvo.
      5. Armazene as amostras sob vácuo para protegê-las do ar ambiente até todas as análises sem..
         NOTA: A natureza do metal usado para sputtering assuntos. O PT, apesar de ser um material comum, resulta em um revestimento de má qualidade com uma espessura de película Pt adaptada a filamentos de septina (1,5 nm). Em altas resoluções, um filme pt de 1,5 nm carece de cohesividade; o tamanho dos clusters Pt e os filamentos de septina tornam-se assim semelhantes, levando a interpretações erradas durante o processo de segmentação^{de filamentos 33} (ver Figura 2A, inset). Tungstênio é uma boa alternativa ao Pt porque exibe um tamanho menor de grãos, quase visível em SEM de alta resolução (ver Figura 2B, inset). No entanto, o tungstênio puro é facilmente oxidado, levando a artefatos de efeito de carregamento fortes durante a observação sem se o procedimento detalhado na Etapa 3.3.4. não é estritamente seguido.
4. Adquira as imagens usando um microscópio SEM de emissão de campo (FESEM).
   NOTA: As tecnologias SEM foram recentemente atualizadas para melhorar a resolução, e as tecnologias dependem do fabricante (por exemplo, óptica eletrônica, desaceleração de feixe, lente magnética). Este ganho de resolução (acessível com vários fabricantes), especialmente em uma baixa tensão acelerada (perto do nanômetro a 1 kV), é necessário para resolver estruturas nanométricas semelhantes às redes de septina.
   1. Obtenha imagens de alta resolução através da detecção de elétrons secundários primários (SE1) com o detector "in-lens" usando as seguintes configurações.
   2. Defina a tensão acelerada para 3 kV. Fixar a corrente de feixe com a abertura de 20 μm (para colunas Zeiss Gemini I, ou equivalente a 34 pA) ou com a abertura de 15 μm (para colunas Zeiss Gemini I, ou equivalente a 18,5 pA), se for necessária a supressão dos efeitos de carregamento.
   3. Para observações, use resoluções que variam de 21,25 nm/pixel a 1.224 nm/pixel, e para análise de dados, use uma resolução de ~5,58 nm/pixel (ampliação de 20.000x de acordo com a referência Polaroid 545).
   4. Defina a distância de trabalho entre 1 mm e 2 mm para observação de alta resolução e em torno de 3 mm se for necessária uma profundidade de campo aumentada. Ajuste a velocidade de varredura e a integração da linha continuamente para garantir uma relação sinal-ruído constante com um tempo de aquisição de cerca de 30-45 s por imagem.

Figura 2: Efeito do material depositado em filamentos de septina em padrões PDMS ondulados. SEM de filamentos de septina revestidos por sputtering com (A) 1,5 nm de platina, exibindo o padrão "solo rachado árido" típico de uma falta de coesividade entre os aglomerados de núcleos de platina, ou (B) 1,5 nm de tungstênio coberto com uma camada lisa e coesa. Barra de escala = 200 nm. As caixas quadradas brancas representam as vistas ampliadas no lado inferior direito. Os glóbulos esféricos são pequenas vesículas lipídicas interagindo com os septinos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Deformações de GUVs
Imagens típicas de fluorescência confocal de GUVs remodeladas após serem incubadas com septinas são exibidas na Figura 3, em condições onde os septins polimerizam. GuVs nus (Figura 3A) eram perfeitamente esféricos. Após a incubação com mais de 50 nM de filamentos de levedura, as vesículas pareciam deformadas. Até uma concentração de octamers de levedura de 100 nM, as vesículas apareceram facetted, e as def...

Discussão

Como dito acima, tem sido utilizada uma mistura lipídica que melhora a incorporação de PI(4,5)P₂ dentro da bicamadas lipídica e facilita assim as interações septina-membrana. De fato, mostramos em outros lugares²⁵ que os septinos de levedura brotante interagem com vesículas de forma específica de PI(4,5)P₂. Esta composição lipídica foi ajustada empiricamente a partir da triagem de múltiplas composições e agora é amplamente utilizada pelos autores. Pi(4,5)P_...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids	840035
Bath sonicator	Elma		Elmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramide	invitrogen, Thermo Fischer scientific	11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol	Sigma Aldrich
Confocal microscope	nikon		spinning disk or confocal
Critical point dryer	Leica microsystems		CPD300
Deionized water generator	MilliQ	F1CA38083B	MilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051
Field Emission Gun SEM (FESEM)	Carl Zeiss		Gemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution	Thermo Fischer scientific	50-262-19
High vacuum grease, Dow corning	VWR
IMOD software	https://bio3d.colorado.edu/imod/		software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids	Eloise	01883-F
Lipids	Avanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate	Avanti Polar Lipids	840046
Metal evaporator	Leica microsystems		EM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81	Norland Products	NOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4%	delta microscopies	19170
Osmometer	Löser		15 M
Plasma cleaner	Alcatel		pascal 2005 SD
Plasma generator	Electron Microscopy Science
Plunge freezing equipment	leica microsystems		EMGP
Transmission electron microscope	Thermofischer		Tecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22451	this product is not available for purchase any longer
Wax plates, Vitrex	VWR