Hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) para visualizar colonização microbiana e infecção em intestinos de Caenorhabditis elegans

Resumo

Micróbios intestinais, incluindo bactérias extracelulares e patógenos intracelulares como o vírus Orsay e microsporídios (fungos), são frequentemente associados a nematoides selvagens de Caenorhabditis . Este artigo apresenta um protocolo para detecção e quantificação de micróbios que colonizam e/ou infectam nematoides de C. elegans e para medir a carga de patógenos após infecções controladas em laboratório.

Resumo

Os intestinos dos nematoides selvagens de Caenorhabditis são habitados por uma variedade de microrganismos, incluindo bactérias e patógenos do microbioma intestinal, como microsporídios e vírus. Devido às semelhanças entre Caenorhabditis elegans e células intestinais de mamíferos, bem como o poder do sistema C. elegans , este hospedeiro surgiu como um sistema modelo para estudar as interações intestino-micróbio hospedeiro in vivo. Embora seja possível observar alguns aspectos dessas interações com a microscopia de campo claro, é difícil classificar com precisão os micróbios e caracterizar a extensão da colonização ou infecção sem ferramentas mais precisas. A hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) pode ser usada como uma ferramenta para identificar e visualizar micróbios em nematoides da natureza ou para caracterizar e quantificar experimentalmente a infecção em nematoides infectados com micróbios em laboratório. As sondas FISH, marcando a pequena subunidade altamente abundante RNA ribossomal, produzem um sinal brilhante para bactérias e células microsporidianas. Sondas projetadas para atingir regiões conservadas de RNA ribossômico comuns a muitas espécies podem detectar uma ampla gama de micróbios, enquanto a segmentação de regiões divergentes do RNA ribossômico é útil para uma detecção mais estreita. Da mesma forma, as sondas podem ser projetadas para rotular o RNA viral. Um protocolo para coloração de RNA FISH com paraformaldeído (PFA) ou fixação de acetona é apresentado. A fixação de PFA é ideal para nematoides associados a bactérias, microsporídios e vírus, enquanto a fixação de acetona é necessária para a visualização de esporos de microsporidas. Os animais foram primeiramente lavados e fixados em paraformaldeído ou acetona. Após a fixação, as sondas FISH foram incubadas com amostras para permitir a hibridização das sondas para o alvo desejado. Os animais foram novamente lavados e, em seguida, examinados em lâminas de microscópio ou usando abordagens automatizadas. No geral, este protocolo FISH permite a detecção, identificação e quantificação dos micróbios que habitam o intestino de C. elegans , incluindo micróbios para os quais não existem ferramentas genéticas disponíveis.

Introdução

Caenorhabditis elegans emergiu como um poderoso sistema modelo para estudar a imunidade inata e as interações hospedeiro-micróbio nas células epiteliais intestinais ^1,2. Devido a ter um corpo transparente e apenas 20 células intestinais, C. elegans representa um sistema conveniente para monitorar os processos de colonização intestinal microbiana e infecção no contexto de um organismo intacto. As células intestinais nematoides compartilham múltiplas semelhanças morfológicas e funcionais com as células epiteliais intestinais de mamíferos, tornando-as um modelo intravivo tratável para dissecção de processos que governam a colonização do microbioma e a infecção por patógenos 3,4,5,6.

C. elegans silvestres se alimentam de uma variedade de micróbios que colonizam e infectam o intestino, e a amostragem desses nematoides resultou na descoberta de vírus, eucariotas (fungos, oomicetos) e bactérias que naturalmente se associam a esse hospedeiro 7,8,9,10. O vírus Orsay foi encontrado infectando o intestino e é atualmente o único vírus natural conhecido de C. elegans⁹. Microsporídios são patógenos intracelulares obrigatórios relacionados à fúngica que são a infecção mais comumente encontrada na Caenorhabdite capturada na natureza, com várias espécies sendo descobertas infectando C. elegans e nematoides relacionados ^8,11. Muitas bactérias são comumente encontradas habitando o lúmen intestinal de C. elegans capturadas na natureza e várias espécies foram estabelecidas como um modelo natural para o microbioma de C. elegans (CeMbio)6,12,13,14. Descobrir e caracterizar micróbios que colonizam e/ou infectam naturalmente C. elegans é essencial para entender os mecanismos genéticos que governam essas interações hospedeiro-micróbio, bem como visualizar novos processos microbianos que só ocorrem no contexto de um animal hospedeiro intacto.

Após a amostragem, os nematoides selvagens são rastreados por meio de microscopia de contraste de interferência diferencial (CIVD) para procurar fenótipos indicativos de infecção ou colonização. Por exemplo, alterações na aparência granulada estereotipada das células intestinais podem estar associadas à presença de uma infecção parasitária intracelular⁸. Especificamente, a perda dos grânulos intestinais e a diminuição da viscosidade citosólica são sinais de infecção viral, enquanto a reorganização dos grânulos intestinais em 'sulcos' pode indicar infecção por microsporídios no gênero Nematocida ^8,9. Como há uma grande variedade de micróbios presentes em amostras selvagens de C. elegans, pode ser difícil distinguir entre micróbios através da microscopia DIC. Informações sobre a distribuição espacial de micróbios dentro do hospedeiro também podem ser difíceis de detectar devido ao pequeno tamanho de muitos micróbios¹⁵. Além disso, a cultura de quaisquer micróbios específicos de interesse in vitro nem sempre é possível, levando a dificuldades na detecção e/ou quantificação.

A hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) fornece um método para marcar micróbios fluorescentemente utilizando sondas fluorescentes que se ligam ao RNA da pequena subunidade ribossomal (SSU) em células fixas. Se a análise de características morfológicas sugerir uma classe particular de micróbios, sondas FISH que visam classes específicas ou amplas de tais micróbios podem ser usadas. Por exemplo, a EUB338 é considerada uma sonda universal para a SSU bacteriana e é comumente usada para detectar uma ampla gama de bactérias¹⁶. O protocolo aqui descrito utiliza sondas de DNA de fita simples que são marcadas com fluoróforo e especificamente projetadas para serem complementares à SSU alvo do micróbio de interesse, embora existam sondas previamente projetadas disponíveis¹⁶. A principal vantagem de atingir a SSU dos micróbios é a abundância relativamente grande desse RNA, que normalmente compreende 80%-90% de todo o RNA na célula, levando à coloração com uma relação sinal-ruído muito alta¹⁷. As sondas também podem ser projetadas para direcionar o RNA para detectar vírus, como o vírus Orsay ^9,18, que geralmente estão presentes em cópias muito altas em células infectadas se o vírus estiver se replicando ativamente.

Dependendo dos resultados com sondas conhecidas, pode ser necessário obter mais informações de sequência para projetar sondas mais específicas para confirmação de espécies in situ. Uma abordagem comum é usar primers universais contra regiões conservadas da SSU (16S para bactérias e 18S para eucariotos) para amplificar (via PCR) regiões que são mais divergentes⁸. Usando essas informações de sequência, sondas com mais especificidade de espécies podem ser projetadas. Essas sondas FISH podem, então, permitir a identificação de micróbios de forma independente da cultura⁸. Além disso, o RNA FISH pode fornecer informações sobre características únicas de colonização morfológica e infecção, incluindo padrões de filamentação ou localização tecidual^19,20. Diferentes sondas FISH coloridas podem ser usadas simultaneamente, o que permite a distinção visual entre micróbios em amostras de nematoides selvagens, bem como a observação da dinâmica micróbio-micróbio dentro de um hospedeiro^15,20. Além disso, a coloração RNA FISH pode ser aplicada a estudos de interação hospedeiro-patógeno, onde a infecção e a colonização de uma espécie conhecida podem ser facilmente quantificadas manualmente ou por meio de abordagens automatizadas para fornecer insights sobre a carga de patógenos, por exemplo, na comparação de mutantes de C. elegans que aumentaram ou diminuíram a resistência à infecção²¹.

Protocolo

NOTA: Os nemátodos podem ser fixados com solução de paraformaldeído (PFA) ou acetona. O PFA permite uma melhor visualização da morfologia do que a acetona e pode preservar os sinais da proteína fluorescente verde transgênica (GFP), que é destruída pela acetona. No entanto, a fixação da acetona é necessária para permeabilizar os esporos microsporidianos para permitir a marcação dessa fase da vida. Além disso, a acetona pode ser mais conveniente do que o PFA porque é menos tóxica, e as amostras podem ser armazenadas por vários dias em acetona em um freezer de -20 °C sem a necessidade de remover o fixador. Abaixo estão dois protocolos separados, usando solução de PFA ou acetona como fixador. Para obter uma visualização das etapas do protocolo, consulte a Figura 1.

1. Coloração de PEIXES com fixação de PFA

1. Preparar nematoides com micróbios associados
   1. Cultive nematoides com o micróbio desejado de interesse em placas padrão de Nematoides Growth Media (NGM) semeadas com a fonte de alimento apropriada. Incubar os nemátodos a 20 °C até atingir a fase de vida pretendida.
   2. Adicionar 2 mL de meio de sais mínimos M9 (42 mM Na 2 HPO 4, 22 mM KH₂PO 4, 8,6 mM NaCl, 19 mM NH ₄ Cl) + 0,1% Tween 20 a placas de NGM contendo a cepa Caenorhabditis infectada ou colonizada com o micróbio desejado a ser visualizado.
      NOTA: A adição de detergente é para evitar que os nemátodos grudem em pipetas e tubos de microfuga e para ajudar os nemátodos do estágio L1-L2 a pellets. 0,1% Triton-X pode ser usado no lugar de Tween 20.
   3. Pipetar os nematoides das placas usando uma pipeta Pasteur de vidro e bulbo, e transferi-los para tubos de microfuge marcados de 1,5 mL.
      NOTA: As pipetas de vidro são preferidas porque os nemátodos podem aderir a pipetas de plástico, mas a adição de detergente (Tween 20 ou Triton-X) pode minimizar este problema.
   4. Usando uma microcentrífuga, gire as amostras contendo os nematoides colonizados ou infectados a 2.000 x g por 60 s para animais L1, ou 500 x g por 60 s para animais L4 ou adultos. Todas as etapas de centrifugação subsequentes serão realizadas na velocidade selecionada.
   5. Remova o sobrenadante dos tubos de microfuga usando uma pipeta. Evite perturbar o pellet nematoide removendo cuidadosamente o sobrenadante até 100 μL acima do pellet. Isso pode ser estimado usando tubos de microfugo marcados de 1,5 mL.
2. Lavar nematoides para eliminar a contaminação externa
   1. Adicione 1 mL de 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8mM KH₂PO₄) + 0,1% Tween 20 (PBS-T) a tubos de microfuga.
   2. Girar as amostras numa microcentrífuga à velocidade adequada (ver passo 1.1.4). Usando uma pipeta, remova todos, exceto 100 μL do sobrenadante. Isso pode ser estimado usando tubos de microfugo marcados de 1,5 mL.
   3. Repita os dois passos acima 2-3x.
      NOTA: Três lavagens totais são normalmente suficientes; no entanto, lavagens adicionais podem ser realizadas para remover qualquer excesso de contaminação externa.
3. Corrigir nematoides com PFA
   1. No exaustor, adicionar 33 μL de PFA a 16% ao tubo de microfuga contendo 100 μL de sobrenadante acima do pellet de nemátodo obtido a partir do passo 1.2.3 para uma concentração final de PFA a 4%.
      CUIDADO: O PFA é um agente cancerígeno. O contato com PFA pode resultar em sensibilização e irritação da pele e danos nos olhos. O PFA libera fumos tóxicos que podem levar à irritação respiratória ou sensibilização. Ao usar PFA, trabalhe em um exaustor com equipamento de proteção individual adequado e consulte as fichas de dados de segurança apropriadas antes do uso.
   2. Incubar as amostras contendo os nematoides colonizados ou infectados com o micróbio de interesse por 30-45 min à temperatura ambiente. Após a incubação, armazenar as amostras em etanol a 70% a 4 °C até que o protocolo esteja pronto para ser continuado.
      NOTA: Um período de incubação mais curto é melhor para manter o sinal de GFP em cepas transgênicas devido à degradação da GFP pelo PFA ao longo do tempo. Tempos de incubação mais longos permitem que o fixador permeie melhor nas amostras. É melhor determinar o tempo de incubação empiricamente dependendo da amostra.
4. Remova a solução de PFA
   1. Girar as amostras numa microcentrífuga à velocidade adequada (ver passo 1.1.4). Com uma pipeta, remova o máximo possível do sobrenadante sem perturbar o pellet.
      CUIDADO: O sobrenadante contém PFA, que é tóxico. Descarte o sobrenadante e pelo menos as duas primeiras lavagens como resíduos tóxicos em um exaustor.
   2. Adicionar 0,5 mL de PBS-T às amostras nos tubos de microfuga.
   3. Siga e repita as etapas 1.4.1 e 1.4.2 2-3x com PBS-T.
      NOTA: Realizar mais lavagens ajudará a reduzir o sinal de fundo. Pelo menos quatro lavagens no total são recomendadas.
   4. Após a última lavagem, gire as amostras para baixo e remova o sobrenadante, deixando o pellet intacto.
5. Preparar tampão de hibridização (HB) e lavar os nematoides
   1. Preparar 1 mL de HB (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,01% SDS) por amostra.
      NOTA: O HB deve ser preparado fresco antes de cada utilização para evitar a precipitação. No entanto, um tampão geral (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) pode ser feito com antecedência e armazenado à temperatura ambiente até que o HB seja necessário. Antes do uso, prepare 1 mL por amostra do tampão geral e adicione SDS a uma concentração final de 0,01%.
   2. Adicionar 800 μL de HB aos tubos de microfuga que contêm o pellet nemátodo. Colocar as amostras na microcentrífuga (ver passo 1.1.4). Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet.
6. Hibridizar a sonda FISH para a sequência de destino desejada
   1. Misturar 100 μL por amostra de HB preparado com a sonda FISH desejada até uma concentração final de 5-10 ng/μL de sonda.
      NOTA: As sondas FISH são oligos 15-23 -mer, antisense à SSU do micróbio de interesse e marcadas com um fluoróforo colorido ligado à extremidade 5' ou 3' (ver Tabela 1 para sondas usadas aqui). Geralmente, as sondas FISH de estoque são armazenadas a 1 mg/mL.
   2. Adicionar 100 μL de HB contendo sonda FISH a cada amostra. Misture agitando ou invertendo suavemente os tubos.
      NOTA: Diferentes sondas FISH coloridas podem ser adicionadas simultaneamente para visualizar vários sinais fluorescentes na mesma amostra (consulte a Figura 1B).
   3. Incubar as amostras durante a noite (6-24 h) em banho seco a 46-54 °C ou misturador térmico a 46-54 °C a 1.200 rpm.
      NOTA: A incubação a 46-48 °C é normalmente utilizada para hibridização. No entanto, essa temperatura pode precisar ser ajustada dependendo da temperatura de fusão da sonda FISH. Em geral, a temperatura de hibridização é de 4 °C abaixo da temperatura de fusão.
7. Remova a sonda FISH e lave os nematoides
   1. Preparar 3 mL de tampão de lavagem (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) por amostra.
      NOTA: A WB deve ser preparada fresca antes de cada utilização para evitar a precipitação. No entanto, um tampão geral (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) pode ser feito com antecedência e armazenado à temperatura ambiente até que o tampão de lavagem seja necessário. Antes de usar, prepare 3 mL por amostra do tampão geral e adicione EDTA a uma concentração final de 5 mM e SDS a uma concentração final de 0,01%.
   2. Centrifugar as amostras à velocidade adequada (ver passo 1.1.4). Remova o HB usando uma pipeta, tendo o cuidado de deixar o pellet de nematoide intacto.
   3. Adicionar 1 mL de WB preparado a cada amostra.
   4. Centrifugar as amostras à velocidade adequada (ver passo 1.1.4). Remova a WB usando uma pipeta, tendo o cuidado de deixar o pellet intacto.
   5. Adicionar 1 mL de WB preparado a cada amostra.
   6. Incubar as amostras durante 1 h a 48-56 °C em banho seco (ou misturador térmico a 48-56 °C a 1200 rpm). Se incubar em um banho seco, inverta suavemente os tubos a cada 15-20 min.
      NOTA: Em geral, 48 °C é usado como a temperatura de lavagem padrão; no entanto, essa temperatura pode precisar ser ajustada se houver um sinal de fundo alto. A temperatura de lavagem é frequentemente 2 °C mais elevada do que a temperatura de hibridização. O tempo de incubação no WB pode ser encurtado para 30 min para reduzir ainda mais o fundo, após o que, as etapas 1.7.4 e 1.7.5 devem ser repetidas. Isto deve ser seguido por um (para bactérias) ou dois (para microsporidia sporoplasms) 30 min de períodos de incubação a 48 °C.
   7. Centrifugar as amostras à velocidade adequada (ver passo 1.1.4). Usando uma pipeta, remova o tampão de lavagem, tendo o cuidado de deixar o pellet intacto.
   8. Adicionar 100-500 μL de PBS-T a cada uma das amostras. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas em PBS-T a 4 °C por até uma semana até que o protocolo esteja pronto para ser continuado.
8. Monte os nematoides
   1. Centrifugar as amostras à velocidade adequada (ver passo 1.1.4). Remova o máximo de PBS-T possível sem perturbar o pellet de nematoides.
   2. (Opcional) Adicionar 20 μL de meio de montagem antifade com DAPI (Tabela de Materiais) às amostras.
   3. Carregue um pipetador de 20 μL com uma ponta de pipeta de 200 μL e use uma tesoura para cortar a ponta da pipeta para permitir que nematoides maiores sejam pipetados.
   4. Com a ponta da pipeta cortada, transfira 5-10 μL do pellet para uma lâmina de microscópio. Cubra com uma tampa de 22 x 22. Para armazenar as lâminas, sele as bordas da tampa com esmalte e mantenha-as em uma caixa escura a 4 °C até que estejam prontas para uso posterior.

2. Coloração de PEIXES com fixação de acetona

1. Preparar nemátodos com micróbios associados, conforme descrito no passo 1.1.
2. Lavar os nemátodos para eliminar a contaminação externa, conforme descrito na etapa 1.2.
3. Corrigir nematoides com acetona
   1. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet e adicione 1 mL de acetona de grau laboratorial à amostra.
      CUIDADO: A acetona é um líquido e vapor altamente inflamável. Embora possa ser comprado ao balcão como removedor de esmalte, é importante lembrar que a acetona causa irritação ocular grave e pode causar sonolência ou tontura.
   2. Incubar as amostras contendo nematoides colonizados ou infectados com o micróbio de interesse por 15 min à temperatura ambiente. Após a incubação, as amostras podem ser armazenadas em acetona a -20 °C por até 2 semanas até que o protocolo esteja pronto para ser continuado.
      NOTA: Não use este protocolo com cepas transgênicas de C. elegans expressando GFP (ou suas formas alélicas mutadas) se for desejado manter a fluorescência, pois a acetona destrói esse sinal.
4. Remova a acetona
   1. Girar as amostras numa microcentrífuga à velocidade adequada (ver passo 1.1.4). Com uma pipeta, remova o sobrenadante sem perturbar o pellet.
      CUIDADO: O sobrenadante contém acetona. Descarte o sobrenadante e pelo menos as duas primeiras lavagens como resíduos tóxicos em um exaustor.
   2. Adicionar 0,5 mL de PBS-T às amostras nos tubos de microfuga.
   3. Siga e repita as etapas 2.4.1 e 2.4.2 2-4x com PBS-T.
      NOTA: Realizar mais lavagens ajudará a reduzir o sinal de fundo. Recomenda-se a realização de quatro lavagens no total.
   4. Após a última lavagem, gire as amostras e remova o sobrenadante, garantindo que o pellet não seja perturbado.
5. Preparar o tampão de hibridização (HB) e lavar os nemátodos conforme descrito no passo 1.5.
6. Hibridize a sonda FISH para a sequência de destino desejada, conforme descrito na etapa 1.6.
7. Remova a sonda FISH e lave os nematoides
   1. Preparar 1,1 mL de tampão de lavagem (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) por amostra.
      NOTA: A WB deve ser preparada fresca antes de cada utilização para evitar a precipitação. No entanto, um tampão geral (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) pode ser feito com antecedência e armazenado à temperatura ambiente até que um tampão de lavagem seja necessário. Antes de usar, prepare 1,1 mL por amostra do tampão geral e adicione EDTA a uma concentração final de 5 mM e SDS a uma concentração final de 0,01%.
   2. Centrifugar as amostras à velocidade adequada (ver 1.1.4). Remova o HB usando uma pipeta, tendo o cuidado de deixar o pellet de nematoide intacto.
   3. Adicionar 100 μL de WB preparado a cada amostra.
   4. Centrifugar as amostras à velocidade adequada (ver 1.1.4). Remova a WB usando uma pipeta, tendo o cuidado de deixar o pellet intacto.
   5. Adicionar 1 mL de WB preparado a cada amostra.
   6. Incubar as amostras durante 1 h a 48-56 °C em banho seco (ou misturador térmico a 48-56 °C a 1.200 rpm). Se incubar em um banho seco, inverta suavemente os tubos a cada 15-20 min.
      NOTA: Em geral, 48 °C é usado como a temperatura de lavagem padrão; no entanto, essa temperatura pode precisar ser ajustada se houver um sinal de fundo alto. A temperatura de lavagem é frequentemente 2 °C mais elevada do que a temperatura de hibridização.
   7. Centrifugar as amostras à velocidade adequada (ver passo 1.1.4). Usando uma pipeta, remova o tampão de lavagem, tendo o cuidado de deixar o pellet intacto.
   8. Adicionar 100-500 μL de PBS-T a cada uma das amostras. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas em PBS-T a 4 °C por até uma semana até que o protocolo esteja pronto para ser continuado.
8. Monte os nemátodos conforme descrito no passo 1.8.

Resultados

Para a análise de bactérias do microbioma, sondas FISH específicas e universais para 16S bacterianas foram utilizadas em animais isolados na natureza. A cepa selvagem de Caenorhabditis tropicalis (JU1848) foi amostrada da floresta de Nouragues, próxima a um pequeno rio na Guiana Francesa, a partir de frutos de palmeiras em decomposição²². Sob o microscópio de contraste de interferência diferencial (CIVD), verificou-se que essa cepa de nematoide foi colonizada por uma bactéria que parece aderir direcionalmente ao epitélio intestinal (Figura 2A). O JU1848 foi então limpo seletivamente para eliminar outros contaminantes microbianos e enriquecer para a bactéria aderente desejada²³. Utilizando o método de PCR universal, a bactéria foi identificada como uma nova espécie na classe Alphaproteobacteria. Uma sonda FISH marcada com Cal Fluor Red 610 foi então projetada especificamente para a sequência de RNAr 16S desta bactéria para permitir a visualização fluorescente da colonização dentro de C. tropicalis (Figura 2B). Uma sonda universal 16S rRNA FISH capaz de ligar muitas espécies de bactérias (EUB338) foi marcada com 6-carboxifluorescina (FAM) e também foi adicionada a esta amostra. Os sinais fluorescentes verdes e vermelhos se sobrepõem completamente, sugerindo que a maioria das bactérias que colonizam os intestinos são a bactéria Alphaproteobacteria aderente. Esses animais foram fixados em PFA antes da coloração.

Para a análise da infecção experimental em laboratório com patógenos intracelulares de identidade conhecida, foram utilizadas sondas FISH específicas para o vírus Orsay e microsporidina em C. elegans com fundo do tipo selvagem. O vírus Orsay é um vírus de RNA de fita positiva da família Nodaviridae, e o único patógeno viral natural encontrado em C. elegans. O genoma bipartido de RNA do vírus Orsay consiste em segmentos de RNA1 e RNA2, e sondas FISH visando ambos os segmentos foram desenvolvidas (Figura 3A,B)^9,18. No intestino, o RNA viral é detectado pelo homólogo DRH-1²⁴ do RIG-I, que é necessário para a ativação do programa de defesa transcricional denominado Intracellular Pathogen Response (IPR)^25,26,27. A transcrição de genes antivirais de DPI é pelo menos parcialmente controlada pelo fator de transcrição ZIP-1²¹. Aqui, a expressão de ZIP-1::GFP é vista localizada nos núcleos intestinais de células que apresentam coloração positiva do FISH pelo vírus Orsay no citoplasma (Figura 3A)²¹. Múltiplos animais corados com FISH específico de Orsay são mostrados para indicar a força deste sinal para fácil quantificação (Figura 3B). Os animais apresentados na Figura 3A,B foram fixados em PFA.

O parasita microsporidiano chamado Nematocida parisii, que significa assassino de nematoides de Paris, é um patógeno intracelular obrigatório do intestino. Várias sondas FISH que rotulam o RNAr 18S de N. parisii foram usadas, incluindo sondas MicroA e MicroB marcadas fluorescentemente. Múltiplos animais corados com MicroB FISH são mostrados para indicar a força deste sinal para fácil quantificação (Figura 3C). Além disso, C. elegans é infectada por outros microsporídios intimamente relacionados. A coinfecção de N2 com N. parisii e N. ausubeli relacionada pode ser distinguida usando este protocolo FISH projetando sondas FISH específicas de espécies que competem entre si para se ligarem a uma região divergente no rRNA 18S (Figura 3D)²⁸. Neste exemplo, a sonda N. parisii FISH tem emparelhamento de bases perfeito para o rRNA N. parisii 18S, mas uma incompatibilidade de 7 pb para N. ausubeli 18S rRNA. O inverso é verdadeiro para a sonda N. ausubeli. Como tal, cada sonda FISH específica da espécie superará a ligação à espécie cognata 18S em relação às espécies não cognatas. Além disso, o uso de DAPI para manchar núcleos permite uma melhor localização da infecção no contexto de todo o animal, especialmente para o intestino que possui núcleos grandes e facilmente identificáveis. A Figura 3C,D contém animais que foram fixados em PFA. Infecções posteriores com N. parisii resultam no desenvolvimento de merontes em esporos. Para visualizar os esporos de N. parisii, os animais devem ser fixados em acetona, pois penetra melhor na parede dos esporos do PFA (Figura 3E,F)⁸. A coloração FISH resultante demonstra as estruturas pequenas e grandes em forma de haste, que provavelmente correspondem aos esporos de N. parisii, que são corados com sondas específicas de N. parisii em vermelho.

Figura 1: Representação visual do protocolo FISH. Criado com Biorender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Coloração de peixes da cepa selvagem de C. tropicalis JU1848 colonizada com bactérias aderentes nos intestinos. (A) Imagem de Nomarski retratando milhares de bactérias de bacilos finos (bac) que se ligam direcionalmente ao intestino (in) de JU1848, criando um fenótipo semelhante a um pelo dentro do lúmen (lu). Este painel de figuras é adaptado de Morgan, E. et al. (2021)²³. (B) Coloração FISH de JU1848, fixada em PFA, utilizando uma sonda vermelha marcada (b002_16S_A-CF610) concebida para visar a sequência de rRNA 16S da bactéria aderente (em cima) e uma sonda FISH universal com marcação verde (EUB338-FAM) concebida para visar os 16S de bactérias (em baixo). A coloração DAPI dos núcleos do hospedeiro é mostrada em azul. Consulte a Tabela 1 para obter as sequências de sonda. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Coloração FISH de C. elegans infectados com patógenos intracelulares. (A,B) Coloração de FISH de C. elegans expressando ZIP-1::GFP e infectados com o vírus Orsay, que foram fixados com PFA antes da coloração para preservar o sinal de GFP. As sondas Orsay 1 Red e Orsay 2 Red foram usadas para coloração de patógenos. (A) A imagem composta consiste em canais fluorescentes vermelhos e verdes fundidos. A expressão nuclear de ZIP-1::GFP é induzida após a infecção pelo vírus Orsay e é mostrada em verde. A autofluorescência dos grânulos intestinais é mostrada em amarelo e indicada com setas amarelas. Linhas pontilhadas delineiam o corpo do nematoide. Barra de escala = 25 μm. (B) A imagem composta consiste em canais fluorescentes vermelhos e DIC mesclados. Barra de escamas = 200 μm. (C,D) Coloração de peixes de C. elegans do tipo selvagem infectados com microsporídios que foram fixados em PFA. (C) Coloração de peixes de C. elegans selvagens infectados com N. parisii e fixados em PFA. A sonda MicroB-CF610 foi utilizada para coloração de patógenos. A imagem composta consiste em canais fluorescentes vermelhos e DIC mesclados. Barra de escamas = 100 μm. (D) Coloração de peixes de C. elegans do tipo selvagem co-infectados com N. parisii e N. ausubeli no intestino. Os dois patógenos foram co-corados usando um par de sondas FISH específicas que competem pela ligação à mesma região do rRNA 18S. N. parisii foi corada com MicroF-CF610 (vermelho) e N. ausubeli com MicroSp1A-FAM (verde). A coloração DAPI dos núcleos do hospedeiro é vista em azul. Barra de escamas = 25 μm. (E) Coloração de peixes com C. elegans do tipo selvagem fixada em acetona infectada com esporos de N. parisii. MicroA-CF610 (vermelho) foi utilizado para coloração (vermelho). Barra de escala = 15 μm. (F) Imagem de Nomarski representando esporos de N. parisii vistos em (E). Barra de escala = 15 μm. Em (E) e (F), as estruturas pequenas e grandes em forma de haste são rotuladas com setas pequenas e grandes, respectivamente, que correspondem aos esporos de N. parisii. Consulte a Tabela 1 para obter as sequências de sonda. A imagem mostrada em (A) é adaptada de Lažetić, V. et al. (2022)²¹. As imagens apresentadas em (B) e (C) são adaptadas de Reddy, K. C. et al. (2019)²⁶. As imagens apresentadas em (E) e (F) são adaptadas de Troemel, E. R. et al. (2008)⁸. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome da sonda	Especificidade da sonda	Fluoróforo da sonda	Sequência da sonda
EUB338-FAM	Bacteriana 16S (universal)	5' 6-fluoresceína (FAM)	GCTGCCTCCCGTAGGAGT
b002_16S_A-CF610	Alfaproteobactérias 16S	Cal Fluor Vermelho 610 (CF610)	TGTACCGACCCTTAACGTTC
Orsay1 Vermelho	RNA1 do vírus de Orsay	Cal Fluor Vermelho 610 (CF610)	GACATATGTGATGCCGAGAC
Orsay2 Vermelho	RNA2 do vírus de Orsay	Cal Fluor Vermelho 610 (CF610)	GTAGTGTCATTGTAGGCAGC
MicroA-CF610	Nematocida parisii 18S	Cal Fluor Vermelho 610 (CF610)	CTCTGTCCATCCTCGGCAA
MicroB-CF610	Nematocida parisii 18S	Cal Fluor Vermelho 610 (CF610)	CTCTCGGCACTCCTTCCTG
MicroF-CF610	Nematocida parisii 18S	Cal Fluor Vermelho 610 (CF610)	AGACAAATCAGTCCACGAATT
MicroSp1A-FAM	Nematocida ausubeli 18S	5' 6-fluoresceína (FAM)	CAGGTCACCCCACGTGCT

Tabela 1: Lista de sequências de sondas FISH. Todas as sondas FISH foram compradas comercialmente com o fluoróforo ligado à extremidade 5' (via síntese personalizada de oligonucleotídeos; ver Tabela de Materiais) e os oligonucleotídeos foram purificados por HPLC de fase reversa.

Discussão

C. elegans selvagens são naturalmente associados a uma variedade de micróbios. Os pesquisadores podem usar o RNA FISH para detectar e identificar esses micróbios, bem como obter informações sobre sua localização no contexto de um animal inteiro. Micróbios com fenótipos desejáveis ou interessantes podem ser identificados através deste método e, em seguida, isolados para posterior caracterização e sequenciamento. A abundância de numerosos isolados bacterianos de C. elegans selvagens também pode ser quantificada via RNA FISH²⁹. Usando o protocolo descrito aqui, também é possível observar microrganismos conhecidos dentro de seus hospedeiros e aprender mais sobre suas interações. É importante ressaltar que o vírus Orsay e os microsporídios são parasitas obrigatórios e não podem ser cultivados independentemente do hospedeiro, portanto, o FISH é a ferramenta de visualização padrão. A colonização ou infecção também pode ser quantificada através do RNA FISH usando nematoides cultivados em placas semeadas com uma bactéria cultivável desejada de interesse. Além de corar microrganismos no intestino de C. elegans, esse protocolo pode ser utilizado para outras cepas de nematoides como C. tropicalis ou Oscheius tipulae^19,23.

A principal vantagem do protocolo FISH é que ele oferece um método simples, rápido e robusto para corar micróbios associados a C. elegans. As imagens produzidas a partir da coloração FISH têm uma alta relação sinal-ruído, que é alcançada utilizando sondas FISH que visam o RNA abundante da SSU dentro da amostra. Como normalmente existem níveis de rRNA de 30x ou mais do que o rDNA, a maior parte do sinal da coloração FISH com sondas que visam o rRNA é devido ao rRNA em vez do rDNA³⁰. Além disso, o RNA FISH torna possível ver a infecção ou colonização dentro do contexto de todo o animal. Essa visualização é facilitada através da cocoloração dos núcleos do hospedeiro com DAPI e/ou do uso de cepas fluorescentes de C. elegans marcadas para melhor destacar a localização da infecção ou colonização dentro da amostra. Por exemplo, o FISH específico para microsporidina foi utilizado para determinar o tropismo tecidual de Nematocida displodere utilizando um painel de cepas de C. elegans com expressão de GFP em diferentes tecidos²⁰. Além disso, este protocolo é passível de mudanças que permitem aos pesquisadores determinar as condições ideais adequadas às suas necessidades específicas (por exemplo, ajustar o período de fixação, aumentar a temperatura de hibridização).

Uma etapa crítica no protocolo FISH é a fixação das amostras. O período de incubação após a adição do fixador é necessário para dar tempo para que o agente permeie a amostra. Tempos de incubação mais longos não são ideais para amostras contendo proteínas fluorescentes transgênicas devido à degradação de proteínas pelo PFA ao longo do tempo. Para amostras contendo GFP, é imperativo determinar o tempo de fixação ideal para permitir a permeabilização, mantendo o sinal de GFP.

O peixe pode ser usado para corar bactérias, vírus ou microsporídios em C. elegans. No entanto, o melhor tipo de agente fixador utilizado para o FISH depende da amostra e dos requisitos a jusante. Este protocolo apresenta uma solução de PFA como o principal agente fixador para corar bactérias e vírus. No entanto, o PFA não é suficiente para a visualização de esporos microsporidianos, pois não pode penetrar na parede dos esporos. Para visualização de esporos, a acetona deve ser usada em vez disso. Embora, a fixação de PFA seja eficiente para a marcação FISH de outros estágios de vida da microspororidia, incluindo esporoplasmas, merontes e esporontos. Outras diferenças importantes são observadas entre a fixação de acetona e a fixação de PFA; A acetona é mais conveniente porque as amostras podem ser rapidamente armazenadas no congelador após a adição, sem a necessidade de lavagem. No entanto, a acetona mata rapidamente qualquer GFP existente em um hospedeiro transgênico. O PFA é o fixador preferido se for importante preservar algumas estruturas fisiológicas no hospedeiro, pois os animais fixados em acetona parecem estar mais degradados, dificultando a identificação de alguns tecidos. Como as amostras são fixas, este protocolo FISH não permite imagens ao vivo de interações hospedeiro-micróbio in vivo. No entanto, um curso de tempo de infecção por pulso-perseguição seguido de coloração FISH de amostras em vários momentos pode permitir ver algumas dinâmicas de infecção microbiana 19,20,31.

Outra etapa crítica ao longo do protocolo é a lavagem completa das amostras antes e depois da hibridização. Antes da hibridização, ao coletar os vermes nos tubos de microfuga, o excesso de bactérias ou outros micróbios das placas de NGM pode ser transportado com a amostra de verme. Três lavagens com PBS-T são padrão; no entanto, mais lavagens podem ser necessárias para eliminar suficientemente microrganismos externos, especialmente quando se usa C. elegans fortemente contaminados e isolados na natureza. Ao visualizar as amostras montadas após o FISH, pode haver alguma sonda FISH residual que produza grandes quantidades de sinal no fundo da amostra. A temperatura de lavagem e o número de lavagens são importantes para remover o excesso e a sonda não especificamente ligada. Para reduzir a fluorescência de fundo, é possível realizar duas ou três lavagens com 1 mL de WB a cada 30 min, em vez de uma lavagem com 1 mL de WB por uma hora. Diferentes sondas FISH podem exigir diferentes temperaturas de lavagem. Normalmente, a temperatura de lavagem é de 2 °C acima da temperatura de hibridização, mas isso pode ser aumentado se houver muita fluorescência de fundo (alto ruído).

O protocolo FISH utiliza sondas fluorescentes projetadas para atingir RNA microbiano específico de espécies, mas as sondas FISH podem ser projetadas para outros transcritos de alta cópia. Outras sondas FISH podem ter diferentes temperaturas de fusão, de modo que as etapas de incubação podem precisar ser realizadas a uma temperatura mais alta ou mais baixa do que a descrita. A coloração FISH pode identificar a distribuição espacial da colonização microbiana ou infecção dentro do hospedeiro, permitindo a caracterização das interações hospedeiro-micróbio e micróbio-micróbio. Uma limitação é que apenas alguns fluoróforos convencionais podem ser usados simultaneamente, o que reduz o número de diferentes microrganismos que podem ser detectados via FISH ao mesmo tempo. Isso limita seu uso para estudos complexos de microbioma em C. elegans. No entanto, o FISH multicolorido direcionado ao rRNA utiliza sondas marcadas com fluoróforos não canônicos que podem aumentar o número de rótulos de grupos microbianos distintos¹⁵. Outra limitação é que é difícil distinguir entre espécies intimamente relacionadas, especialmente bactérias, que têm sequências SSU que são altamente semelhantes. No entanto, a extrema divergência de sequência entre as espécies de microsporídios ajuda a facilitar sua diferenciação com esse protocolo (Figura 3)^32,33.

No geral, este protocolo FISH descreve uma técnica para detectar microrganismos dentro de C. elegans. Ele permite que os pesquisadores usem um sistema modelo transparente e geneticamente tratável para detectar e quantificar a colonização e a infecção dentro do contexto de um animal intacto, bem como identificar o comportamento microbiano único ou a morfologia dentro do hospedeiro. Uma versão pré-impressa deste manuscrito foi postada durante a revisão³⁴.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% SDS	Invitrogen	AM9822
Acetone	Fisher Scientific	A-11-1
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield)	Vectalab	NC9524612
EDTA	Fisher Scientific	S311-500
FISH probes (see Table 1)	LGC Biosearch Technologies		FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis
KCl	Fisher Scientific	P217
KH2PO4	Fisher Scientific	P-286
Na2HPO4	Fisher Scientific	S375-500
NaCl	Fisher Scientific	S-671
NH4Cl	Fisher Scientific	A-661
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	50-980-487	CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately
Thermal mixer	Eppendorf	5384000020
Tris base	Fisher Scientific	BP152
Triton X-100	Fisher Scientific	BP-151
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500