Modelo de Doação em Animais de Grande Porte após Morte Circulatória e Perfusão Regional Normotérmica para Avaliação Cardíaca

Resumo

O protocolo descreve um modelo de doação pós-morte circulatória de animais de grande porte (suínos), seguido de perfusão regional normotérmica toracoabdominal, que simula de perto o cenário clínico do transplante cardíaco e tem o potencial de facilitar estudos e estratégias terapêuticas.

Resumo

O aumento da demanda por transplante cardíaco ao longo dos anos tem alimentado o interesse pela doação após morte circulatória (DCD) para ampliar o pool de doadores de órgãos. Entretanto, o processo de TDC está associado ao risco de lesão tecidual cardíaca devido ao inevitável período de isquemia quente. A perfusão regional normotérmica (NRP) permite a avaliação in situ de órgãos, permitindo a obtenção de corações determinados como viáveis. Aqui, descrevemos um modelo clinicamente relevante de DCD em animais de grande porte seguido de NRP. A morte circulatória é estabelecida em porcos anestesiados pela interrupção da ventilação mecânica. Após um período de isquemia quente predefinido, um oxigenador de membrana extracorpórea (ECMO) é usado por um período de NRP que dura pelo menos 30 min. Durante esse período de reperfusão, o modelo permite a coleta de várias biópsias miocárdicas e amostras de sangue para avaliação cardíaca inicial. Uma vez desmamada a PRN, avaliações bioquímicas, hemodinâmicas e ecocardiográficas da função cardíaca e do metabolismo podem ser realizadas antes da captação do órgão. Esse protocolo simula de perto o cenário clínico previamente descrito para TDC e NRP no transplante cardíaco e tem o potencial de facilitar estudos que visem diminuir a lesão de isquemia-reperfusão e melhorar a preservação e recuperação funcional cardíaca.

Introdução

Mais de 300.000 indivíduos morrem na América do Norte a cada ano de insuficiência cardíaca (IC); O transplante cardíaco continua sendo a única opção de tratamento para alguns desses pacientes com doença terminal¹. Historicamente, a fonte exclusiva para o transplante cardíaco eram os corações de doadores obtidos após a determinação neurológica do óbito (NDD), mas, mesmo assim, apenas cerca de 40% estavam adequados para o^transplante2. Entre 15% a 20% dos pacientes morrem enquanto aguardam a doação de um coração, sendo a escassez de corações doados um dos motivos que cria uma discrepância entre os corações disponíveis e os corações necessários². Para aumentar o pool de doadores de órgãos, uma consideração importante é a utilização de corações doados após morte circulatória (DCD)³. Há relutância em usar corações DCD porque esses órgãos são invariavelmente submetidos a um período de isquemia desprotegida (quente) após a interrupção da circulação sanguínea e podem sofrer danos irreversíveis. Embora existam relatos de sucesso no transplante cardíaco DCD com excelentes resultados precoces^4,5, há necessidade de desenvolver um método de avaliação validado para determinar se esses corações são utilizáveis e potencialmente predizer seu desempenho pós-transplante ^6,7. Para limitar os períodos isquêmicos dos corações com DCD e monitorá-los continuamente durante o armazenamento e transporte, foram desenvolvidos sistemas de perfusão cardíaca ex situ ⁸. No entanto, essa tecnologia conta com máquinas complexas com equipamentos de perfusão e tem um alto custo inicial sem qualquer garantia de que o órgão captado será adequado para transplante. Um novo protocolo para transplante cardíaco DCD baseado em perfusão regional normotérmica (NRP) foi proposto por Messer e^cols.3. Essa técnica consiste em restaurar a perfusão miocárdica enquanto o coração ainda está no doador e excluir a circulação cerebral. Permite uma avaliação funcional in situ antes da aquisição³.

Quando se utilizam modelos de grandes animais, o coração porcino é uma das plataformas preferidas para a realização de pesquisas cirúrgicas cardíacas, devido à sua semelhança anatômica com o coração humano. Entretanto, alguns fatores importantes em corações suínos devem ser considerados ao utilizar esse modelo. Por exemplo, o tecido cardíaco suíno é muito frágil e friável e propenso a rupturas, especialmente na artéria pulmonar e no átrio direito⁹. Outro fator importante a ser considerado é que o coração suíno é muito sensível à isquemia e propenso a arritmias, razão pela qual os antiarrítmicos devem ser administrados rotineiramente a todos os animais antes do experimento; no entanto, ainda é considerado um modelo adequado para o estudo da isquemia aguda no transplante^cardíaco9.

Este manuscrito descreve um modelo de doação após morte circulatória seguida de perfusão regional normotérmica toracoabdominal que simula de perto o cenário clínico no transplante cardíaco e tem o potencial de facilitar novos estudos terapêuticos e estratégias de pesquisa translacional.

Protocolo

O comitê institucional de cuidados e uso de animais do Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) aprovou todos os protocolos experimentais, e os animais foram tratados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Para este protocolo, foram utilizados suínos machos ou fêmeas da raça Large White, com 3-4 meses de idade, pesando entre 50 e 60 kg. O tamanho dos animais pode variar de acordo com os objetivos experimentais dos pesquisadores.

1. Preparo animal e indução anestésica

1. Pré-medicar o animal com injeção intramuscular de atropina (0,04 mg/kg), midazolam (0,3 mg/kg) e cetamina (20 mg/kg). Administrar isoflurano em concentração expirada final de 1%-3% em 3 L/min O₂, utilizando máscara facial para indução e manutenção da anestesia.
2. Confirme a anestesia adequada testando um tônus mandibular relaxado e ausência de dor usando a resposta de pinça dos dedos. Certifique-se de que o animal seja colocado em decúbito dorsal e mantido em normotermia com manta térmica.
3. Após a confirmação da adequação anestésica, realizar intubação orotraqueal com tubo endotraqueal de 6,5-8 mm, conforme descrito em ¹⁰.
4. Coloque o monitor de saturação de oxigênio na orelha ou lábio inferior do animal para monitoramento contínuo. Ajustar a ventilação para uma pressão expiratória final positiva (PEEP) de 5 cm H 2 O, uma pressão inspiratória de pico (PIP) de 15 cm H 2 O, uma fração inspirada de oxigênio (FIO 2) de 0,5 e uma frequência respiratória (FR) de 15 respirações/min atingindo um volume corrente (VC) de 6-8 mL/kg e pressão parcial normal de O 2 e CO ₂. Ajustar a FR para manter um nível expirado de CO₂ final de 35-45 mmHg.
5. Obter um acesso intravenoso periférico através da veia auricular usando um cateter de 20 G. Iniciar uma infusão de manutenção de solução salina normal (NaCl a 0,9%) e administrar 2 g de sulfato de magnésio (MgSO₄) em bolus intravenoso para prevenir arritmias.
6. Prepare os locais cirúrgicos raspando e esfregando adequadamente o tórax e as virilhas. Desinfetar virilha e pescoço usando clorexidina e drape adequadamente, proporcionando acesso venoso e arterial.
7. Coloque a almofada de eletrodo cautério nas costas do animal. Colocar o animal em posição de Trendelenburg para facilitar o acesso venoso central.
8. Localize a veia jugular direita usando um ultrassom. Uma vez localizada, usando uma agulha, entre na pele em um ângulo de 45° até que o sangue seja visto e a agulha seja vista na veia no ultrassom.
9. Coloque o fio-guia na agulha e, em seguida, insira um introdutor percutâneo de bainha venosa central de 7 Fr sobre o fio-guia.
10. Remova o fio-guia mantendo o introdutor da bainha no lugar e, em seguida, insira um cateter de Swans-Ganz para garantir as medidas de débito cardíaco e o cateterismo cardíaco direito.
    NOTA: A veia jugular esquerda pode ser usada em vez da direita. Se o acesso não for possível, inserir o introdutor diretamente na veia jugular interna (esquerda ou direita) após esternotomia mediana. Nesse caso, certifique-se de dissecar a veia.
11. Usando a mesma técnica, insira um cateter venoso central (por exemplo, duplo lúmen) na veia jugular esquerda.
12. Inserir outro introdutor percutâneo da bainha venosa central de 7 Fr na veia femoral direita usando a técnica de Seldinger conforme descrito nos passos 1.7. a 1.10., para a introdução de um cateter de condutância no ventrículo direito (VD). Isso pode ser feito por via percutânea com ecoguia, ou após esternotomia mediana.
13. Permitir um período de estabilidade por 10 minutos após a intubação e manipulação e, em seguida, medir os parâmetros hemodinâmicos e de função cardíaca basais, incluindo pressões pulmonar e sistêmica, débito cardíaco, alças pressão-volume do VD e do VE e ecocardiografia transtorácica.

2. Estabelecimento de acesso cirúrgico

1. Com o uso de cautério, realizar incisão mediana da região cervical média até a xifoide. Em seguida, divida a gordura subcutânea, camada por camada, ao longo da linha média, utilizando o eletrocautério para alcançar o periesterno.
2. Corte ao redor da fúrcula esternal e use um dedo para retrair e varrer os tecidos moles sob o esterno. Abra o esterno com uma serra óssea e certifique-se de que o esterno está completamente dividido, tendo cuidado com a veia abaixo da parte superior do osso esternal. Cauterizar o esterno e/ou aplicar cera de osso para garantir hemostasia adequada.
3. Com o eletrocautério, dissecar e remover o timo, levantando-o do pericárdio. Cauterizar os vasos que suprem o timo da aorta e da veia cava superior (VCS) para evitar sangramento.
4. Corte cuidadosamente o pericárdio aberto com o cautério. Insira os dedos sob o pericárdio durante o corte para evitar lesões no coração.
5. Administrar 300 unidades/kg de heparina IV para anticoagulação sistêmica. Se o teste estiver disponível, garanta o tempo de coagulação ativado (TCA) ˃ 300 s.

3. Retirada de terapias mantenedoras da vida e declaração de óbito

1. Administrar um bolus de 3 mg/kg de propofol IV e, em seguida, interromper a ventilação mecânica e desconectar o tubo endotraqueal.
   OBS: Esta etapa corresponde à "Retirada do Suporte de Vida" para o lançamento da Perfusão Regional Normomêmica. Para condições de eutanásia, consulte a secção 8.
2. Monitorar a pressão arterial e a saturação periférica do_O2 . Iniciar tempo de isquemia quente funcional quando a pressão sistólica < 50 mmHg.
3. Estabelecer parada circulatória quando houver assistolia (ou fibrilação ventricular) e ausência de pulsatilidade arterial. Iniciar uma fase mínima de observação de 5 minutos após a parada circulatória ser estabelecida (período de afastamento) e, posteriormente, declarar a morte do animal.

4. Colocação da perfusão regional normotérmica toracoabdominal

1. Com o uso do cautério, dissecar cuidadosamente o espaço aortopulmonar. Retrair inferiormente a via de saída do VD, a artéria pulmonar à esquerda e a aorta à direita para evitar lesões diretas a esta última. Leve uma ajuda de assistentes, se necessário, durante esta etapa.
2. Dissecar e ligar os vasos supra-aórticos para evitar e excluir a perfusão cerebral. Alternativamente, aplique uma grande braçadeira cruzada sobre os vasos.
3. Inserir dois cateteres 18G nas carótidas bilateralmente distalmente à oclusão para avaliar o fluxo sanguíneo potencial para o cérebro. Coletar e medir o sangue durante todo o experimento e reinfundir através do circuito NRP.
4. Com metzenbaum e pinça de ângulo reto, dissecar delicadamente entre a VCS e a artéria inominada e entre a VCI e o pericárdio. Circundar a VCS e a VCI usando uma fita umbilical ou uma sutura simples de 0-seda e prenda-as com um torniquete.
5. Com sutura 3-0, colocar duas suturas concêntricas em bolsa na adventícia da aorta ascendente distal; Evite suturas de espessura total. Coloque uma sutura em bolsa no átrio direito (AD). Fixe todas as suturas com torniquete.
6. Montar e orientar o sistema NRP de acordo com as necessidades dos pesquisadores e experimentais. Para este protocolo, utilizar um circuito de ECMO com bomba centrífuga, preparado com 2 L de solução cristaloide contendo 500 mg de Solumedrol, 200 mL de bicarbonato de sódio (NaOH) a 8,4%, 300 unidades/kg de heparina e 2 g de MgSO₄.
   OBS: A configuração utilizada aqui é semelhante à utilizada pelos perfusionistas da instituição na divisão de cirurgia cardíaca.
7. Com uma cânula arterial de 17 a 21 F, canular a aorta e, em seguida, apertar o torniquete segurando a sutura em bolsa para fixar a cânula no lugar.
   NOTA: Alternativamente, insira uma cânula de oxigenador de membrana extracorpórea (ECMO) usando a técnica de Seldinger para minimizar a perda de sangue. Outro método consiste no uso de uma cânula arterial de bypass padrão. A cânula aórtica é então conectada à linha arterial do circuito NRP usando um conector 3/8-3/8; garantir o desarejamento completo para evitar embolia gasosa.
8. Crie uma incisão de 5 mm no centro da corda da bolsa no AD e, em seguida, dilate-a usando um instrumento de ângulo pequeno como um ângulo reto ou estalo. Cubra a incisão com um dedo para evitar sangramento excessivo.
9. Use uma cânula venosa de duplo estágio para canular o AR e, em seguida, aperte as suturas em bolsa usando um torniquete para fixar a cânula no lugar.
10. Conecte as cânulas à linha venosa do circuito NRP usando um conector 1/2-3/8 e garanta o esvaziamento completo para evitar um bloqueio de ar no sistema.
11. Certifique-se de que um mínimo de 15 minutos tenha se passado entre a declaração de óbito e o início da NRP para abranger pelo tempo necessário na prática clínica a preparação, o drapeamento e o acesso ao coração.
12. Iniciar a PNR 15 minutos após o início do tempo de isquemia quente funcional. Manter a normotermia durante todo o procedimento. Ajustar os fluxos progressivamente até atingir um índice de perfusão de 2,5 L/min/m². Reiniciar a ventilação mecânica com FIO₂ de 50% e TV de 6 mL/kg.
    NOTA: Modifique essas configurações de acordo com o desenho experimental.
13. Infundir continuamente 10 μg/kg/min de dopamina e 4 unidades/min de vasopressina IV. Use epinefrina e noradrenalina durante a perfusão inicial e, em seguida, titule-as conforme necessário para ajudar na regulação da pressão, mantendo a pressão arterial acima de 50 mmHg.

5. Manutenção da reperfusão e alvos para o desmame

1. Reperfundir o coração por 30 minutos antes de tentar desmamar para NRP. Se o desmame não for bem-sucedido, realizar mais 15 min de reperfusão para apoiar com NRP antes de tentar desmamar novamente por um tempo máximo total de reperfusão de 180 min.
2. Proceder à avaliação cardíaca após o desmame bem-sucedido. Se o desmame não for alcançado após esse período, interrompa o experimento e relate o problema.
   NOTA: Deve ser adaptado aos objetivos de cada investigador.
3. Avalie os critérios de desmame do PNR e certifique-se de que todos os critérios sejam atendidos, conforme detalhado na Tabela 1.

6. Avaliação da recuperação cardíaca

1. Gerar análises de alça pressão-volume (PV) para medir a contratilidade cardíaca. O cateter de condutância permite medidas contínuas das relações VE-PV.
   1. Obter registros em estado estacionário para gerar parâmetros dependentes do volume, trabalho braçal e pressão desenvolvida, e ocluir a VCI com uma fita umbilical para gerar parâmetros independentes de volume através da oclusão, ou seja, trabalho de curso recrutável pré-carga.
2. Medir a pressão venosa central, pressão de artéria pulmonar, débito cardíaco, pressão de VD e pressão de oclusão de capilar pulmonar usando o cateter de Swans-Ganz introduzido no início do experimento.
3. Analise a função cardíaca através da ecocardiografia utilizando uma sonda transesofágica padrão e uma sonda transtorácica colocada diretamente sobre o coração.
4. Realizar avaliações metabólicas através da coleta de amostras de sangue arterial e venoso para análises. Extrair sangue diretamente do seio coronário para avaliar a função metabólica do coração especificamente. Analise os níveis de gases sanguíneos e lactato.
5. Além disso, coletar biópsias miocárdicas do VD e do VE, se necessário. Obter amostras de outros órgãos transplantáveis de interesse (por exemplo, pulmões, fígado, rins), dependendo dos objetivos do investigador.

7. Remoção do NRP e avaliação cardíaca

1. Quando os critérios de desmame forem atendidos, pare o NRP. Retire a cânula do AR e aperte rapidamente a sutura em bolsa para minimizar a perda de sangue. Fixar a sutura com nós e seguir o mesmo procedimento para retirada da cânula aórtica.
2. Avaliar a função cardíaca a cada 30 min por 2 h após a interrupção da NRP, conforme descrito nos passos 6.1. até 6.4.

8. Término do experimento

1. Após 2 h, colocar um cateter de cardioplegia 16 G ou 18 G na aorta ascendente. Conecte a cânula ao circuito NRP.
2. Em seguida, descomprimir as cavidades cardíacas direitas incisando a VCI e as cavidades esquerdas incisando o átrio esquerdo com o uso do cautério.
3. Apertar a aorta ascendente após a inserção da cânula e administrar 1,5 L de solução de cardioplegia Del Nido a 4 °C ao coração. Certifique-se de que a pressão de perfusão é de 50 mmHg.
4. Interromper a ventilação mecânica e colocar gelo (NaCl a 0,9%) na cavidade torácica após o início da cardioplegia para resfriamento. Prosseguir com a cardiectomia de maneira tradicional assim que a infusão de cardioplegia estiver completa.
5. Utilizar o coração coletado para obtenção de biópsias miocárdicas extensas para avaliação e avaliação. Realizar outras biópsias de outros órgãos (por exemplo, pulmões, fígado, rins), dependendo do desenho experimental e do objetivo dos investigadores
   NOTA: A Figura 1 fornece um resumo das etapas do protocolo mostradas e a Tabela 1 fornece a definição dos parâmetros e critérios utilizados neste estudo.

Figura 1: Resumo esquemático do protocolo experimental. Abreviações: NRP = Normothermic Regional Perfusion. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	Definição/Critérios
Período de Isquemia Quente Funcional	Período que se inicia quando a pressão sistólica < 50 mmHg e termina quando a PRN é iniciada. Neste protocolo, esse período é de 15 min
Prisão Circulatória	Estabelece-se quando o coração está em assistolia ou fibrilação ventricular
Período de impasse	Período que se inicia com a parada circulatória e termina com a declaração de óbito. Neste protocolo, esse período é de 5 min
Desmame bem-sucedido do NRP	Uso mínimo de inotrópicos e vasopressores
	IC > 2,2 L/min/m2
	PAM > 55 mmHg
	PAR < 15 mmHg
	POAP < 15 mmHg
	Função normal do VE e VD

Tabela 1: Definição representativa dos parâmetros e critérios utilizados neste protocolo. Abreviações: IC = Índice Cardíaco; PAM = Pressão Arterial Média; NRP = Perfusão Regional Normomêmica; POAP = pressão capilar pulmonar; PAR = Pressão de Átrio Direito.

Resultados

Este modelo pré-clínico tem sido utilizado com sucesso em nossa instituição para múltiplos experimentos. Primeiro, demonstramos que os corações DCD, inicialmente reperfundidos com NRP, demonstraram recuperação funcional semelhante após o transplante quando comparados à doação convencional de coração batendo preservado com armazenamento refrigerado. Além disso, utilizamos esse protocolo para mostrar que a avaliação funcional cardíaca após NRP foi preditiva de recuperação pós-transplante. Finalmente,...

Discussão

Este manuscrito descreve uma doação em modelo de animais de grande porte após morte circulatória (DCD) seguida de perfusão regional toracoabdominal normotérmica. Neste experimento, o coração é reperfundido por um mínimo de 30 min e um máximo de 3 h antes de ser desmamado do circuito de ECMO. O coração está então funcionando por conta própria por 2 h, o que permite uma avaliação cardíaca valiosa a curto prazo. Portanto, a principal limitação desse protocolo é o seguimento em curto prazo; no entanto, ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amiodarone			As available in the institution
Angiocath 20G	BD	381704
Atropine 0.4 mg/mL			As available in the institution
Biomedicus Centrifugal Pump	Medtronic
Cardioplegia Solution (Del Nido)	in-house made		Another solution can be used at the discretion of the researcher
Cautery Pencil	Covidien	E2515H
Central Venous Catheter double-lumen	Cook Medical	C-UDLM-501J-LSC
Central Venous Sheath Introducer 7 Fr
Conductance Catheter
CPB pack	Medtronic
DLP Aortic Root Cannula	Medtronic	12218
DLP double-stage venous cannula (29 or 37 F)	Medtronic
Dobutamine			As available in the institution
Dopamine			As available in the institution
Electrode Polyhesive	Covidien	E7507
EOPA Arterial Cannula (17 or 21 F)
Epinephrine			As available in the institution
O2 Face Mask			As available in the institution
Gloves, Nitrile, Medium	Fischer	27-058-52
Heparin 1000 IU/mL			As available in the institution
Inhaled Isofurane			Provided by the institution's animal facility
Jelco 16 or 18 G catheter
Ketamine inj. 50 mL vial (100 mg/mL)	Health Canada		Health Canada approval is required
Lidocaine/Xylocaine 1%			As available in the institution
Magnesium Sulfate 5 g/10 mL			As available in the institution
Midazolam inj. 10 mL vial (5 mg/mL)	Health Canada		Health Canada approval is required
MPS Quest delivery disposable pack	Quest Medical	5001102-AS
Norepinephrine			As available in the institution
Normal Saline (NaCl 0.9%) 1L bag	Baxter	JB1324
Pipette Tips 1 mL	Fisherbrand	02-707-405
Propofol 1 mg/mL			As available in the institution
Rocuronium			As available in the institution
Set Admin Prim NF PB W/ Checkvalve	Smith Medical	21-0442-25
Sodium Bicarbonate (NaOH) 8.4%			As available in the institution
Sofsil 0 wax coated	Covidien	S316
Solumedrol 500 mg/5 mL			As available in the institution
Suction Tip	Covidien	8888501023
Suction Tubing 1/4'' x 120''	Med-Rx	70-8120
Suture 3.0 Prolene Blu M SH	Ethicon	8523H
Suture 5.0 Prolene BB	Ethicon	8580H
Suture Prolene Blum 4-0 SH 36	Ethicon	8521H
Suture BB 4.0 Prolene	Ethicon	8881H
Tracheal Tube, 6.5 mm	Mallinckrodt	86449
Vasopressin			As available in the institution