Модель донорства на крупных животных после смерти от кровообращения и нормотермическая регионарная перфузия для оценки сердечной деятельности

Резюме

Протокол описывает модель донорства крупных животных (свиней) после смерти кровообращения с последующей торакоабдоминальной нормотермической регионарной перфузией, которая точно имитирует клинический сценарий трансплантации сердца и может способствовать терапевтическим исследованиям и стратегиям.

Аннотация

Рост спроса на трансплантацию сердца на протяжении многих лет подогревал интерес к донорству после смерти от кровообращения (DCD) для расширения пула доноров органов. Однако процесс DCD связан с риском повреждения сердечной ткани из-за неизбежного периода теплой ишемии. Нормотермическая регионарная перфузия (NRP) позволяет проводить оценку органов in situ , позволяя получать сердца, признанные жизнеспособными. Здесь мы описываем клинически значимую модель DCD на крупных животных с последующим NRP. Кровоциркуляционная гибель устанавливается у наркозированных свиней путем прекращения искусственной вентиляции легких. После заданного периода теплой ишемии используется экстракорпоральный мембранный оксигенатор (ЭКМО) в течение периода NRP продолжительностью не менее 30 минут. В течение этого реперфузионного периода модель позволяет собирать различные биопсии миокарда и образцы крови для первоначальной оценки сердца. После отлучения от NRP биохимические, гемодинамические и эхокардиографические оценки сердечной функции и метаболизма могут быть выполнены до получения органов. Этот протокол точно имитирует клинический сценарий, ранее описанный для DCD и NRP при трансплантации сердца, и может способствовать исследованиям, направленным на уменьшение ишемии-реперфузионного повреждения и улучшение функционального сохранения и восстановления сердца.

Введение

Более 300 000 человек ежегодно умирают в Северной Америке от сердечной недостаточности (СН); Трансплантация сердца остается единственным вариантом лечения для некоторых из этих пациентов с терминальной стадией заболевания¹. Исторически сложилось так, что исключительным источником для трансплантации сердца были донорские сердца, полученные после неврологического определения смерти (NDD), но даже тогда только около 40% были достаточными для трансплантации². От 15% до 20% пациентов умирают в ожидании донорства сердца, при этом нехватка донорских сердец является одной из причин, которая создает несоответствие между доступными сердцами и необходимыми сердцами². Для увеличения пула доноров органов одним из важных соображений является использование сердец, пожертвованных после смерти кровообращения (DCD)³. Существует нежелание использовать DCD сердца, потому что эти органы неизменно подвергаются периоду незащищенной (теплой) ишемии после прекращения кровообращения и могут получить необратимые повреждения. Хотя существуют сообщения об успешной трансплантации сердца DCD с отличными ранними исходами^4,5, необходимо разработать проверенный метод оценки, чтобы определить, можно ли использовать эти сердца, и потенциально предсказать их эффективность после трансплантации ^6,7. Для ограничения ишемических периодов ДКД сердца и непрерывного контроля за ними при хранении и транспортировке^{были разработаны системы} перфузии сердца ex situ8. Однако эта технология опирается на сложные аппараты с перфузионным оборудованием и имеет высокую первоначальную стоимость без какой-либо гарантии, что закупленный орган будет пригоден для трансплантации. Новый протокол трансплантации сердца DCD, основанный на нормотермической региональной перфузии (NRP), был предложен Messer et al³. Эта методика предполагает восстановление перфузии миокарда во время нахождения сердца еще у донора и исключение мозгового кровообращения. Это позволяет проводить функциональную оценку на месте до начала закупок³.

При использовании моделей крупных животных сердце свиньи является одной из предпочтительных платформ для проведения кардиохирургических исследований, учитывая его анатомическое сходство с сердцем человека. Тем не менее, при использовании этой модели следует учитывать некоторые важные факторы в свиных сердцах. Например, сердечная ткань свиньи очень хрупкая и склонна к разрывам, особенно в легочной артерии и правом предсердии⁹. Еще один важный фактор, который следует учитывать, заключается в том, что сердце свиньи очень чувствительно к ишемии и склонно к аритмиям, поэтому антиаритмические средства следует регулярно вводить каждому животному перед экспериментом; Тем не менее, она по-прежнему считается подходящей моделью для изучения острой ишемии при трансплантации сердца⁹.

В этой рукописи описывается модель донорства крупных животных (свиней) после смерти кровообращения с последующей торакоабдоминальной нормотермической регионарной перфузией, которая точно имитирует клинический сценарий трансплантации сердца и может способствовать новым терапевтическим исследованиям и стратегиям трансляционных исследований.

протокол

Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию Научно-исследовательского центра госпитальеров Университета Монреаля (CRCHUM) одобрил все экспериментальные протоколы, и лечение животных проводилось в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию. Для этого протокола использовали 3-4-месячных крупных белых свиней или самок весом 50-60 кг. Размер животного может варьироваться в зависимости от экспериментальных целей исследователей.

1. Подготовка животных и индукция анестетика

1. Премедикацию животному вводят внутримышечно атропина (0,04 мг/кг), мидазолама (0,3 мг/кг) и кетамина (20 мг/кг). Вводите изофлуран с концентрацией 1-3% в 3 л / мин O₂, используя маску для лица для индукции и поддержания анестезии.
2. Подтвердите адекватную анестезию, проверив расслабленный тон челюсти и отсутствие боли, используя реакцию защемления пальцев ног. Убедитесь, что животное находится в положении дорсального пролежня и поддерживается в нормотермии с помощью согревающего одеяла.
3. После подтверждения адекватности анестетика проведите интубацию оротрахеи с использованием эндотрахеальной трубки диаметром 6,5-8 мм, как описано в ^{пункте 10}.
4. Поместите монитор насыщения кислородом на ухо или нижнюю губу животного для непрерывного мониторинга. Отрегулируйте вентиляцию на положительное давление в конце выдоха (PEEP) 5 см H 2 O, пиковое давление вдоха (PIP) 15 см H 2 O, фракцию вдыхаемого кислорода (FIO 2) 0,5 и частоту дыхания (RR) 15 вдохов в минуту, достигая дыхательного объема (TV) 6-8 мл / кг, и нормального парциального давления O 2 и CO ₂. Отрегулируйте RR так, чтобы поддерживать уровень CO₂ в конце прилива на уровне 35-45 мм рт.ст.
5. Получите периферический внутривенный доступ через ушную вену с помощью катетера 20 G. Начните поддерживающую инфузию нормального физиологического раствора (0,9% NaCl) и введите 2 г сульфата магния (MgSO₄) в виде внутривенного болюса для предотвращения аритмий.
6. Подготовьте хирургические участки, адекватно побрив и очистив грудную клетку и пах. Продезинфицируйте пах и шею с помощью хлоргексидина и задрапируйте соответствующим образом, обеспечивая венозный и артериальный доступ.
7. Положите подушечку прижигающего электрода на спину животного. Поместите животное в положение Тренделенбурга, чтобы облегчить доступ к центральным венам.
8. Найдите правую яремную вену с помощью УЗИ. После обнаружения с помощью иглы вводите кожу под углом 45 ° до тех пор, пока не будет видна кровь и игла не будет видна в вене на УЗИ.
9. Поместите проводник в иглу, а затем вставьте поверх проводника чрескожной центральной венозной оболочки 7 Fr.
10. Снимите проводник, удерживая проводник оболочки на месте, затем вставьте катетер Swans-Ganz, чтобы обеспечить измерение сердечного выброса и катетеризацию правых отделов сердца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Левая яремная вена может быть использована вместо правой. Если доступ невозможен, вставьте оболочку непосредственно во внутреннюю яремную вену (левую или правую) после срединной стернотомии. В этом случае обязательно рассеките вену.
11. Используя ту же технику, вставьте центральный венозный катетер (например, двойной просвет) в левую яремную вену.
12. Вставьте еще один интродьюсер чрескожной центральной венозной оболочки 7 Fr в правую бедренную вену, используя технику Селдингера, как описано в шагах 1.7. до 1.10., для введения проводимого катетера в правый желудочек (ПЖ). Это можно сделать чрескожно с эхо-наведением или после стернотомии средней линии.
13. Дайте период стабильности в течение 10 минут после интубации и манипуляции, затем измерьте исходные параметры гемодинамики и сердечной функции, включая легочное и системное давление, сердечный выброс, петли давления и объема ПЖ и ЛЖ, а также трансторакальную эхокардиографию.

2. Установление хирургического доступа

1. С помощью прижигательной ручки выполните разрез по средней линии от середины шейки матки до мечевидной кости. После этого разделите подкожно-жировую клетчатку, слой за слоем, вдоль средней линии, используя электрокоагуляцию, чтобы достичь перигрудины.
2. Разрежьте вокруг грудинной выемки и пальцем втяните и выведите мягкие ткани из-под грудины. Откройте грудину с помощью костной пилы и убедитесь, что грудина полностью разделена, соблюдая осторожность с веной под верхней частью грудинной кости. Прижигают грудину и/или наносят костный воск, чтобы обеспечить адекватный гемостаз.
3. С помощью электрокоагуляции рассекают и удаляют тимус, поднимая его из перикарда. Прижигайте сосуды, которые снабжают тимус из аорты и верхней полой вены (SVC), чтобы предотвратить кровотечение.
4. Аккуратно разрежьте перикард с помощью прижигания. Вставьте пальцы под перикард во время разрезания, чтобы избежать травмирования сердца.
5. Введите 300 единиц / кг гепарина внутривенно для достижения системной антикоагуляции. Если тест доступен, убедитесь, что активированное время свертывания крови (ACT) ˃ 300 с.

3. Отмена поддерживающих жизнь методов лечения и объявление смерти

1. Вводят болюс 3 мг/кг пропофола внутривенно, а затем прекращают искусственную вентиляцию легких и отсоединяют эндотрахеальную трубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг соответствует «Прекращению жизнеобеспечения» для запуска нормотермической региональной перфузии. Сведения об условиях эвтаназии см. в разделе 8.
2. Контролируйте артериальное давление и периферическое насыщение_O2. Начало функциональной теплой ишемии наступает тогда, когда систолическое давление < 50 мм рт.ст.
3. Устанавливают остановку кровообращения при наличии асистолии (или фибрилляции желудочков) и отсутствии артериальной пульсации. Начните минимальную фазу наблюдения продолжительностью 5 минут после того, как будет установлена остановка кровообращения (период противостояния), а затем объявите о смерти животного.

4. Установка торакоабдоминальной нормотермической регионарной перфузии

1. С помощью прижигания тщательно рассеките аортолегочное пространство. Втяните выходной тракт ПЖ внизу, легочную артерию слева и аорту справа, чтобы избежать прямого поражения последней. Воспользуйтесь помощью помощников, если это необходимо на этом этапе.
2. Рассекают и перевязывают надаортальные сосуды, чтобы избежать и исключить церебральную перфузию. В качестве альтернативы наложите большой поперечный зажим на сосуды.
3. Вставьте два катетера 18 G в сонные артерии двусторонне дистально от окклюзии, чтобы оценить потенциальный приток крови к мозгу. Собирайте и измеряйте кровь на протяжении всего эксперимента и повторно вводите через цепь NRP.
4. Используя щипцы Метценбаума и прямоугольные щипцы, аккуратно рассеките между СВК и безымянной артерией, а также между НПВ и перикардом. Обмотайте СВК и НПВ пуповинной лентой или простым 0-шелковым швом и закрепите их жгутом.
5. Используя шов 3-0, наложите два концентрических кисетных шва на дистальную восходящую адвентицию аорты; Избегайте наложения швов на всю толщину. Наложите кисетный шов на правое предсердие (РА). Закрепите все швы жгутом.
6. Настройка и подготовка системы NRP в соответствии с потребностями исследователей и экспериментов. Для этого протокола используйте схему ЭКМО с центробежным насосом, заправленным 2 л кристаллоидного раствора, содержащего 500 мг солумедрола, 200 мл 8,4% бикарбоната натрия (NaOH), 300 единиц / кг гепарина и 2 г MgSO₄.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая здесь установка аналогична той, которую используют перфузиологи учреждения в отделении кардиохирургии.
7. Используя артериальную канюлю от 17 до 21 F, канюлируйте аорту, затем затяните жгут, удерживающий кисетный шов, чтобы закрепить канюлю на месте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы вставьте канюлю экстракорпорального мембранного оксигенатора (ЭКМО) с использованием техники Сельдингера, чтобы свести к минимуму кровопотерю. Другой метод заключается в использовании стандартного шунтирования артериальной канюли. Затем канюля аорты подключается к артериальной линии контура NRP с помощью разъема 3/8-3/8; Обеспечьте полное проветривание, чтобы избежать воздушной эмболии.
8. Сделайте разрез диаметром 5 мм в центре кошелька-шнура на РА, а затем расширьте его с помощью инструмента под небольшим углом, такого как прямоугольник или защелка. Закройте разрез пальцем, чтобы избежать чрезмерного кровотечения.
9. Используйте двухступенчатую венозную канюлю для канюляции ревматоидного артрита, затем затяните кисетные швы с помощью жгута, чтобы закрепить канюлю на месте.
10. Подключите канюли к венозной линии контура NRP с помощью разъема 1/2-3/8 и обеспечьте полное проветривание, чтобы избежать воздушной пробки в системе.
11. Убедитесь, что между объявлением смерти и началом NRP прошло не менее 15 минут, чтобы охватить время, необходимое для подготовки клинической практики, драпировки и доступа к сердцу.
12. Начало НРП через 15 мин после начала функциональной теплой ишемии. Поддерживайте нормотермию на протяжении всей процедуры. Постепенно регулируйте расход, чтобы достичь индекса перфузии 2,5 л/мин/^м2. Возобновите искусственную вентиляцию легких с FIO₂ 50% и телевизором 6 мл/кг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измените эти настройки в соответствии с экспериментальным проектом.
13. Непрерывно вводят 10 мкг/кг/мин дофамина и 4 единицы/мин вазопрессина внутривенно. Используйте адреналин и норадреналин во время начальной перфузии, а затем титруйте их по мере необходимости, чтобы помочь в регулировании давления, поддерживая артериальное давление выше 50 мм рт.ст.

5. Поддержание реперфузии и мишени для отлучения от груди

1. Реперфузируйте сердце в течение 30 минут, прежде чем пытаться отлучить от груди для NRP. Если отлучение от груди не увенчалось успехом, выполните дополнительные 15 минут реперфузии для поддержки NRP, прежде чем снова пытаться отлучить от груди, чтобы общее максимальное время реперфузии составило 180 минут.
2. Приступайте к кардиологической оценке после успешного отлучения от груди. Если по истечении этого времени отлучение от груди не достигнуто, остановите эксперимент и сообщите о проблеме.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть адаптировано к целям каждого исследователя.
3. Оцените критерии отлучения от NRP и убедитесь, что все критерии соблюдены, как подробно описано в таблице 1.

6. Оценка восстановления сердца

1. Проведите анализ петли давления и объема (PV) для измерения сократимости сердца. Проводимый катетер позволяет непрерывно измерять отношения ЛЖ и ЛЖ.
   1. Получите стационарные записи для генерации параметров, зависящих от объема, работы с ходом и развитого давления, и закупорьте IVC пуповинной лентой для создания независимых от объема параметров посредством окклюзии, а именно работы с ходом с предварительной нагрузкой.
2. Измерьте центральное венозное давление, давление в легочной артерии, сердечный выброс, давление RV и давление в легочных капиллярах с помощью катетера Swans-Ganz, введенного в начале эксперимента.
3. Проанализируйте сердечную функцию с помощью эхокардиографии с использованием стандартного чреспищеводного зонда и трансторакального зонда, размещенного непосредственно на сердце.
4. Проведите метаболическую оценку, собрав образцы артериальной и венозной крови для анализа. Возьмите кровь непосредственно из коронарного синуса, чтобы конкретно оценить метаболическую функцию сердца. Анализируйте газы крови и уровень лактата.
5. Кроме того, при необходимости соберите биопсии миокарда из ПЖ и ЛЖ. Получить образцы из других трансплантируемых органов, представляющих интерес (например, легких, печени, почек), в зависимости от целей исследователя.

7. Удаление NRP и оценка сердца

1. Когда критерии отлучения будут выполнены, прекратите NRP. Извлеките канюлю из ревматоидного артрита и быстро затяните кисетный шов, чтобы свести к минимуму кровопотерю. Закрепите шов узлами и выполните ту же процедуру, чтобы удалить канюлю аорты.
2. Оценивайте сердечную функцию каждые 30 минут в течение 2 ч после прекращения НРП, как описано в шагах 6.1. до 6.4.

8. Завершение эксперимента

1. Через 2 ч поместите катетер кардиоплегии 16 г или 18 г в восходящую аорту. Подключите канюлю к цепи NRP.
2. После этого декомпрессируйте правую полость сердца, разрезав IVC, и левую полости, разрезав левое предсердие с помощью прижигания.
3. Зажмите восходящую аорту после введения канюли и введите в сердце 1,5 л раствора кардиоплегии Дель Нидо при температуре 4 °C. Убедитесь, что перфузионное давление составляет 50 мм рт.ст.
4. Прекратите искусственную вентиляцию легких и поместите ледяную жижу (0,9% NaCl) в грудную полость после начала кардиоплегии для охлаждения. Приступайте к кардиэктомии традиционным способом после завершения инфузии кардиоплегии.
5. Используйте собранное сердце для получения обширной биопсии миокарда для оценки и оценки. Выполнение других биопсий из других органов (например, легких, печени, почек) в зависимости от дизайна эксперимента и цели исследователей
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлена сводка показанных этапов протокола, а в таблице 1 приведено определение параметров и критериев, используемых в этом исследовании.

Рисунок 1: Схематическое резюме экспериментального протокола. Сокращения: NRP = нормотермическая регионарная перфузия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

	Определение/критерии
Период функциональной теплой ишемии	Период, который начинается, когда систолическое давление < 50 мм рт.ст., и заканчивается, когда начинается НРП. В этом протоколе этот период составляет 15 минут
Остановка кровообращения	Устанавливается, когда сердце находится в асистолии или при фибрилляции желудочков
Период противостояния	Период, который начинается с остановки кровообращения и заканчивается констатацией смерти. В этом протоколе этот период составляет 5 минут
Успешное отлучение от NRP	Минимальное использование инотропов и вазопрессоров
	CI > 2,2 л/мин/м2
	MAP > 55 мм рт.ст.
	Рециклинговый < 15 мм рт.ст.
	PCWP < 15 мм рт.ст.
	Нормальная функция НН и ПЖ

Таблица 1: Репрезентативное определение параметров и критериев, используемых в настоящем протоколе. Сокращения: CI = сердечный индекс; MAP = среднее артериальное давление; NRP = нормотермическая регионарная перфузия; PCWP = давление клина легочного капилляра; RAP = давление в правом предсердии.

Результаты

Эта доклиническая модель была успешно использована в нашем учреждении для проведения многочисленных экспериментов. Во-первых, мы продемонстрировали, что сердца DCD, первоначально реперфузированные с помощью NRP, продемонстрировали аналогичное функциональное восстановление после тран?...

Обсуждение

В этой рукописи описывается донорство модели крупного животного после смерти кровообращения (DCD) с последующей торакоабдоминальной нормотермической регионарной перфузией. В этом эксперименте сердце реперфузируется в течение минимум 30 минут и максимум 3 часов, прежде чем оно будет отл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amiodarone			As available in the institution
Angiocath 20G	BD	381704
Atropine 0.4 mg/mL			As available in the institution
Biomedicus Centrifugal Pump	Medtronic
Cardioplegia Solution (Del Nido)	in-house made		Another solution can be used at the discretion of the researcher
Cautery Pencil	Covidien	E2515H
Central Venous Catheter double-lumen	Cook Medical	C-UDLM-501J-LSC
Central Venous Sheath Introducer 7 Fr
Conductance Catheter
CPB pack	Medtronic
DLP Aortic Root Cannula	Medtronic	12218
DLP double-stage venous cannula (29 or 37 F)	Medtronic
Dobutamine			As available in the institution
Dopamine			As available in the institution
Electrode Polyhesive	Covidien	E7507
EOPA Arterial Cannula (17 or 21 F)
Epinephrine			As available in the institution
O2 Face Mask			As available in the institution
Gloves, Nitrile, Medium	Fischer	27-058-52
Heparin 1000 IU/mL			As available in the institution
Inhaled Isofurane			Provided by the institution's animal facility
Jelco 16 or 18 G catheter
Ketamine inj. 50 mL vial (100 mg/mL)	Health Canada		Health Canada approval is required
Lidocaine/Xylocaine 1%			As available in the institution
Magnesium Sulfate 5 g/10 mL			As available in the institution
Midazolam inj. 10 mL vial (5 mg/mL)	Health Canada		Health Canada approval is required
MPS Quest delivery disposable pack	Quest Medical	5001102-AS
Norepinephrine			As available in the institution
Normal Saline (NaCl 0.9%) 1L bag	Baxter	JB1324
Pipette Tips 1 mL	Fisherbrand	02-707-405
Propofol 1 mg/mL			As available in the institution
Rocuronium			As available in the institution
Set Admin Prim NF PB W/ Checkvalve	Smith Medical	21-0442-25
Sodium Bicarbonate (NaOH) 8.4%			As available in the institution
Sofsil 0 wax coated	Covidien	S316
Solumedrol 500 mg/5 mL			As available in the institution
Suction Tip	Covidien	8888501023
Suction Tubing 1/4'' x 120''	Med-Rx	70-8120
Suture 3.0 Prolene Blu M SH	Ethicon	8523H
Suture 5.0 Prolene BB	Ethicon	8580H
Suture Prolene Blum 4-0 SH 36	Ethicon	8521H
Suture BB 4.0 Prolene	Ethicon	8881H
Tracheal Tube, 6.5 mm	Mallinckrodt	86449
Vasopressin			As available in the institution