Termografia infravermelha para detecção de alterações na atividade do tecido adiposo marrom

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a atividade do tecido adiposo marrom após uma refeição em humanos e animais de laboratório.

Resumo

A mensuração da atividade do tecido adiposo marrom (BAT) por tomografia por emissão de pósitrons (PET-CT) via acúmulo de ¹⁸F-fluordesoxiglicose (FDG) após uma refeição ou em pacientes obesos ou diabéticos falha como método de escolha. A principal razão é que ¹⁸F-FDG compete com a alta concentração plasmática de glicose pós-prandial pelo mesmo transportador de glicose na membrana das células BAT. Além disso, a MTD também utiliza ácidos graxos como fonte de energia, o que não é visível com o PET-CT e pode ser alterado juntamente com a concentração de glicose em pacientes obesos e diabéticos. Portanto, para estimar a importância fisiológica das MTD em animais e humanos, um novo método de termografia infravermelha utilizado em publicações recentes é aplicado.

Após jejum noturno, a atividade da MTD foi medida por termografia infravermelha antes e depois de uma refeição em voluntários humanos e camundongos fêmeas selvagens. O software da câmera calcula a temperatura do objeto usando a distância do objeto, a emissividade da pele, a temperatura ambiente refletida, a temperatura do ar e a umidade relativa. Em camundongos, a área raspada acima da MTD foi uma região de interesse para a qual as temperaturas médias e máximas foram medidas. A fase do ciclo estral em ratas foi determinada após experimento por esfregaço vaginal corado com cresilvioleta (0,1%) corado com solução corada com violeta de cresil. Em voluntários saudáveis, duas áreas de pele do pescoço foram selecionadas: a área supraclavicular (acima da clavícula, onde as células MTD estão presentes) e a área interclavicular (entre as clavículas, onde não há tecido MTD detectado). A atividade MTD é determinada pela subtração desses dois valores. Além disso, as temperaturas média e máxima das áreas da pele puderam ser determinadas em animais e participantes humanos.

As mudanças na atividade das MTD após uma refeição medida por termografia infravermelha, um método não invasivo e mais sensível, mostraram ser dependentes de sexo, idade e fase do ciclo estral em animais de laboratório. Como parte da termogênese induzida pela dieta, a ativação de MTD em humanos também provou ser dependente de sexo, idade e índice de massa corporal. Determinar ainda mais as alterações fisiopatológicas na atividade da MTD após uma refeição será de grande importância para participantes com altas concentrações plasmáticas de glicose (obesidade e diabetes mellitus tipo 2), bem como em diferentes animais de laboratório (camundongos knock-out). Este método também é uma ferramenta variável para determinar possíveis drogas ativadoras que poderiam rejuvenescer a atividade da BAT.

Introdução

O tecido adiposo marrom (BAT), em contraste com o tecido adiposo branco (TAB), não armazena, mas gasta energia. Após estimulação simpática, a MTD utiliza ácidos graxos e glicose e produz calor pela ativação da proteína desacopladora 1 (UCP1). A função da UCP1 é usar um gradiente de H⁺ entre duas membranas mitocondriais para produzir calor em vez de ATP. A função das MTD é aumentar a produção de calor em condições frias, o que leva a um aumento do gasto energético¹. Após a exposição ao frio, as entradas sensoriais da pele inibem os neurônios sensíveis ao calor no núcleo pré-óptico mediano (MnPO) da área pré-óptica hipotalâmica (POA), o que diminui o efeito inibitório dos neurônios POA sobre o rostral raphe pallidus (rRPa). A ativação dos neurônios rRPa aumenta a atividade simpática, que é acompanhada por um aumento na atividade da MTD ^2,3. A ativação do BAT induzida pelo frio melhora a sensibilidade à insulina em humanos⁴, e essa atividade é diminuída em humanos com aumento do índice de massa corporal (IMC) e idade 1,5,6,7.

Além de seu papel na termogênese induzida pelo frio, após uma refeição, a captação de glicose no MTD aumenta na população masculina magra, contribuindo para a termogênese induzida pela dieta (DIT), que é maior em indivíduos do sexo masculino positivos para MTD ^8,9. A técnica de ponta utilizada para medir a atividade da MTD é a tomografia computadorizada por emissão de pósitrons, conhecida como PET-CT. Este método determina a atividade MTD medindo o acúmulo do radiotraçador fluordesoxiglicose (¹⁸F-FDG). No entanto, a PET-CT falha como método de escolha para detectar a ativação da MTD após uma refeição. Uma das razões é que, após uma refeição, ¹⁸F-FDG compete com a hiperglicemia pós-prandial pelo mesmo transportador de glicose, o que o torna inadequado para determinar a ativação da MTD após uma refeição, especialmente quando se compara a atividade da MTD em participantes saudáveis e diabéticos com possíveis diferenças nas concentrações de glicose no sangue. Além disso, a MTD utiliza ácidos graxos como fonte de energia para a produção de calor, o que não é visível com o PET-CT. ^18º O acúmulo de F-FDG nas MTD após uma refeição é pouco visível¹⁰ e, portanto, é interpretado como um resultado negativo na maioria dos casos. Sem surpresa, recentemente, foi sugerido que a ativação da MTD é mais pronunciada na população humana do que pensávamos anteriormente; portanto, uma nova abordagem para detectar a atividade da MTD e seu envolvimento em distúrbios metabólicos é necessária⁷. Uma tentativa de solucionar esse problema é medir o volume das MTD por meio de ressonância magnética (RM) em pacientes pré-diabéticos e portadores de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) com resistência insulínica¹¹. No entanto, o volume de MTD medido pela RM não é um indicador suficiente para estimar a função diária e o uso de glicose e ácidos graxos pela BAT. Portanto, para estimar diferenças reais na atividade da MTD em pacientes saudáveis versus com DM2, é necessária uma nova abordagem que ofereça a possibilidade de descobrir o mecanismo patológico do mau funcionamento da MTD em pacientes com DM2.

Para determinar a ativação da BAT, foram realizadas medidas da produção de calor MTD antes e após uma refeição utilizando termografia infravermelha (IR) (Figura 1)^12,13. Estabelecer a termografia IR como um método de escolha para medir a atividade das MTD após uma refeição em indivíduos saudáveis e obesos ou pacientes com diabetes mellitus terá um enorme impacto no campo. Até hoje, a termografia IR é utilizada para a determinação da ativação induzida pelo frio da MTD^13,14,15. Na história humana recente, a atividade BAT induzida pelo frio não é mais muito pronunciada (devido ao aquecimento adequado dos habitats, roupas adequadas), enquanto a ativação das MTD após uma refeição ocorre todos os dias. Além disso, a regulação fisiológica destas duas funções MTD através do hipotálamo é completamente diferente. Após uma refeição, a ativação de neurônios que expressam proopiomelanocortina (POMC) no núcleo arqueado hipotalâmico (Arc) leva a um aumento da atividade nervosa simpática via rRPa¹⁶. A ativação induzida pelo frio da MTD medida por termografia IR ou PET-CT é inadequada quando usada como uma medida para a atividade diária da MTD. O aumento da atividade da MTD após uma refeição é seguido pela utilização de glicose, o que é importante para manter a homeostase da glicose, a sensibilidade à insulina e a regulação diária da concentração de glicose. A ativação do MTD pós-prandial leva a um aumento no consumo de glicose pós-prandial, seguido por um aumento na produção de calor e na temperatura corporal (DIT). Isso se mostrou dependente de sexo, idade e IMC¹². Diferenças semelhantes entre os sexos na ativação das MTD após uma refeição são observadas em camundongos de laboratório machos e fêmeas¹⁷. Esses achados correspondem às diferenças de gênero recentemente descobertas na regulação da MTD por Burke e col., que mostraram que a regulação hipotalâmica do escurecimento da MTD via uma subpopulação de neurônios POMC difere em camundongos machos e fêmeas¹⁸. A ativação pós-prandial da MTD é menor em mulheres, populações mais velhas e obesos. A falta de ativação das MTD após uma refeição (diminuição da utilização de glicose) poderia levar a uma maior prevalência de intolerância à glicose em mulheres 19,20,21,22. Infelizmente, a maioria dos estudos sobre a ativação das MTD foi feita apenas em homens. Ao ativar a MTD após uma refeição, a captação de glicose aumenta na população masculina magra. Não é surpreendente que, após a ativação das MTD, a DIT seja maior em indivíduos do sexo masculino positivos para MTD ^8,9. Além disso, o transplante de MTD em camundongos machos melhora a tolerância à glicose, aumenta a sensibilidade à insulina e diminui o peso corporal e a massa gorda²³.

A PET-CT falha como método de escolha para medir a atividade das MTD, especialmente após uma refeição. Portanto, um método não invasivo e mais sensível foi desenvolvido. A termografia IR permite estimar a atividade da MTD em diferentes animais de laboratório (camundongos knock-out), bem como em participantes humanos, independentemente do sexo, idade ou dos efeitos de diferentes condições patológicas sobre a atividade da BAT. Um benefício adicional deste método é a simplicidade para os participantes e animais de laboratório, o que nos permite estimar os benefícios potenciais da terapia de reforço BAT. Os estudos recentes que utilizaram a termografia IR para determinar o comportamento fisiológico das MTD após exposição ao frio ou refeição estão descritos na recente publicação de Brasil et ^al.24.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais em animais de laboratório foram aprovados pelo Comitê Nacional de Ética e pelo Ministério da Agricultura (EP 185/2018). Os experimentos foram conduzidos de acordo com o Código de Ética da Sociedade Croata de Ciência Animal de Laboratório e as diretrizes do ARRIVE. Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo participantes humanos foram de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Zagreb (UP/I-322-01/18-01/56). Neste estudo, apresentamos os resultados de três participantes do sexo feminino (IMC: 29 kg/m 2 ± 5 kg/m²). Consentimento informado foi obtido de todos os voluntários humanos para sua participação no estudo e para a apresentação dos dados.

1. Medindo a ativação do tecido adiposo marrom após uma refeição em humanos

NOTA: Efectuar as experiências durante o Verão, quando a temperatura diária não for inferior a 22 °C, a fim de manter a actividade basal das MTD o mais baixa possível.

1. Escolha cuidadosamente os participantes saudáveis de controle (se a atividade da MTD deve ser estimada em condições patológicas), uma vez que a atividade da MTD é dependente do sexo, idade, IMC e até mesmo da fase do ciclo estral.
   1. Para estimar a fase do ciclo menstrual das participantes do sexo feminino, faça perguntas sobre a duração média do ciclo menstrual e a data do primeiro dia da última menstruação. Não se esqueça de marcar a data dos experimentos.
      NOTA: A seleção adequada de indivíduos-controle compatíveis é a parte mais difícil dos estudos clínicos, uma vez que controles saudáveis e participantes com condições patológicas devem ser o mais semelhantes possível e diferir apenas na doença investigada.
2. Peça aos participantes que descansem bem, que não tomem café da manhã (jejum sem ingestão de calorias), que se reúnam nas horas da manhã para os experimentos e que descansem por pelo menos 30 min para evitar uma possível ativação das MTD durante a atividade muscular via ativação simpática.
3. Peça aos participantes que retirem a parte superior da roupa 15 minutos antes das medidas para evitar os possíveis efeitos do aquecimento da superfície da pele (efeitos térmicos das roupas) enquanto determinam a atividade basal das MTD. Efectuar medições à temperatura ambiente adequada (22-27 °C).
4. Realizar medições de infravermelho.
   1. Enquanto os participantes estiverem descansando, monte a câmera térmica (tipo de detector: microbolômetro não resfriado; passo do detector: 17 μm; faixa espectral da câmera: 7,5-14,0 μm; sensibilidade térmica: 20 mK a 30 °C; lentes: 36 mm; resolução: 1024 pixels x 768 pixels; campo de visão instantâneo [IFOV]: 0,47 mRad) no tripé e posicione-o a 1 m de distância do local onde o participante estará sentado.
      NOTA: Se as medições forem realizadas em climas mais frios (temperaturas do ar externo abaixo de 15 °C a 50% de umidade), coloque a câmera em temperatura ambiente e ligue-a por pelo menos 1 h antes de realizar as medições. Instrumentos frios podem dar resultados diferentes após o aquecimento à temperatura ambiente devido à autocalibração.
   2. Conecte a câmera térmica a um computador e software conforme instruções do fabricante. Registre a folha de alumínio (amassada e depois esticada) a uma distância focal de 1 m para determinar a temperatura refletida da sala, apresentada como temperatura medida. No software da câmera, insira a distância de 0 m e a emissividade de 1.
      NOTA: A temperatura aparente refletida é um parâmetro obtido quando a emissividade da câmera é ajustada para 1,0 e a distância para 0 m e as medições são feitas em papel alumínio amassado e depois esticado. A temperatura aparente refletida representa uma aproximação da radiação infravermelha incidente total no detector do ambiente.
   3. Imediatamente antes de iniciar as medições, determine a temperatura do ar ambiente e a umidade do ar (necessárias para análises posteriores). Em vez de tirar uma imagem térmica, grave um filme. A partir do filme, depois escolha o melhor quadro de imagem possível para análise para reduzir a possibilidade de perda de dados valiosos.
   4. Antes de iniciar a gravação, defina os seguintes parâmetros: a duração da gravação de vídeo em 10-15 s (ou qualquer outro valor desejado), a taxa de quadros em 5 fps (quadros por segundo) ou qualquer outro valor (em nossas mãos, 5 fps é o máximo necessário), e um local no disco onde o filme será salvo, conforme descrito abaixo.
      1. No software acima da janela principal da câmera, escolha o terceiro ícone à esquerda. No menu pop-up, escolha Editar configurações de registro, após o qual uma nova janela será aberta.
      2. No modo de gravação, selecione Gravar em disco e, abaixo disso, defina o Registro para esta duração no horário desejado. Nas opções de gravação da mesma janela, limite a taxa de gravação para 5 (Hz) e escolha o local onde as gravações serão salvas.
      3. Para definir a taxa de quadros, feche a janela existente, abra Editar no menu principal e selecione Preferências. Na parte direita da janela aberta, insira 5 em Target Frame Rate. Na mesma janela abaixo, selecione Tecla de atalho/Início remoto pode parar registro e, no menu suspenso, selecione No modo Iniciar/Parar.
         NOTA: Tente fazer os filmes mais curtos possíveis com a menor taxa de quadros possível, pois consome memória. Nessas configurações, um registro terá aproximadamente 100 Mb.
5. Posicione o participante de forma que a área supraclavicular do pescoço, acima da clavícula onde se localiza a MTD (Figura 1), esteja a uma distância focal de 1 m e grave um curta-metragem (10-15 s) a uma taxa de quadros de 5 fps pressionando a tecla F5 . A gravação será interrompida no horário designado.
6. Na sala no momento das medições, certifique-se de que apenas o participante e a pessoa que está realizando as medições estejam presentes. Evite o movimento do ar ou o correntes de ar (por exemplo, do ar condicionado). Certifique-se de que os participantes estejam longe da corrente de ar frio, da luz solar (direta ou indireta) ou de qualquer fonte de calor, como lâmpadas.
7. Se adequado, medir as concentrações de glicose no sangue capilar a partir da ponta do dedo com um glicosímetro padrão e a temperatura corporal usando um termômetro axilar.
8. Certifique-se de que todos os participantes comam a mesma refeição. Preste atenção às restrições e exigências alimentares dos indivíduos testados (por exemplo, a refeição para pacientes diabéticos). Todos os participantes, incluindo pessoas controle (saudáveis) e participantes com distúrbios metabólicos, devem comer a mesma refeição.
   NOTA: Para obter mais detalhes sobre as refeições que os pacientes diabéticos podem consumir, entre em contato com um endocrinologista local ou discuta com os participantes que sofrem de diabetes mellitus.
9. No momento desejado após uma refeição, faça a nova gravação pressionando F5 usando os mesmos valores de configuração. Não repita o protocolo definido para gravações. Repita as medidas em 30 min, 1 h, 2 h e 3 h após uma refeição¹². Para o seu desenho de estudo específico, o tempo após uma refeição pode ser mais curto ou mais longo, mas recomendamos pelo menos os três primeiros pontos de tempo.
   OBS: A limitação do número de participantes é de quatro a seis, mesmo que as medições sejam feitas rapidamente. Com um número maior de participantes, o tempo de atraso para alguns será muito longo.

2. Mensuração da ativação do tecido adiposo marrom após refeição em animais de laboratório

NOTA: Uma vez que os animais estão alojados num biotério com temperatura ambiente regulada e um ciclo dia/noite de 12 h/12 h, as experiências podem ser realizadas durante qualquer estação do ano. A temperatura ambiente durante os experimentos deve estar entre 22 °C e 27 °C. Neste estudo, seis fêmeas em diestro e seis machos selvagens C57Bl/6NCrl foram examinados.

1. Anestesiar os animais de acordo com as diretrizes éticas da instituição. Neste estudo, a anestesia foi realizada com injeções i.p. de ketamina/xilazina (80-100 mg/kg e 6-8 mg/kg, respectivamente). Aplique gel nos olhos em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea durante a anestesia. Raspar as regiões interescapulares dos animais de teste um dia antes dos experimentos (a região da pele entre as omoplatas) usando um pequeno aparador de animais.
2. Na véspera dos experimentos, também determinar a fase do ciclo estral em fêmeas.
   NOTA: A fase do ciclo estral é determinada por esfregaços vaginais.
   1. Mergulhe um cotonete em solução salina estéril à temperatura ambiente (NaCl a 0,9%) e insira-o na vagina. Raspe suavemente a parede vaginal com o cotonete, espalhe as células anexadas em uma lâmina de vidro e deixe secar ao ar.
   2. Coloque os animais de volta em suas gaiolas. Manchar as células com 500 μL de acetato de cresil violeta a 0,1% por 1 min, após o que lavá-las 3 vezes com água.
   3. Visualize as células sob um microscópio de luz com ampliação de 100x e iluminação de campo claro. Determinar a fase do ciclo estral com base no número de leucócitos e células epiteliais nucleadas e cornificadas observadas no esfregaço²⁵.
3. Retirar a ração dos animais na noite anterior aos experimentos (jejum noturno) com água ad libitum. A melhor maneira é transferir os animais para novas gaiolas limpas para evitar possíveis restos de comida nas gaiolas.
4. Na manhã do dia experimental, prepare a câmera térmica e as configurações de gravação como feito para testar os participantes humanos.
5. Não perturbe ou cause estresse aos animais antes de realizar medições de IR. Coloque cuidadosamente o animal em uma gaiola limpa (garante que não haja efeitos do cheiro de outros animais no sistema simpático do animal). Coloque a gaiola sob a câmera térmica a uma distância focal de 1 m. Grave um filme pressionando F5.
6. Pesar o pellet de alimento antes de dá-lo a cada animal para que a ingestão de alimentos possa ser calculada. Deixe o animal comer por 30 min em sua gaiola e pese o pellet de alimento novamente após a refeição. Neste estudo, as fêmeas consumiram 0,038 ± 0,004 g de ração/peso corporal.
   NOTA: Se você decidir medir as concentrações de glicose no sangue, execute as medições antes de uma refeição, mas após as medições de IR para garantir que isso não levará à ativação de BAT pelo sistema simpático.
7. Repetir as medidas de RI no horário desejado após o início da refeição (geralmente 30 min, 1 h e 2 h após a refeição)^17,26.
8. Depois que todos os experimentos forem concluídos, testar novamente a fase do ciclo estral em fêmeas conforme descrito acima (as fêmeas podem sair da fase desejada do ciclo estral mais cedo do que o previsto).

3. Análise dos registros térmicos

NOTA: O software da câmera térmica calcula a temperatura do objeto usando cinco variáveis.

1. Definir as seguintes variáveis no software antes da análise: emissividade da pele, e = 0,98^15,27, temperatura ambiente refletida (calculada a partir da imagem da folha de alumínio), temperatura do ar, umidade relativa^, distância ao objeto = 1 m. Realize a análise utilizando o software com esses valores.
   NOTA: A paleta de cores preferida é o arco-íris, uma vez que utiliza mais tonalidades, o que permite uma deteção mais fácil de MTD acima da clavícula.
2. Para cada filme, insira as variáveis listadas no software da câmera no lado direito da janela principal. Selecione o quadro adequado (imagem) do filme movendo a cabeça de reprodução na parte inferior da tela ou pressionando o botão Pausar .
3. Selecione a região de interesse (ROI) escolhendo a forma desejada da área no lado esquerdo da janela principal. Escolha a forma que melhor corresponde à área da pele acima ou entre as clavículas.
4. Quando o ROI é escolhido, as temperaturas mínima, máxima e média do ROI são exibidas no lado direito. Na imagem, o triângulo vermelho representa o ponto de temperatura máxima registrada, e o triângulo azul representa a temperatura mínima registrada. Repita esta etapa por vários quadros para ter certeza de que a temperatura medida é estável durante alguns segundos da gravação.
5. Subtrair as temperaturas máximas da área da pele acima das MTD antes de uma refeição das temperaturas máximas após uma refeição para determinar o aumento da atividade das MTD pós-prandiais em animais de laboratório.

Resultados

A maneira mais fácil de determinar a atividade das MTD é subtrair a temperatura máxima da pele acima das MTD antes e depois de uma refeição em seres humanos. Uma melhor maneira de calcular a atividade da MTD é selecionar duas regiões de interesse: a área da pele acima da MTD, que está localizada na área supraclavicular, e a área interclavicular da pele onde não há tecido MTD em humanos, designada como área de referência (de acordo com a PET-CT; Gráfico 1). A atividade MTD é ...

Discussão

Estudos recentes apresentam evidências crescentes sobre a regulação fisiológica e a importância da atividade das MTD em humanos e animais adultos no desenvolvimento da obesidade e diabetes mellitus. Além disso, a possível ativação de MTD por ativadores exógenos está se tornando um alvo para as empresas farmacêuticas. Para poder estimar a regulação fisiológica e a importância fisiopatológica das MTD em doenças muito onerosas, bem como descobrir uma potencial abordagem terapêutica, a termografia infraver...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% cresyl violet acetate	Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity	Kesterl	Kestrel 4200	Certificat of conformity
External data storage	Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides	Commonly used
Small cotton tip swab	Urethral swabs
Software for analysis	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR Tools
Software for meassurements	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	ResearchIR software	FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR T-1020