Инфракрасная термография для выявления изменений активности бурой жировой ткани

Измерение активности бурой жировой ткани (БАТ) с помощью позитронно-эмиссионной томографии, компьютерной томографии (ПЭТ-КТ) путем накопления ¹⁸F-фтордезоксиглюкозы (ФДГ) после еды или у пациентов с ожирением или диабетом не является методом выбора. Основная причина заключается в том, что ¹⁸F-FDG конкурирует с постпрандиальной высокой концентрацией глюкозы в плазме за тот же переносчик глюкозы на мембране клеток BAT. Кроме того, BAT также использует жирные кислоты в качестве источника энергии, который не виден при ПЭТ-КТ и может быть изменен вместе с концентрацией глюкозы у пациентов с ожирением и диабетом. Поэтому для оценки физиологической значимости НДТ у животных и человека применяется новый метод инфракрасной термографии, используемый в последних публикациях.

После ночного голодания активность BAT измерялась с помощью инфракрасной термографии до и после еды у добровольцев и самок мышей дикого типа. Программное обеспечение камеры вычисляет температуру объекта, используя расстояние от объекта, коэффициент излучения кожи, отраженную комнатную температуру, температуру воздуха и относительную влажность. У мышей выбритая область над НДТ была областью интереса, для которой измерялись средние и максимальные температуры. Фазу эстрального цикла у самок мышей определяли после эксперимента по мазкам влагалища, окрашенным раствором красителя крезильной фиалки (0,1%). У здоровых добровольцев были выбраны два участка кожи шеи: надключичная область (над ключицей, где присутствуют клетки БАТ) и межключичная область (между ключицами, где ткань БАТ не обнаружена). Активность BAT определяется вычитанием этих двух значений. Кроме того, средняя и максимальная температура участков кожи может быть определена у животных и людей.

Было показано, что изменения активности НДТ после еды, измеренные с помощью инфракрасной термографии, неинвазивного и более чувствительного метода, зависят от пола, возраста и фазы эстрального цикла у лабораторных животных. Также было доказано, что активация БАТ у людей в рамках термогенеза, вызванного диетой, зависит от пола, возраста и индекса массы тела. Дальнейшее определение патофизиологических изменений активности БАТ после еды будет иметь большое значение для участников с высокими концентрациями глюкозы в плазме (ожирение и сахарный диабет 2 типа), а также у разных лабораторных животных (нокаутированные мыши). Этот метод также является вариативным инструментом для определения возможных активирующих препаратов, которые могут омолодить активность БАТ.

Введение

Бурая жировая ткань (BAT), в отличие от белой жировой ткани (WAT), не накапливает, а тратит энергию. При симпатической стимуляции BAT использует жирные кислоты и глюкозу и выделяет тепло путем активации разъединяющего белка 1 (UCP1). Функция UCP1 состоит в том, чтобы использовать градиент H⁺ между двумя митохондриальными мембранами для производства тепла вместо АТФ. Функция НДТ заключается в увеличении выработки тепла в холодных условиях, что приводит к увеличению расхода энергии¹. После воздействия холода сенсорные входы от кожи ингибируют чувствительные к теплу нейроны в срединном преоптическом (MnPO) ядре гипоталамической преоптической области (POA), что уменьшает ингибирующее действие нейронов POA на ростральный бледный раф (rRPa). Активация нейронов rRPa повышает симпатическую активность, что сопровождается повышением активности BAT ^2,3. Индуцированная холодом активация BAT улучшает чувствительность к инсулину у людей⁴, и эта активность снижается у людей с повышенным индексом массы тела (ИМТ) и возрастом 1,5,6,7.

Помимо его роли в термогенезе, вызванном холодом, после еды поглощение глюкозы в НДТ увеличивается у худого мужского населения, способствуя индуцированному диетой термогенезу (DIT), который выше у BAT-положительных мужчин ^8,9. Современным методом, используемым для измерения активности БАТ, является позитронно-эмиссионная томография, компьютерная томография, известная как ПЭТ-КТ. Этот метод определяет активность БАТ путем измерения накопления радиоактивного индикатора фтордезоксиглюкозы (¹⁸F-FDG). Тем не менее, ПЭТ-КТ терпит неудачу в качестве метода выбора для обнаружения активации БАТ после еды. Одна из причин заключается в том, что после еды ¹⁸F-FDG конкурирует с постпрандиальной гипергликемией за один и тот же переносчик глюкозы, что делает его непригодным для определения активации BAT после еды, особенно при сравнении активности BAT у здоровых участников и участников с диабетом с возможными различиями в концентрациях глюкозы в крови. Кроме того, BAT использует жирные кислоты в качестве источника энергии для производства тепла, что не видно при ПЭТ-КТ. ¹⁸ См. Накопление F-ФДГ в НДТ после еды едва заметно¹⁰ и, следовательно, в большинстве случаев интерпретируется как отрицательный результат. Неудивительно, что недавно было высказано предположение, что активация BAT более выражена в человеческой популяции, чем мы думали ранее; Поэтому необходим новый подход к выявлению активности БАТ и ее участия в метаболических^{нарушениях7}. Попытка решить эту проблему заключается в измерении объема БАТ с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) у пациентов с преддиабетом и пациентов с сахарным диабетом 2 типа (СД2) с инсулинорезистентностью¹¹. Однако объем НИМ, измеренный с помощью МРТ, не является достаточным показателем для оценки повседневной функции и использования глюкозы и жирных кислот с помощью BAT. Таким образом, для оценки реальных различий в активности БАТ у здоровых пациентов с СД2 необходим новый подход, позволяющий выяснить патологический механизм нарушения БАТ у пациентов с СД2.

Для определения активации НДТ были проведены измерения теплопродукции НДТ до и после еды с помощью инфракрасной (ИК) термографии (рис. 1)^12,13. Установление ИК-термографии в качестве метода выбора для измерения активности НДТ после еды у здоровых людей и людей с ожирением или пациентов с сахарным диабетом окажет огромное влияние на эту область. По сей день ИК-термография используется для определения холодоиндуцированной активации BAT^13,14,15. В новейшей истории человечества активность БАТ, вызванная холодом, уже не очень выражена (из-за правильного обогрева среды обитания, правильной одежды), в то время как активация БАТ после еды происходит каждый день. Кроме того, физиологическая регуляция этих двух функций BAT через гипоталамус совершенно разная. После еды активация нейронов, экспрессирующих проопиомеланокортин (POMC), в дугообразном ядре гипоталамуса (Arc) приводит к увеличению активности симпатического нерва через rRPa¹⁶. Индуцированная холодом активация НДТ, измеренная с помощью ИК-термографии или ПЭТ-КТ, ненадлежащая при использовании в качестве меры для повседневной активности НДТ. Повышенная активность БАТ после еды сопровождается утилизацией глюкозы, что в конечном итоге важно для поддержания гомеостаза глюкозы, чувствительности к инсулину и ежедневной регуляции концентрации глюкозы. Постпрандиальная активация БАТ приводит к увеличению постпрандиального потребления глюкозы с последующим увеличением теплопродукции и температуры тела (ДИТ). Было показано, что это зависит от пола, возраста и ИМТ¹². Сходные гендерные различия в активации БАТ после еды наблюдаются у самцов и самок лабораторных мышей¹⁷. Эти результаты соответствуют недавно обнаруженным гендерным различиям в регуляции БАТ Берком и др., которые показали, что гипоталамическая регуляция потемнения БАТ через субпопуляцию нейронов POMC различается у самцов и самок мышей¹⁸. Постпрандиальная активация BAT меньше у женщин, пожилых людей и людей с ожирением. Отсутствие активации БАТ после еды (снижение утилизации глюкозы) может привести к более высокой распространенности нарушения толерантности к глюкозе у женщин 19,20,21,22. К сожалению, большинство исследований по активации БАТ были проведены только на мужчинах. Активируя BAT после еды, усвоение глюкозы увеличивается у худого мужского населения. Неудивительно, что после активации BAT DIT выше у BAT-положительных субъектов^{мужского} пола ^8,9. Кроме того, трансплантация БАТ у мышей-самцов улучшает толерантность к глюкозе, повышает чувствительность к инсулину и снижает массу тела и жировую массу²³.

ПЭТ-КТ не является методом выбора для измерения активности ВАТ, особенно после еды. Поэтому был разработан неинвазивный и более чувствительный метод. ИК-термография позволяет оценить активность БАТ у различных лабораторных животных (нокаутных мышей), а также у людей, независимо от пола, возраста или влияния различных патологических состояний на активность БАТ. Дополнительным преимуществом этого метода является простота для участников и лабораторных животных, что позволяет оценить потенциальную пользу бустерной терапии БАТ. Недавние исследования с использованием ИК-термографии для определения физиологического поведения НДТ после воздействия холода или еды описаны в недавней публикации Brasil et ^al.24.

протокол

Все экспериментальные процедуры на лабораторных животных были одобрены Национальным этическим комитетом и Министерством сельского хозяйства (EP 185/2018). Эксперименты проводились в соответствии с Этическим кодексом Хорватского общества лабораторных животных и руководящими принципами ARRIVE. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием людей, соответствовали Хельсинкской декларации и были одобрены Комитетом по этике медицинского факультета Загребского университета (UP/I-322-01/18-01/56). В этом исследовании мы представляем результаты трех участниц женского пола (ИМТ: 29 кг/м2 ± 5 кг/^м2). Информированное согласие было получено от всех добровольцев на их участие в исследовании и на представление данных.

1. Измерение активации бурой жировой ткани после еды у человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите эксперименты в летнее время, когда дневная температура не ниже 22 ° C, чтобы поддерживать базальную активность BAT как можно ниже.

Тщательно выбирайте контрольных здоровых участников (если активность БАТ должна оцениваться при патологических состояниях), так как активность БАТ зависит от пола, возраста, ИМТ и даже фазы эстрального цикла.
1. Чтобы оценить фазу менструального цикла участниц женского пола, задайте им вопросы о продолжительности их среднего менструального цикла и дате первого дня последней менструации. Не забудьте отметить дату проведения экспериментов.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Правильный отбор подходящих контрольных субъектов является самой сложной частью клинических исследований, поскольку здоровые люди и участники с патологическими состояниями должны быть как можно более похожими и отличаться только исследуемым заболеванием.
Попросите участников хорошо отдохнуть, не завтракать (натощак - без потребления калорий), собираться в утренние часы для экспериментов и отдыхать не менее 30 минут, чтобы избежать возможной активации БАТ во время мышечной активности через симпатическую активацию.
Попросите участников снять верхнюю одежду за 15 минут до измерения, чтобы избежать возможных эффектов нагревания поверхности кожи (тепловых эффектов одежды) при определении исходной активности BAT. Проводите измерения при соответствующей комнатной температуре (22-27 °C).
Выполняйте инфракрасные измерения.
1. Пока участники отдыхают, установите тепловизионную камеру (тип детектора: неохлаждаемый микроболометр; шаг детектора: 17 мкм; спектральный диапазон камеры: 7,5-14,0 мкм; тепловая чувствительность: 20 мК при 30 °C; объективы: 36 мм; разрешение: 1024 x 768 пикселей; мгновенное поле зрения [IFOV]: 0,47 мрад) на штативе и расположите его на расстоянии 1 м от места, где будет сидеть участник.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Если измерения проводятся в более холодную погоду (температура наружного воздуха ниже 15 °C при влажности 50%), поместите камеру при комнатной температуре и включите ее не менее чем на 1 час перед выполнением измерений. Холодные приборы могут давать разные результаты после прогрева до комнатной температуры из-за автокалибровки.
2. Подключите тепловизионную камеру к компьютеру и программному обеспечению в соответствии с инструкциями производителя. Запишите алюминиевую фольгу (смятую, затем растянутую алюминиевую фольгу) на фокусном расстоянии 1 м, чтобы определить отраженную температуру помещения, представленную в виде измеренной температуры. В программном обеспечении камеры введите расстояние 0 м и коэффициент излучения 1.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Отраженная кажущаяся температура - это параметр, полученный, когда излучательная способность камеры установлена на 1,0 и расстояние до 0 м, а измерения проводятся на смятой, а затем растянутой алюминиевой фольге. Отраженная кажущаяся температура представляет собой приближение к общему падающему на детектор инфракрасному излучению из окружающей среды.
3. Непосредственно перед началом измерений определите температуру воздуха в помещении и влажность воздуха (необходимые для последующего анализа). Вместо того, чтобы делать одно тепловизионное изображение, запишите видео. Из фильма позже выберите наилучший кадр изображения для анализа, чтобы уменьшить вероятность потери ценных данных.
4. Перед началом записи установите следующие параметры: продолжительность записи видео в 10-15 с (или любое другое желаемое значение), частоту кадров в 5 к/с (кадров в секунду) или любое другое значение (в наших руках 5 к/с — это максимально необходимое), а также место на диске, куда будет сохранен фильм, как описано ниже.
  1. В программном обеспечении над окном основной камеры выберите третий значок слева. Во всплывающем меню выберите «Изменить настройки записи», после чего откроется новое окно.
  2. В режиме записи выберите «Запись на диск», а ниже установите « Запись на эту продолжительность » в нужное время. В параметрах записи того же окна ограничьте частоту записи до 5 (Гц) и выберите место, где будут сохранены записи.
  3. Чтобы установить частоту кадров, закройте существующее окно, откройте «Правка » в главном меню и выберите «Настройки». В правой части открывшегося окна введите 5 в поле Target Frame Rate. В том же окне ниже выберите « Горячая клавиша/Дистанционный запуск может остановить запись» и в раскрывающемся меню выберите « В режиме «Пуск/Остановка».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь делать как можно более короткие фильмы с минимально возможной частотой кадров, так как это отнимает много памяти. При таких настройках одна запись будет иметь примерно 100 Мб.
Расположите участника так, чтобы надключичная область шеи, над ключицей, где находится БАТ (рис. 1), находилась на фокусном расстоянии 1 м, и запишите короткий видеоролик (10-15 с) с частотой кадров 5 кадров в секунду, нажав клавишу F5. Запись будет остановлена в назначенное время.
Во время измерений в комнате должны присутствовать только участник и лицо, выполняющее измерения. Избегайте движения воздуха или сквозняка (например, от кондиционера). Убедитесь, что участники находятся вдали от холодного сквозняка, солнечного света (прямого или косвенного) или любого источника тепла, такого как лампочки.
При необходимости измерьте концентрацию глюкозы в капиллярной крови от кончика пальца стандартным глюкометром и температуру тела с помощью подмышечного термометра.
Убедитесь, что все участники едят одну и ту же еду. Обратите внимание на пищевые ограничения и требования испытуемых (например, питание для больных сахарным диабетом). Все участники, включая контрольных (здоровых) людей и участников с нарушениями обмена веществ, должны есть один и тот же прием пищи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более подробной информации о блюдах, которые могут употреблять больные сахарным диабетом, обратитесь к местному эндокринологу или обсудите это с участниками, страдающими сахарным диабетом.
В нужное время после еды сделайте новую запись, нажав F5 , используя те же значения настройки. Не повторяйте установленный протокол для записей. Повторите измерения через 30 мин, 1 ч, 2 ч и 3 ч после еды¹². Для вашего конкретного дизайна исследования время после еды может быть короче или длиннее, но мы рекомендуем, по крайней мере, первые три временных момента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничение на количество участников составляет от четырех до шести, несмотря на то, что измерения выполняются быстро. При большем количестве участников время задержки для некоторых будет слишком большим.

2. Измерение активации бурой жировой ткани после еды у лабораторных животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку животные содержатся в помещении для животных с регулируемой комнатной температурой и циклом день/ночь 12 часов / 12 часов, эксперименты могут проводиться в любое время года. Температура в помещении во время экспериментов должна быть от 22 °C до 27 °C. В этом исследовании были обследованы шесть самок животных диэструса и шесть самцов животных дикого типа (WT) C57Bl/6NCrl.

Обезболивайте животных в соответствии с этическими принципами учреждения. В этом исследовании анестезию проводили с использованием внутримышечного введения кетамина/ксилазина (80-100 мг/кг и 6-8 мг/кг соответственно). Нанесите гель для глаз на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время анестезии. За сутки до экспериментов побрейте межлопаточные области испытуемых животных (область кожи между лопатками) с помощью триммера для мелких животных.
За день до экспериментов также определяют фазу эстрального цикла у самок животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза эстрального цикла определяется по мазкам из влагалища.
1. Окуните ватный тампон в стерильный физиологический раствор комнатной температуры (0,9% NaCl) и введите его во влагалище. Аккуратно соскребите стенку влагалища тампоном, распределите прикрепленные клетки по предметному стеклу и дайте ему высохнуть на воздухе.
2. Посадите животных обратно в клетки. Покрасьте клетки 500 мкл 0,1% крезила фиолетового ацетата в течение 1 мин, после чего промойте их 3 раза водой.
3. Просматривайте клетки под световым микроскопом со 100-кратным увеличением и яркой подсветкой. Определяют фазу эстрального цикла на основании количества лейкоцитов и ядерных и ороговевших эпителиальных клеток, наблюдаемых в мазке²⁵.
Убирайте корм животных вечером перед экспериментами (голодание в течение ночи) водой ad libitum. Лучше всего пересаживать животных в новые чистые клетки, чтобы избежать возможных остатков пищи в клетках.
Утром в день эксперимента подготовьте тепловизионную камеру и настройки записи, как это было сделано для тестирования участников-людей.
Не беспокойте и не причиняйте стресс животным перед выполнением ИК-измерений. Осторожно поместите животное в чистую клетку (убедитесь, что запах других животных не влияет на симпатическую систему животного). Поместите клетку под тепловизионную камеру на фокусном расстоянии 1 м. Запишите видео, нажав клавишу F5.
Взвесьте гранулы корма, прежде чем давать их каждому животному, чтобы можно было рассчитать потребление пищи. Дайте животному поесть в течение 30 минут в клетке и снова взвесьте пищевые гранулы после еды. В этом исследовании самки животных съедали 0,038 ± 0,004 г пищи на массу тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы решили измерить концентрацию глюкозы в крови, выполняйте измерения перед едой, но после ИК-измерений, чтобы убедиться, что это не приведет к активации BAT симпатической системой.
Повторите ИК-измерения в нужное время после начала приема пищи (обычно через 30 мин, через 1 ч и через 2 ч после еды)^17,26.
После того, как все эксперименты завершены, снова проверьте фазу эстрального цикла у самок животных, как описано выше (самки животных могут выйти из желаемой фазы эстрального цикла раньше, чем ожидалось).

3. Анализ тепловых записей

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение тепловизионной камеры вычисляет температуру объекта, используя пять переменных.

Перед анализом задайте в программном обеспечении следующие переменные: коэффициент излучения кожи, e = 0,98^15,27, отраженная температура в помещении (рассчитанная по изображению алюминиевой фольги), температура воздуха^, относительная влажность, расстояние до объекта = 1 м. Выполните анализ с помощью программного обеспечения с этими значениями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительной цветовой палитрой является радуга, так как в ней используется больше оттенков, что позволяет легче обнаружить НДТ над ключицей.
Для каждого фильма введите перечисленные переменные в программное обеспечение камеры в правой части главного окна. Выберите подходящий кадр (изображение) из фильма, перемещая головку воспроизведения в нижней части экрана или нажимая кнопку «Пауза ».
Выберите интересующую область (ROI), выбрав желаемую форму области в левой части главного окна. Выберите форму, которая лучше всего соответствует участку кожи над ключицами или между ними.
При выборе ROI минимальная, максимальная и средняя температуры ROI отображаются с правой стороны. На изображении красный треугольник представляет точку максимальной зарегистрированной температуры, а синий треугольник представляет минимальную зарегистрированную температуру. Повторите этот шаг в течение нескольких кадров, чтобы убедиться, что измеренная температура стабильна в течение нескольких секунд записи.
Вычтите максимальные температуры участка кожи выше БАТ до еды из максимальных температур после еды, чтобы определить увеличение постпрандиальной активности БАТ у лабораторных животных.

Результаты

Самый простой способ определить активность БАТ - это вычесть максимальную температуру кожи выше БАТ до и после еды у людей. Лучшим способом расчета активности НДТ является выбор двух областей интереса: участка кожи над БАТ, который расположен в надключичной области, и межключичного уча...

Обсуждение

Недавние исследования представляют растущие данные о физиологической регуляции и важности активности НДТ у взрослых людей и животных в развитии ожирения и сахарного диабета. Кроме того, возможная активация НДТ экзогенными активаторами становится мишенью для фармацевтических компан...

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Это исследование финансировалось исследовательским грантом Хорватского научного фонда (IP-2018-01-7416).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% cresyl violet acetate	Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity	Kesterl	Kestrel 4200	Certificat of conformity
External data storage	Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides	Commonly used
Small cotton tip swab	Urethral swabs
Software for analysis	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR Tools
Software for meassurements	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	ResearchIR software	FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR T-1020