Estabelecimento do Modelo de Síndrome do Cordão Central em Camundongos C57BL/6J

Resumo

O presente protocolo simulando a síndrome da medula central (SCC) em camundongos melhorou a repetibilidade e minimizou os danos operacionais aos animais experimentais, evitando a ruptura excessiva da estrutura anatômica. A estratégia deste estudo é vantajosa, pois permite a pesquisa dos mecanismos de lesão ao produzir resultados consistentes.

Resumo

Modelos animais de síndrome da medula central (SCC) poderiam beneficiar substancialmente a pesquisa pré-clínica. Vias anatômicas identificáveis podem fornecer abordagens de exposição minimamente invasivas e reduzir lesões extras em animais experimentais durante a operação, permitindo a manutenção de uma morfologia anatômica consistente e estável durante os experimentos para minimizar as diferenças comportamentais e histológicas entre os indivíduos para melhorar a reprodutibilidade dos experimentos. Neste estudo, a medula espinhal nível C6 foi exposta usando uma plataforma coaxial de lesão medular (SCICP) e combinada com uma técnica minimamente invasiva. Com o auxílio de um estabilizador vertebral, fixamos as vértebras e comprimimos a medula espinhal de camundongos C57BL/6J com pesos de 5 g/mm² e 10 g/mm² com SCICP para induzir diferentes graus de lesão medular C6. Em consonância com a descrição anterior do SCC, os resultados revelam que a lesão neste modelo está concentrada na substância cinzenta ao redor do cordão central, possibilitando novas pesquisas sobre o SCC. Finalmente, os resultados histológicos são fornecidos como referência para os leitores.

Introdução

Nos últimos anos, tem-se assistido a um aumento constante da incidência de lesão medular (LM), com mais lesões em idosos de tauma menos violenta¹. Essas lesões acometem mais frequentemente a coluna cervical e mais frequentemente levam a uma disfunção neurológica^incompleta2.

No século XXI, o SCC é o tipo mais prevalente de LM incompleta, correspondendo a mais da metade de toda a LME. Em comparação com a LM incompleta convencional, a SCC é caracterizada por um comprometimento desproporcionalmente maior dos membros superiores do que^inferiores3. Caracteriza-se por fraqueza predominantemente dos membros superiores, com disfunção sensitiva e vesical menos significativa. Acredita-se que a SCC seja causada por hemorragia e edema pós-traumático da região central ou, como proposto recentemente, por degeneração walleriana por compressão da medula espinhal na estenose do canal vertebral. O manejo da SCC carece de evidências de alto nível para orientar, o que requer uma compreensão abrangente de sua fisiopatologia⁴. No entanto, modelos de SCC não foram relatados. Modelos animais adequados são essenciais para o entendimento da fisiopatologia, o que pode fornecer uma base de pesquisa para estudos clínicos e pré-clínicos5,6,7,8,9,10.

Neste estudo, um modelo de SCC em camundongos é estabelecido com uma plataforma coaxial de lesão medular (SCICP) e um plano de operação minimamente invasivo, o que permite novas pesquisas e compreensão do SCC. O modelo é comprovado como válido no decorrer do processo de pesquisa por análise histológica, ressonância magnética (RM) e imunofluorescência.

Protocolo

Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar Animal de Laboratório da Faculdade de Medicina Cheeloo da Universidade de Shandong (número de aprovação: 22021). Eles foram realizados de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publicado pelo National Institutes of Health (NIH Publications No. 85-23, revisado em 1996). Todos os camundongos utilizados neste estudo foram fêmeas C57BL/6J de 9-10 semanas de idade compradas da Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, China). Um total de 9 camundongos envolvidos neste estudo foram igualmente randomizados para os grupos controle, leve e grave. Aos 7, 28 e 70 dias pós-lesão, um camundongo de cada grupo foi sacrificado.

1. Laminectomia C6 e exposição da medula espinhal

OBS: A exposição foi realizada ao microscópio. O sangramento pode ser evitado prestando atenção a dois aspectos: (i) Todos os vasos sanguíneos devem ser evitados. (ii) Os músculos precisam ser separados nos pontos de origem e terminação do músculo.

1. Preparar instrumentos cirúrgicos e SCICP.
   NOTA: A estrutura do SCICP foi relatada em estudo anterior¹¹. A diferença em relação ao estudo anterior é que o presente protocolo realiza a lesão medular por compressão. Dois pesos diferentes (10,4 g e 20,8 g) dessa plataforma podem produzir compressão de 5 g/^mm2 e 10 g/^mm2, respectivamente (Figura 1). As etapas de exposição e compressão medular são mostradas na Figura 2.
2. Administrar isoflurano no camundongo por inalação usando um cone nasal (indução: 3%-5%, manutenção: 1,5%-2%).
3. Após a anestesia fazer efeito, explore uma pequena protuberância na linha média atrás do pescoço de camundongos, que é o processo espinhoso da segunda vértebra torácica (T2).
4. Raspe o cabelo ao redor dessa protuberância. Desinfetar a pele com três aplicações alternadas de uma solução de iodóforo seguida de antissépticos cutâneos etanol a 75%.
5. Posicione o mouse de bruços na mesa de operação. Aplique pomada ocular para proteger os olhos.
6. Coloque um coxim de 3-4 mm de espessura sob o tórax para permitir uma curva arqueada da coluna cervical, facilitando a exposição do espaço interlamina e uma via aérea desobstruída durante a operação. Injetar buprenorfina como analgesia pré-operatória (0,05-0,1 mg/kg, SQ).
7. Realizar incisão longitudinal de 1 a 1,5 cm com bisturi estéril centrado na^2ª vértebra torácica processo espinhoso para exposição da camada fascial (Figura 2A).
8. Remover uma porção do tecido adiposo acima de T2 com microtesoura estéril para encontrar o processo espinhoso de T2.
9. Separar os músculos trapézio bilateral e romboide de C5-T2 ao longo da linha média com microtesoura (Figura 2B).
10. Separe os músculos da lâmina das vértebras C5-T2 com microtesouras e retraia a camada muscular para os lados com micro-afastadores estéreis (Figura 2C).
11. Corte os multífidos e os músculos da coluna cervical na superfície das vértebras.
12. Localize T2 de acordo com o ponto mais alto dos processos espinhosos. Sondar os processos espinhosos sucessivamente em direção à extremidade rostral de T2 para localizar C6 (Figura 3).
13. Levante a lâmina de C6 com pinças, corte a lâmina e a medula espinhal fica exposta (Figura 2D).

2. Lesão por compressão da medula cervical

1. Apertar as facetas articulares de C6-7 com o estabilizador vertebral e bloqueá-lo (Figura 2E).
2. Apontar a ponta de peso estéril para a medula espinhal exposta e garantir que o fundo plano da ponta esteja posicionado paralelo à superfície dorsal da medula espinhal (Figura 2F).
3. Ajuste a manga para fazer o peso comprimir a medula espinhal. Parar de ajustar quando o peso mantiver uma posição relativa constante com a medula espinhal (Figura 2G).
   NOTA: Não torne este processo muito violento ou rápido caso o peso exerça força de contusão na medula espinhal.
4. Retirar o peso e o estabilizador vertebral após 5 min de compressão.
5. Observe as alterações de cor da medula espinhal após a compressão ao microscópio (Figura 2H).
6. Enxágue com PBS estéril e use sucção para limpar o local da operação.
7. Sutura dos músculos e da pele por planos com fio inabsorvível de polipropileno (tamanho: 6-0).
8. Desinfete a área cirúrgica, coloque o mouse em uma almofada quente até que o mouse restaure a consciência total e, em seguida, devolva o mouse à gaiola do mouse.
9. Injetar buprenorfina para analgesia (0,05-0,1 mg/kg, SQ) a cada 8-12 h por 3 dias.

3. Análise histológica

1. Anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal de tribromoetanol a 1,25% (0,02 mL/g de peso corporal) nos dias 7, 28 ou 70 após a lesão. Infundir transcardialmente o camundongo com 60 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 20 mL de paraformaldeído a 4%¹¹.
2. Transeccionar a medula espinhal a 0,5 cm do centro da lesão de ambos os lados com microtesoura e preservar o corte de 1 cm de comprimento.
3. Imergir o corte preservado da medula espinhal em sacarose a 30% a 4 °C por 48 h.
4. Incorpore os tecidos com OCT, corte os tecidos em cortes de 6 μm de espessura com um criótomo e colete os cortes em uma lâmina de vidro.
5. Coloração para hematoxilina e eosina
   1. Lave as seções de 6 μm com 1x PBS por 5 min 3 vezes para remover o OCT residual.
   2. Imergir os cortes em hematoxilina por 90 s. Lave as seções em água corrente por 3 min.
   3. Mergulhe as seções em eosina por 4 min. Mergulhe em álcool 95% por 30 s para remover o excesso de eosina.
   4. Por fim, desidrate as lâminas com álcool (álcool 95% e álcool 100% duas vezes, sucessivamente) por 30 s e coloque as lâminas em banho de xileno para limpeza por 2 min. Em seguida, sele as seções com uma tampa de vidro e gel de resina.
6. Coloração azul da Prússia
   1. Submergir as lâminas por 20 min em uma mistura igual de ferrocianeto de potássio (10%) e ácido clorídrico (10%).
   2. Enxaguar 3 vezes com água destilada e contramanchar por 5 min com Nuclear Fast Red.
   3. Enxaguar três vezes com água destilada, seguido de um enxágue com álcool a 95% e dois enxágües com álcool a 100% por 5 min.
   4. Limpe as seções em xileno duas vezes por 3 min cada e depois sele com gel de resina¹².
7. Coloração por imunofluorescência
   1. Incubar as lâminas com os seguintes anticorpos primários por 1 h a 37 °C: molécula 1 (Iba-1) (Iba-1) (1:500), que foi regulada para cima na micróglia após lesão nervosa; proteína ácida fibrilar fibrilar (GFAP) de camundongo (1:300), que é expressa em astrócitos no sistema nervoso central; coelho anti-neurofilamento-200 (NF-200) (1:2000), que é expresso em neurofilamento.
   2. Incubar com anticorpos secundários por 1 h à temperatura ambiente (TR): Alexa Fluor488 cabra anti-camundongo e Alexa Fluor594 cabra anti-coelho (1:1.000).
   3. Tire fotografias e analise com microscópio de fluorescência¹³.

4. Ressonância magnética

1. Anestesiar o camundongo 7 dias após a lesão com anestesia com isoflurano (1%-2% isoflurano, 20%-30%_O2) administrado através de uma mini máscara.
2. Escanear a medula cervical em orientação sagital. Use as seguintes configurações para imagens de RM: sequência spin-echo (SE) em multislice e intercalada com TR/TE = 2500/12 ms, matriz de aquisição =256 x 128 matriz sobre o campo de visão (FOV) = 12 x 8 mm², espessura de corte = 1 mm e número de excitações (NEX) = 2.
   NOTA: Mantenha a taxa de respiração do mouse em 10-15/min durante a varredura para eliminar artefatos de imagem relacionados à respiração¹⁴.

Resultados

A seção HE sagital sugere que, embora a área lesada na substância cinzenta fosse mais larga no grupo severo, a continuidade sobre a substância branca estava presente. Além disso, a diferença na área de substância cinzenta lesada entre os grupos severo e leve corrobora a razoabilidade do grupo definido no protocolo (Figura 4).

Os cortes coronais de HE mostram que a lesão existe principalmente na substância cinzenta em ambos os grupos. No grupo severo, a estrutura da substância branca ao redor da substância cinzenta teve maior probabilidade de ser impactada, mas o contorno da substância branca ainda foi mantido (Figura 5). A imunofluorescência com NF-200 sugere que, embora a substância branca ao redor da substância cinzenta tenha sido afetada no grupo grave, a substância branca ainda estava relativamente intacta. Esses resultados são consistentes com as características descritas para o ECC no estudo anterior⁴ (Figura 6).

Não foram encontradas hemácias nos cortes sagitais de HE 7 dias após a lesão, tanto no grupo leve quanto no grave. A coloração azul da Prússia não revelou hemossiderose no grupo leve, mas no grupo grave. Esses resultados indicam que a indução de hemorragia pode exigir um grau relativamente grave de dano (Figura 7).

A imunofluorescência revelou áreas de elevação da expressão de GFAP e Iba-1 tanto na lesão leve quanto na grave, sugerindo resposta inflamatória e formação de cicatriz glial na lesão. Além disso, o grupo grave apresentou maior área de lesão do que o grupo leve (Figura 8).

A RM é um método relativamente minimamente invasivo para observar a medula espinhal. Os resultados sugerem que, tanto no grupo leve quanto no grave, há alteração de sinal hipointenso na lesão com alto sinal. O grupo grave apresentou área de hipossinal significativamente maior (Figura 9). O sinal hipointenso sugere um precipitado do lisado de reticulócitos nesta área, e o hipersinal circundante sugere uma resposta inflamatória. Realizamos vários testes comportamentais em nosso estudo anterior. Por exemplo, o teste de força de preensão manual nos membros torácicos revela diferença^{significativa15}.

Figura 1: Manga e pesos do SCICP. A área de superfície da ponta foi projetada para ser de 1,3 mm x 1,6 mm com base na área exposta da medula espinhal medida após a laminectomia de C6. O peso é revestido com PTFE, o que reduz efetivamente o atrito entre a parede interna da manga e o peso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exposição e compressão da medula espinhal. (A) Incisão longitudinal da pele; (B) Separar os músculos rostralmente do processo espinhoso de T2; (C) Separe os músculos acima das lâminas; (D) laminectomia C6; (E) Fixação do corpo vertebral; (F) Determinar o local da compressão; (G) Compressão da medula espinhal; (H) Nenhum dano significativo à substância branca acima da medula espinhal após a compressão da medula espinhal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Anatomia do esqueleto cervical de camundongos. O local indicado pela seta é o processo espinhoso T2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Cortes sagitais corados pela HE. (A) Corte sagital da medula espinhal cervical. (B,C) O grupo Grave teve danos mais graves do que o grupo Leve, mas ambos se concentraram na substância cinzenta ao redor do cordão central. As imagens de 7, 28 e 70 dpi sugerem que não há diferença significativa na expressão da lesão no mesmo grupo de lesão em períodos diferentes e que a continuidade da substância branca na medula espinhal superior e inferior é mantida. Barra de escala: 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Cortes corados coronais com HE da lesão medular cervical. (A-C) A lesão afeta principalmente a substância cinzenta ao redor do cordão central, como visto nos painéis B e C. O grupo de lesão grave sofre de uma gama mais extensa de danos do que o grupo de lesões leves, que é mais provável de afetar a substância branca. Barra de escala: 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Imunofluorescência coronal do NF-200 após lesão. Resposta ao NF-200 sem diferença significativa no contorno da substância branca. Barra de escala: 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Coloração azul da Prússia. (A-C) Hemossiderose foi observada no grupo grave, mas não no grupo leve. Barra de escala: 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: GFAP sagital e imunofluorescência Iba-1 após lesão. (A-C) À medida que o grau de lesão aumenta, a área de resposta GFAP e Iba-1 aumenta. Barra de escala: 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: RM sagital após lesão medular cervical (imagens ponderadas em T2). A região da lesão foi observada como hipossinal nos grupos lesão leve e grave, com área de hipossinal significativamente maior no grupo lesão grave. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Dos inúmeros tipos de lesão medular, o SCC é um dos tipos de lesão mais potencialmente tratáveis ^3,4. Devido à falta de modelos de pesquisa laboratorial, as pesquisas sobre SCC a partir da década de 1950 concentraram-se em estudos clínicos e investigações de dissecção cadavérica ^3,16,17. O presente estudo mostra o uso de ferramentas compatíveis e procedimentos minimamente invasivos para estabelecer o modelo de CCS em camundongos. Do ponto de vista técnico, esta plataforma tem forte operacionalidade e boa reprodutibilidade. Dado que os resultados do experimento demonstram a validade, nossa técnica para estabelecer o modelo mais próximo do padrão que estudos anteriores definiram para o CCS⁴.

Estudos prévios de lesão por compressão empregaram principalmente clipes de aneurisma, balões e pinças calibradas ^9,10,18. Além disso, a maioria das lesões ocorreu ao nível da medula^torácica18. A medula espinhal no nível de C6 foi escolhida como segmento lesado neste estudo para investigar as características do SCC. Vale a atenção que a taxa de sobrevivência do modelo CCS também é um fator essencial para garantir a consistência experimental. O presente estudo relata causar lesão por compressão bilateral na medula cervical de camundongos, enquanto lesão traumática medular de alto nível, especialmente lesão bilateral, pode ser fatal para animais de experimento se muito grave. Segundo El-Bohy, a medula espinhal C4/5 tem maior probabilidade de afetar o trato bulboespinhal descendente e os motoneurônios relacionados à respiração, o que leva os animais de experimento à depressão respiratória e à morte 18,19,20,21,22,23., Neste estudo, camundongos com diferentes graus de compressão sobre a medula espinhal cervical C6 apresentam características de lesão significativamente diferenciadas sugeridas por testes histológicos. Embora houvesse diferenças comportamentais e histológicas significativas no modelo de pinçamento medular cervical de camundongos relatado por Forgione, a ruptura dos pedículos, processos articulares, lâminas e até raízes nervosas foi necessária para pinçar a medula espinhal com as pinças modificadas, o que teve uma influência significativa na estabilidade das estruturas cervicais²⁴. Outro estudo de lesões cervicais relatou a utilização do processo transverso como local de fixação⁵. Embora os processos articulares tenham sido impedidos de danos, a ruptura do tecido muscular excessivo também poderia levar a um impacto na estabilidade da medula espinhal. No presente estudo, apenas a^6ª lâmina cervical foi ressecada para manter a estabilidade da medula cervical, com as articulações adjacentes preservadas e dano muscular excessivo evitado. Ao mesmo tempo, a compressão de cima da medula espinhal evita danos às raízes nervosas.

Os resultados de HE sugerem que a área de dano à medula cervical dos camundongos em cada grupo foi principalmente na substância cinzenta próxima à medula central, o que caracterizou o SCC, com diferenças significativas na abrangência da lesão entre os diferentes grupos. Notavelmente, os cortes patológicos que exibimos podem ter aliviado a manifestação da lesão, pois os espécimes foram coletados alguns dias após a lesão. A imunofluorescência (NF-200) mostrou menor dano ao trato neural na região da substância branca da medula espinhal, o que também confirmou que o dano no SCC estava concentrado principalmente ao redor da medula central. O resultado da imunofluorescência foi agravado por resultados histológicos prévios da patologia. Estudos prévios demonstraram que o SCC leva ao edema próximo à medula central, levando a hematoma e, finalmente, disfunção na porção medial do trato corticoespinhal lateral³. A hemorragia tem sido relatada como um componente típico do SCC, mas raramente é vista em estudos subsequentes de imagem e autópsia¹⁷. Neste estudo, os resultados de HE aos 7 dias pós-lesão sugeriram sinais de edema tecidual em todos os grupos; entretanto, não foram encontradas hemácias residuais na área da lesão. Portanto, o azul da Prússia foi usado para examinar a área da lesão para hemorragia, e os resultados corresponderam à hemossiderose observada na área de lesão do grupo lesão grave aos 7 dias pós-lesão, enquanto o grupo leve não. indicando a deposição de lisado de reticulócitos aqui. Esses resultados fornecem evidências circunstanciais de que a discrepância entre os achados relatados anteriormente deve-se, provavelmente, ao fato de o exame de RM ser potencialmente mais sensível que o exame^{histológico14}, além da gravidade da lesão, que também pode influenciar na quantidade de hemorragia na área da lesão. GFAP também foi expressa extensivamente na área danificada. Ao mesmo tempo, a expressão de Iba-1 também foi observada em áreas íntegras, sugerindo a persistência de uma resposta inflamatória, consistente com os resultados da RM, onde um anel de hipersinal ao redor da área de hiposinal na lesão sugere a presença de uma resposta inflamatória. Em última análise, com base nos resultados do presente estudo, a área de lesão no modelo foi focada na substância cinzenta ao redor do cordão central, o que geralmente é consistente com as descrições relatadas^{anteriormente13}. Infelizmente, não realizamos RM repetidamente em todos os animais do experimento para mostrar como o local da lesão muda dinamicamente com o tempo. Futuros pesquisadores podem incluir isso em seus trabalhos para uma melhor investigação sobre CCS. Além disso, a imunomarcação com marcadores neuronais como NeuN, que definem a substância cinzenta, pode ser incluída no estudo.

Em conclusão, as características dos achados em exames anatomopatológicos e de RM têm estreita semelhança com as descritas para SCC em estudos^prévios4. O presente protocolo de modelagem viável do CCS possibilita novas pesquisas e entendimento do CCS.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% fixative solution	Solarbio	P1110	4%
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody	Abcam	ab8135	Dilution ratio (1:2000)
Eosin Staining Solution (water soluble)	Biosharp	BL727B
Ethanol	Fuyu Reagent
Fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X800
Frozen Slicer	Leica
GFAP (GA5) Mouse mAb	Cell Signaling TECHNOLOGY	#3670	Dilution ratio (1:600)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32723TR	Dilution ratio (1:1000)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32740	Dilution ratio (1:1000)
Hematoxylin Staining Solution	Biosharp	BL702A
Mice	Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany	C57BL/6J
Microsurgery apparatus	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	All the surgey instruments are custom-made	Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors
Normal sheep serum for blocking (working solution)	Zhong Shan Jin Qiao	ZLI-9022	working solution
O.C.T. Compound	SAKURA	4583
Phosphate buffered solution (PBS)	Solarbio	P1020	pH 7.2–7.4
Prussian Blue Iron Stain Kit (With Eosin)	Solarbio	G1424
RWD Laboratory inhalation anesthetic station	RWD Life Science Co., Ltd	R550
Small animal in vivo microCT imaging system	PerkinElmer	Quantum GX2
Spinal cord injury coaxial platform	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Custom-made(Feng's standard)	https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~ 1~b0yRFKOq&alg_id= 0&slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid% 2CabTraceId&components_ style_layout =1&reft=1659409105184&spm= g.930111970_f.81386274&alias= 367x5ovgn69q18g&from_uuid= 1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903 dbacbba&sf=qq_sm&is_share= 1&shopAutoEnter=1&share_cmpt =native_wechat&is_silence_auth=1
Surgery microscope	Zumax Medical Co., Ltd.	zumax, OMS2355
Tris Buffered Saline+Tween (TBST)	Solarbio	T1082	Dilution ratio (1:19)
Xylene	Fuyu Reagent