Indução de degeneração discal lombar em coelhos por via transabdominal

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo cirúrgico usando punção com agulha para estabelecer a degeneração do disco lombar de coelho por meio de uma abordagem transabdominal. Verificações radiológicas e análises histológicas foram usadas para confirmar o estabelecimento bem-sucedido da degeneração do disco lombar.

Resumo

A dor lombar é um problema médico extremamente comum em populações em todo o mundo. Um dos principais contribuintes para a dor lombar é a degeneração do disco intervertebral (DIV). Um modelo animal ideal de degeneração da DIV é essencial para estudar a fisiopatologia da dor lombar e investigar possíveis estratégias terapêuticas. Os modelos de coelhos são modelos animais confiáveis, econômicos e facilmente estabelecidos. A abordagem retroperitoneal tem sido amplamente utilizada para induzir degeneração do DIV em modelos de coelhos. No entanto, há complicações relatadas associadas a essa técnica, como avulsão de artérias segmentares e lesão da raiz nervosa. Neste artigo, pretendemos mostrar um protocolo cirúrgico usando punção com agulha para estabelecer a degeneração do disco lombar de coelho por meio de uma abordagem transabdominal. Consequentemente, verificações radiológicas e análises histológicas indicaram que a degeneração do disco lombar foi estabelecida com sucesso em coelhos. Este protocolo cirúrgico apresenta a localização precisa dos discos-alvo e alta reprodutibilidade dos modelos de degeneração do DIV com menos complicações.

Introdução

A dor lombar (DL) é a principal causa de incapacidade em todo o mundo¹. A degeneração do disco intervertebral (DIV) (DDIV) é uma das principais causas de lombalgia ^2,3,4. O IVDD é um processo multifatorial complexo e incompletamente compreendido que pode ser acelerado por diferentes fatores ambientais e biológicos ^5,6,7. As alterações patológicas do DDIV são caracterizadas por uma estrutura desorganizada do DIV, redução do conteúdo de água no núcleo pulposo e degradação da matriz extracelular circundante ^8,9. Modelos animais de DDIV são importantes para estudos relacionados ao DIV ^9,10,11.

Até agora, vários modelos animais de DDIV foram estabelecidos para imitar a progressão do DDIV em humanos. Animais de grande porte, como modelos bovinos, ovinos, caprinos, caninos e primatas, compartilham algumas semelhanças com os humanos em termos de tamanho do disco e composição celular do disco degenerado (ausência de células notocordais, como ovinos e caprinos)¹². No entanto, esses modelos grandes não são comumente usados devido ao alto custo, longo período experimental, baixa reprodutibilidade e habilidades mais complicadas necessárias para estabelecer a degeneração nesses modelos¹³. Por outro lado, modelos de pequenos animais, como ratos, camundongos e coelhos, são amplamente utilizados em estudos relacionados ao DIV porque são mais fáceis de operar, custo-efetivos e confiáveis¹⁰. O tamanho do disco em um coelho é maior do que em um camundongo ou rato e, portanto, há mais espaço em disco para manipulação em coelhos. Além disso, os coelhos apresentam alto grau de homologia com as DIVs humanas, devido à estrutura anatômica espinhal semelhante (articulações facetárias, músculos paravertebrais e ligamentos)^14,15. Portanto, os coelhos são mais adequados do que outros pequenos animais para o estabelecimento de modelos de IVDD.

Os modelos animais de DDIV incluem modelos mecânicos (compressão, instabilidade), modelos estruturais (lesão, química) e modelos animais de degeneração espontânea¹⁶. Os modelos de DDIV em coelhos geralmente são criados induzindo lesão usando duas abordagens cirúrgicas diferentes - a abordagem transabdominal¹⁷e a abordagem retroperitoneal¹⁸. A abordagem retroperitoneal de punção com agulha nos DIVs alvo é amplamente utilizada, mas pode causar muitas complicações, como avulsão de artérias segmentares e lesão da raiz nervosa^18,19. Aqui, relatamos um modelo de DDIV em coelhos induzido por DIVs com punção com agulha por meio de uma abordagem transabdominal, com o objetivo de fornecer um método fácil e reprodutível para estabelecer DDIV em coelhos.

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Protocolo

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de Xingtai do Grupo de Saúde Médica do Norte da China (número de aprovação: ZCKT-2021-0009). Este estudo usou coelhos brancos da Nova Zelândia saudáveis esqueleticamente maduros (fêmea, 1 ano, 3-5 kg).

1. Preparo pré-operatório

1. Jejue os coelhos e prive-os de água por 6-8 h antes da anestesia geral.
2. Pese o coelho.
3. Limpe a orelha com etanol a 70% usando uma esponja de gaze.
4. Aplique creme anestésico local nas orelhas.
5. Aplique pressão ao redor da base da orelha para distender a veia marginal da orelha.
6. Sedar os coelhos com midazolam (1-2 mg/kg) injetando na veia marginal da orelha²⁰.
7. Administre a anestesia inalatória com uma máscara. Defina a taxa de oxigênio para 1 L/min e a concentração de isoflurano para 4%-5% para induzir a anestesia.
   NOTA: Para avaliar a profundidade da anestesia, puxe a pata traseira do animal para fora e aperte o pé com força usando o polegar e o indicador. Os animais não devem ser operados até que o reflexo de abstinência tenha diminuído²¹.
8. Mantenha a concentração de isoflurano em 2,5%-3,5% (dependendo do peso do coelho).

2. Procedimentos intra-operatórios

1. Autoclave as ferramentas cirúrgicas (pinça/pinça de vaso, tesoura de tecido, tesoura de ponto, cabo de bisturi, lâmina de bisturi #22, afastador portátil de ponta dupla, gaze estéril, sutura absorvível 3-0, sutura trançada não absorvível 4-0, porta-agulha, gaze de amendoim [uma gaze em forma de bola feita à mão], seringa de 5 mL, seringa de 1 mL, agulha de 16 G, agulha de 26 G, rolha de profundidade de 5 mm) antes de prosseguir com o procedimento cirúrgico.
2. Esterilize a mesa de operação com álcool 75%.
3. Usando um barbeador elétrico e pasta depilatória, raspe a região definida da costela mais baixa até o nível da crista ilíaca no lado ventral do coelho.
   NOTA: Evite danificar os mamilos.
4. Posicione o coelho na mesa de operação em decúbito dorsal e prenda os membros.
5. Pegue a linha da crista ilíaca em ambos os lados como ponto médio e desenhe a linha 2 cm acima e abaixo como pontos de referência para o local da incisão cirúrgica. Marque esses pontos de referência com uma caneta estéril.
6. Desinfete a pele com uma solução de iodopovidona duas vezes. Coloque um campo quadrado fenestrado estéril sobre o local da cirurgia e um campo quadrado grande para cobrir a mesa de operação. Mantenha um ambiente asséptico rigoroso durante todo o procedimento.
7. Injete 2 mL de lidocaína a 2% por via subcutânea antes da incisão cirúrgica para aliviar a dor pós-operatória.
8. Faça a incisão ao longo dos pontos de referência usando uma lâmina de bisturi # 22 e separe sem rodeios a fáscia, o músculo e a parede abdominal usando uma pinça curva e uma tesoura de tecido.
9. Entre na cavidade peritoneal até que a bexiga seja vista. Use o afastador portátil de ponta dupla para puxar a bexiga e outros órgãos da cavidade intestinal para a esquerda com cuidado. Em seguida, encontre a bifurcação da veia ilíaca e tome-a como o ponto de marca para o disco L5-6 abaixo dela.
   NOTA: Preste atenção para evitar ferir quaisquer órgãos abdominais, especialmente os intestinos.
10. Use um dedo para tocar a aorta abdominal pulsando no lado direito da coluna e puxe os vasos sanguíneos e órgãos para a esquerda.
11. Após manipular o disco saliente (L5-6), faça uma incisão no peritônio posterior e, em seguida, use a gaze de amendoim para dissecar obtuso o tecido muscular pré-vertebral.
12. Para confirmar o nível correto do disco alvo e a direção da agulha, use uma agulha 26 G para perfurar as vértebras próximas ao disco alvo e verifique isso sob a orientação do arco em C.
13. Depois de localizar o disco alvo, coloque a ponta da agulha de 16 G paralela às placas terminais da cartilagem superior e inferior. Em seguida, use a ponta da agulha para perfurar o centro do IVD a uma profundidade de 5 mm (usando uma rolha), segurando por 30 s.
    NOTA: Faça uma radiografia anteroposterior e lateral lombar para verificar se a posição da ponta da agulha está no centro do DIV e se a direção da ponta da agulha é paralela às placas terminais superior e inferior, respectivamente.
14. Repita o mesmo procedimento para o próximo disco L6-7.
15. Use solução salina morna para irrigar a cavidade abdominal e verifique a hemorragia antes de fechar a incisão.
16. Execute o fechamento em camadas. Use suturas absorvíveis sintéticas 3-0 para fechar a camada fascial continuamente. Suturar a pele de espessura total usando suturas trançadas não absorvíveis 4-0.
17. Desligue o vaporizador e pare a anestesia. Mantenha o coelho sob observação constante em uma gaiola metabólica até que ele possa se mover normalmente.

3. Manejo pós-operatório

1. Injete ceftriaxona sódica (25 mg / kg) por via intramuscular imediatamente após a cirurgia.
2. Permita que os animais se movam e se alimentem livremente. Continue a observar sinais de complicações neurológicas, como paralisia das pernas, problemas com micção e defecação ou complicações do sistema digestivo.

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Resultados

A abordagem transabdominal foi validada em nosso estudo anterior para criar modelos de coelhos com DDIV²². Raios-X e ressonância magnética (RM) foram realizados na^4ª,^12ª e^16ª semanas de pós-operatório. As imagens radiográficas revelaram que a altura do DIV L5-6 e L6-7 diminuiu gradualmente ao longo de 16 semanas após a cirurgia de punção com agulha (Figura 1A). O DHI do grupo de punção com...

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Discussão

As etapas críticas neste protocolo são a proteção dos órgãos abdominais, a identificação dos discos-alvo e a posição e direção da agulha. O DIV L5-6 está logo abaixo da bifurcação da veia ilíaca, e o DIV L6-7 é identificado com base na posição paralela à crista ilíaca. Esses dois marcadores permitem o posicionamento preciso do disco intervertebral e melhoram a precisão e a repetibilidade da cirurgia - que é uma das principais vantagens da abordagem transabdominal. ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#22 scalpel blade	Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.	AA6468	None
16-G needle, 26-G needle	Zhejiang Kangkang MEDICAL-DEVICES Co., Ltd.	305111	None
3-0 absorbable suture	Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.	V500431	None
4-0 non-absorbable braided suture	Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.	R413	None
5 mL syringe, 1 mL syringe	Zhejiang Kangkang MEDICAL-DEVICES Co., Ltd.	301942	None
Double-ended handheld retractor	Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.	60002066	None
Midazolam	Yichang Humanwell Pharmaceutical Co., Ltd.	M-908CAS	None
Needle holder	Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.	HC00505336	None
Peanut gauze	In-house	None	Hand-made ball-shaped gauze
Rabbit	Tonghui ulture Limited Liability Company	SCXK2016--002	None
Scalpel handle	Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.	AM5100678	None
Stopper	In-house	None	Depth of 5 mm
Tissue scissors	Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.	HC00505422	None
Vaporizer	Apollo Management L.P.	BW-AM503	None
Vessel clamp/forceps	Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.	AM5102194	None