Análise de Microtomografia Computadorizada do Joelho em Cobaias Dunkin-Hartley Idosas após Injeção Intra-Articular

Resumo

As cobaias Dunkin-Hartley são um modelo animal estabelecido para a pesquisa da osteoartrite. Tais estudos podem se beneficiar de injeções intra-articulares por vários motivos, incluindo a investigação de novos agentes ou o tratamento de doenças. Descrevemos uma metodologia para injeções intra-articulares de joelho em cobaias e subsequente análise de microtomografia computadorizada avaliando alterações do joelho associadas à artrite.

Resumo

O objetivo deste protocolo é orientar os pesquisadores na realização de uma técnica guiada por palpação de injeção intra-articular no joelho em cobaias e avaliação por meio de microtomografia computadorizada. As cobaias Dunkin-Hartley são modelos robustos para a pesquisa da osteoartrite, pois desenvolvem espontaneamente osteoartrite nos joelhos. A administração intra-articular de medicamentos é um método comum para estudar os efeitos de um medicamento experimental in vivo. Em humanos, os agentes terapêuticos administrados por injeção intra-articular podem oferecer alívio da dor e retardar a progressão da osteoartrite. Como acontece com qualquer espécie, a introdução de uma agulha em um espaço articular tem o potencial de causar lesões, o que pode resultar em dor, claudicação ou infecção. Tais eventos adversos podem comprometer o bem-estar animal, confundir os resultados do estudo e exigir animais adicionais para atingir os objetivos do estudo. Como tal, é imperativo desenvolver técnicas de injeção adequadas para evitar complicações, especialmente em estudos longitudinais que requerem injeções intra-articulares múltiplas e repetidas. Utilizando a metodologia apresentada, cinco cobaias receberam injeções bilaterais no joelho sob anestesia geral. Sete dias após a injeção, os animais foram sacrificados humanamente para análise da gravidade da osteoartrite. Nenhum evento adverso ocorreu após anestesia ou injeções no joelho, incluindo claudicação, dor ou infecção. A análise por microtomografia computadorizada de raios-X do joelho pode detectar alterações patológicas associadas à osteoartrite. Os dados da microtomografia computadorizada indicam que a osteoartrite é mais grave em animais mais velhos, conforme indicado pelo aumento da densidade mineral óssea e da espessura trabecular com a idade. Esses resultados são consistentes com as alterações histológicas e os escores de Mankin modificados, um sistema de pontuação estabelecido e amplamente utilizado para avaliar a gravidade da artrite nesses mesmos animais. Este protocolo pode ser utilizado para refinar injeções intra-articulares em cobaias.

Introdução

A osteoartrite (OA) afeta 32,5 milhões de adultos nos EUA. É causada pela perda progressiva da cartilagem articular, inflamação leve dos tecidos dentro e ao redor das articulações e formação de osteófitos e cistos ósseos ^1,2. Os sintomas geralmente se manifestam nos estágios posteriores da doença, com os tratamentos atuais fornecendo apenas alívio paliativo, além de ter efeitos colaterais sistêmicos. A falta de drogas modificadoras da doença decorre de uma má compreensão dos mecanismos subjacentes da doença³. Como resultado, há uma necessidade médica crítica e contínua de agentes aprimorados para tratar a OA.

Vários modelos animais de OA estão disponíveis que examinam diferentes componentes dos processos da doença⁴. Embora existam vários modelos cirúrgicos, incluindo a transecção do ligamento cruzado anterior e a desestabilização do menisco medial, estes são invasivos e requerem um alto nível de habilidade técnica⁵. Os modelos quimicamente induzidos são procedimentos comparativamente menos invasivos normalmente usados para estudar os mecanismos de dor da OA⁶. Um desses modelos de camundongos amplamente utilizados envolve a indução de OA por uma injeção intra-articular no joelho de iodoacetato monossódico (MIA). Este modelo gera um fenótipo semelhante à dor reprodutível, robusto e rápido que pode ser graduado alterando a dosagem de MIA⁷. Detalhes técnicos da indução deste modelo foram descritos anteriormente⁷. A tradução dessa técnica para roedores maiores, como porquinhos-da-índia, é difícil devido às suas diferenças anatômicas. Algumas diferenças incluem aumento da musculatura ao redor dos ossos adjacentes e espaço articular na cobaia e uma fíbula e tíbia articuladas em comparação com a fusão distal observada em camundongos⁸. As cobaias Dunkin-Hartley, uma linhagem de cobaias amplamente disponível, são um modelo animal de OA estabelecido, pois desenvolvem naturalmente essa doença, oferecendo assim um modelo robusto para investigar os efeitos de novas terapêuticas administradas por injeção intra-articular na progressão da doença⁹. As cobaias Dunkin-Hartley começam a desenvolver OA aos três meses, com os machos apresentando um desenvolvimento acelerado e fenótipo¹⁰ mais grave. Em cobaias, a OA progride com a idade e, aos 12 meses, a patologia associada é aparente nos exames de imagem¹¹. Modelos espontâneos de OA, como o modelo de Dunkin-Hartley, não requerem nenhuma intervenção para induzir OA e, assim, recapitular o desenvolvimento e a progressão do fenótipo da doença em humanos, fornecendo assim um poderoso modelo translacional¹⁰. Além disso, o desenvolvimento espontâneo de OA permite o controle interno quando novas terapêuticas são administradas unilateralmente em um único joelho de um determinado animal. Esse controle interno minimiza os efeitos das variabilidades interanimais ao analisar os dados e pode ajudar a reduzir o número geral de animais.

A análise por microtomografia computadorizada de raios X (μCT) é uma ferramenta poderosa que permite a avaliação quantitativa da gravidade da OA¹². A μCT envolve a varredura de várias imagens de raios-X de alta resolução, obtidas de uma amostra rotativa ou fonte e detector de raios-X rotativos¹³. Em seguida, os dados volumétricos tridimensionais (3D) são reconstruídos na forma de fatias de imagem empilhadas¹⁴. Como o osso mineralizado apresenta excelente contraste na μCT, essa modalidade pode ser usada para avaliar características 3D e realizar análises quantitativas de alterações associadas à OA 15,16,17. A μCT oferece várias vantagens em relação às ferramentas mais amplamente utilizadas, incluindo histopatologia e análises de marcha. Em contraste com a avaliação histológica de um ou poucos cortes de tecidos, a μTC escaneia toda a articulação e oferece uma avaliação mais holística das lesões de OA¹⁸. Embora a análise da marcha possa discernir alterações sintomáticas na função articular ao longo do tempo, as alterações articulares se desenvolvem muito antes das alterações funcionais associadas à OA. A μCT pode fornecer uma medida mais sensível do desenvolvimento da OA antes do início da claudicação. Duas medidas quantitativas particularmente relevantes incluem a densidade mineral óssea e a espessura trabecular, pois ambas aumentam ao longo da progressão da OA^19,20. Pode ser útil dividir a análise em placa subcondral e osso trabecular, pois eles têm características diferentes, para obter medições e comparações mais robustas.

O objetivo geral deste método é ajudar os pesquisadores a realizar com sucesso injeções intra-articulares em cobaias. O protocolo apresentado utilizou cobaias Dunkin-Hartley machos intactos de cinco (n=2), nove (n=1) e 12 (n=2) meses de idade; Os procedimentos podem ser extrapolados para outras linhagens de cobaias e idades que requerem injeções intra-articulares no joelho. Em modelos espontâneos de OA, como o modelo de Dunkin-Hartley, a progressão da doença e a resposta ao tratamento seriado são frequentemente monitoradas por longos períodos de tempo, abrangendo semanas a meses⁹. Este protocolo estendido resulta em várias injeções intra-articulares e, portanto, é importante ter uma técnica de injeção adequada para prevenir eventos adversos, incluindo dor, claudicação ou infecções, que podem afetar o bem-estar animal e confundir os resultados do estudo, ao mesmo tempo em que necessitam de animais adicionais no estudo. O protocolo apresentado descreve a metodologia de injeções intra-articulares em cobaias e posterior análise dos dados de μCT.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul. O estudo seguiu o princípio dos 3R.

1. Preparações injetáveis intra-articulares

1. Permita que os porquinhos-da-índia Dunkin-Hartley se aclimatem às instalações por pelo menos uma semana antes de iniciar o experimento.
   NOTA: Foram utilizados cobaias machos de 5 (n=2), 9 (n=1) e 12 (n=2) meses de idade. Os machos apresentam um desenvolvimento acelerado e um fenótipo mais grave de OA.
2. Raspe a área do joelho com um barbeador elétrico.
   NOTA: Tenha cuidado com os mamilos medialmente.
3. Anestesie a cobaia em uma câmara de isoflurano que forneça 3-5% de isoflurano na mistura de O₂ (vazão de 2,5 L/min) e, em seguida, transfira a cobaia para um cone nasal conectado a um circuito de anestesia sem reinalação. Ajuste o isoflurano para manter o plano cirúrgico de anestesia durante a injeção, normalmente com uma taxa de fluxo de oxigênio de 0.5-1 L/min e 1-3% de isoflurano.
   NOTA: As injeções intra-articulares causam dor leve e momentânea. Os animais são anestesiados durante o procedimento para evitar a percepção de estímulos dolorosos e melhorar a precisão da injeção. No presente estudo, a administração de analgésicos, incluindo anti-inflamatórios não esteroidais, interferiria na progressão da OA²¹. Devido à dor momentânea, anestesia fornecida e potencial de analgésicos para confundir o modelo, os analgésicos não foram administrados, a menos que os animais apresentassem efeitos colaterais, incluindo claudicação e sinais de dor à palpação articular após a injeção. Os investigadores devem considerar o uso de analgésicos para injeções de rotina. Os analgésicos são recomendados quando ocorrem efeitos colaterais. Os regimes analgésicos devem ser discutidos com o veterinário institucional e aprovados pela IACUC antes de iniciar os estudos.
4. Certifique-se de que a cobaia esteja na profundidade adequada da anestesia por falta de resposta ao pinçamento do dedo do pé.
5. Coloque lubrificante ocular estéril em ambos os olhos para evitar dessecação e ferimentos.
6. Dilua a betadina com água estéril a 10%.
7. Diluir o etanol 200 proof com água estéril para 70% de etanol.
8. Prepare soluções para injeção, em um gabinete de biossegurança para manter a esterilidade. No protocolo apresentado, um veículo estéril (1x solução salina tamponada com fosfato) foi utilizado para injetar ambos os joelhos. As soluções podem ser alteradas com base nos objetivos da pesquisa.
   NOTA: Certifique-se de diluir soluções injetáveis frescas imediatamente antes da sessão de injeção para garantir a esterilidade. Quaisquer soluções não utilizadas devem ser eliminadas no final de cada sessão de injeção.
9. Encha as seringas estéreis de insulina de uso único com soluções injetáveis. Tome cuidado para utilizar o menor volume possível para evitar sobrecarregar o espaço da junta com volume. No presente estudo, foram utilizados 50 μL.
10. Coloque o porquinho-da-índia e o cone do nariz em uma superfície limpa com uma almofada de aquecimento para suporte térmico e acolchoamento sob a cabeça para elevá-la ligeiramente.
11. Use avental cirúrgico, rede de cabelo, luvas estéreis e máscara durante a execução do procedimento de injeção.
12. Despeje 10% de betadine em uma bola de algodão e limpe as duas áreas do joelho.
13. Despeje etanol 70% em uma bola de algodão e limpe as duas áreas dos joelhos.
14. Repita 1.12 e 1.13 mais duas vezes.
    NOTA: Para fins de demonstração, o vídeo correspondente mostra a limpeza do joelho e do local da injeção uma vez com betadina a 10% e etanol a 70%. O local da injeção foi posteriormente limpo com movimentos circulares mais duas vezes, alternando essas soluções. Três esfregões seriados com soluções de esfregar alternadas e álcool são recomendados para obter a técnica asséptica.

2. Injeção intra-articular

1. Coloque o porquinho-da-índia em decúbito dorsal durante todo o procedimento.
2. Coloque um novo par de luvas estéreis e palpe a articulação do joelho.
   NOTA: No protocolo e vídeo apresentados, foram utilizadas luvas de nitrilo autoclavadas. Luvas estéreis, incluindo luvas de nitrilo autoclavadas ou luvas cirúrgicas, devem ser utilizadas para técnica asséptica.
3. Flexione manualmente o joelho a 90°.
4. Mova o dedo distal à patela para localizar o sulco do aspecto distal do espaço articular, flexionando e estendendo o membro posterior.
   NOTA: A patela pode ser palpada nesta posição como uma estrutura pequena e firme localizada diretamente sobre o espaço articular. A tíbia pode ser sentida como uma estrutura óssea distal à patela. Uma vez determinada a localização da tíbia e da patela, a articulação, sentida como um sulco, fica entre elas, distal à patela e proximal à tíbia.
5. Insira a agulha de insulina cuidadosamente na linha média distal à patela dentro do espaço articular. A agulha deve ser inserida 1-2 mm abaixo da pele para entrar no espaço articular.
   NOTA: A maior janela de acesso para o espaço articular enquanto o joelho está flexionado está na face anterior do membro na linha média, diretamente distal à patela. A injeção na linha média na direção anterior-posterior ajudará a injetar com precisão no espaço articular sem penetrar nas estruturas ósseas. A injeção precisa no espaço articular pode ser alcançada usando uma abordagem lateral-medial, embora a janela de acesso seja mais estreita, especialmente quando o joelho é flexionado.
6. Injete 50 μL da solução na articulação lentamente. Certifique-se de que a agulha seja inserida facilmente e que o conteúdo seja injetado sem resistência.
   NOTA: Certifique-se de não inserir a agulha muito fundo, pois pode causar danos nas articulações ou ossos e resultar em inflamação e/ou dor indesejada. Se o sulco correspondente ao espaço articular não for encontrado, a agulha pode penetrar no fêmur, patela ou tíbia. Portanto, é benéfico palpar com confiança o sulco correspondente ao espaço articular para evitar injeções periarticulares ou lesões associadas à penetração de estruturas ósseas. Se uma bolha se desenvolver no local da injeção sob a pele, a injeção foi muito rasa e o fluido entrou no espaço subcutâneo. Dependendo das propriedades do agente utilizado, o medicamento pode entrar no espaço articular por difusão ou outra tentativa de injeção pode ser necessária.
7. Uma vez feito isso, descarte a agulha na lixeira para objetos cortantes.
   NOTA: Para fins de prática e treinamento, injete líquido contendo um corante no espaço articular de um cadáver em um roedor ou porquinho-da-índia de tamanho semelhante. Em seguida, disseque a articulação para confirmar a localização da injeção.
8. Massageie o joelho flexionando e estendendo a articulação algumas vezes para promover a difusão da droga dentro do espaço articular.
9. Repita as etapas 2.1-2.5 uma vez no membro contralateral com 1x solução PBS.

3. Recuperação da injeção intra-articular

1. Desligue o isoflurano e mantenha 100% do fluxo de oxigênio até que o animal recupere a consciência.
2. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento para suporte térmico até o ambulatório.
3. Aplique uma bolsa de gelo no joelho por 30 segundos com uma toalha de papel como barreira para ajudar a diminuir o inchaço da injeção.
4. Avalie a marcha do animal quando ambulatorial antes de devolvê-lo ao alojamento.
   NOTA: Se forem observadas anormalidades na marcha, analgésicos e cuidados de suporte podem ser necessários. É aconselhável avaliar sua marcha novamente várias horas após a recuperação da anestesia para garantir a mobilidade normal.

4. Microtomografia computadorizada (μCT)

1. Para a coleta de tecido, estabelecer um plano cirúrgico de anestesia com mistura de oxigênio a 100% e isoflurano a 5%.
2. Confirme um plano cirúrgico de anestesia com a falta de resposta a um estímulo de pinça do dedo do pé. Eutanasiar humanamente o animal por meio da administração de ≥ 150 mg/kg de pentobarbital por via intravenosa de acordo com as políticas institucionais e o protocolo de uso de animais aprovado.
   NOTA: No protocolo apresentado, cada uma das cinco cobaias recebeu uma injeção em ambos os joelhos. Os animais foram anestesiados e sacrificados humanamente uma semana após a injeção.
3. Colha os dois membros posteriores dissecando a pele da musculatura circundante.
4. Em seguida, desarticule o membro posterior com Rongeurs no meio da diáfise do fêmur e proximal ao tornozelo.
   NOTA: A cama de varredura e o suporte de amostra usados não conseguiram acomodar todo o membro posterior de um porquinho-da-índia adulto. Suportes de amostras grandes estão disponíveis comercialmente para amostras maiores.
5. Coloque os tecidos em solução de formalina tamponada neutra por 72 h para fixação antes de realizar a μCT.
6. Abra o software de varredura μCT e coloque a amostra com formalina em um recipiente compatível que caberá na pasta de amostra μCT, mantendo o tecido no campo de visão.
7. Calibre a máquina μCT para exposições de campo escuro e campo claro de acordo com as recomendações do fabricante.
8. Varrer a amostra com filtro Al+a 18 μm. Use a etapa de rotação 0.7° para 360° com a câmera offset.
   NOTA: A verificação salva automaticamente.

5. Processamento de imagens para avaliação de parâmetros microarquitetônicos ósseos

1. Baixe e instale o software de reconstrução μCT para a reconstrução de imagens μCT.
2. Selecione a pasta do software e clique duas vezes para abrir o software.
3. Selecione uma fatia das imagens μCT clicando em uma fatia de imagem.
4. Escolha o destino do arquivo de reconstrução. Selecione Procurar e crie uma nova pasta chamada Recon. O formato de arquivo selecionado deve ser BMP(8).
5. Verifique a compensação de desalinhamento.
   NOTA: Normalmente, a estimativa está quase correta, mas pode ser ajustada manualmente para deslocar as imagens sobrepostas para que as bordas direita e esquerda se alinhem o mais próximo possível.
6. Em Configurações, aplique os algoritmos Suavização, Proteção de feixe, Rotação de CS e Artefatos de anel .
   NOTA: Pode ser útil escolher a imagem de visualização para determinar a clareza antes de reconstruir. A configuração de ajuste fino também pode ser útil para determinar quais configurações são as melhores.
7. Selecione Iniciar para começar a processar a reconstrução.

6. Coleta de dados microarquitetônicos a partir de imagens reconstruídas

1. Baixe e instale o Dataviewer.
2. Selecione VOI e oriente a amostra para alinhar verticalmente para facilitar a análise posteriormente.
3. Salve o VOI editado como uma nova pasta.
4. Baixe e instale o CTAnalyser para a análise de propriedades ósseas de parâmetros microarquitetônicos.
   NOTA: A versão gratuita do CTAnalyser é limitada em funcionalidade, por isso é recomendável obter uma licença completa.
5. Divida a análise em placa subcondral e osso trabecular, salvando-os como um intervalo separado de imagens.
   NOTA: Não é necessário dividir a análise, mas como a placa subcondral e o osso trabecular têm características diferentes, análises separadas podem ajudar com medições e comparações robustas.
6. Selecione o intervalo de imagens a serem analisadas, começando com a placa subcondral, clicando na fatia de imagem com a qual deseja começar.
7. Selecione a região de interesse para cada imagem para garantir que ela esteja abrangendo o osso clicando na guia da região de interesse.
8. Selecione a guia Seleção binária . Ajuste o histograma para que o fundo e o osso fiquem completamente separados.
9. Selecione a guia Densidade mineral óssea (BMD). Salve esses dados em uma nova pasta de dados de análise.
10. Selecione Processamento personalizado e vá para a guia Interno .
11. Primeiro execute o Limiar e selecione Automático Otsu e, em seguida, Executar.
12. Em seguida, selecione Despeckle e escolha Remove black speckles e, em seguida, Run (Executar).
13. Repita Remover manchas e escolha Remover manchas brancas e, em seguida, Executar.
14. Escolha Análise 3D e selecione Valores básicos e Valores adicionais.
15. Repita as etapas 6.2.2-6.4.5 para redefinir a imagem para análise do osso trabecular.
    NOTA: Certifique-se de que o arquivo de saída esteja em uma nova pasta com o mesmo arquivo que os dados BMD.

Resultados

Antes de realizar injeções intra-articulares em animais vivos, o protocolo acima foi praticado em três cadáveres de ratos para garantir o local correto da injeção. Durante as sessões práticas, 50 μL de corante azul de metileno novo a 70% foram injetados em ambas as articulações do joelho usando a metodologia descrita acima. Isso equivale a seis injeções práticas. Após as injeções, a articulação do joelho foi dissecada por incisão através da face cranial do espaço articular, distal à patela e atrav?...

Discussão

Apesar dos recentes avanços no tratamento sintomático da OA, há uma completa falta de agentes terapêuticos que previnam o início ou retardem a progressão da OA²⁴. Atualmente, a única cura para a OA grave é a substituição articular, que é cara, invasiva e pode resultar em morbidade e mortalidade do paciente²⁵. Como resultado, há uma extrema necessidade de pesquisas contínuas com modelos animais de OA e o desenvolvimento sustentado de novas terapêuticas. Vários...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	sterilizing agent
3D.SUITE software	Bruker		μ-CT analyzing software
Betadine Surgical Scrub	Avrio Health	67618-151-16	sterilizing agent
Insulin syringe with needle	Ulticare	91008	to perform injections
Isoflurane	Piramal	803249	anesthesize animal
Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	23-427098	Fix tissue
Nrecon Software	Bruker		μ-CT reconstruction software
Phosphate Buffered Saline	Cytiva	SH30258.01	control and diluting agent
SkyScan 1176	Bruker		to scan samples