老年Dunkin-Hartley豚鼠关节内注射后膝关节的显微计算机断层扫描分析

摘要

Dunkin-Hartley豚鼠是用于骨关节炎研究的既定动物模型。由于各种原因，此类研究可能受益于关节内注射，包括研究新型药物或治疗疾病。我们描述了一种在豚鼠中进行关节内膝关节注射的方法，以及随后评估关节炎相关膝关节变化的显微计算机断层扫描分析。

摘要

该协议的目的是指导研究人员在豚鼠中执行触诊引导的关节内膝关节注射技术并使用显微计算机断层扫描进行评估。Dunkin-Hartley豚鼠是骨关节炎研究的稳健模型，因为它们会自发地在膝盖上发展骨关节炎。关节内给药是研究研究药物 在体内效果的常用方法。在人类中，通过关节内注射给药的治疗剂可以缓解疼痛并延缓骨关节炎的进一步进展。与任何物种一样，将针头引入关节空间可能会导致受伤，从而导致疼痛、跛行或感染。这些不良事件会损害动物福利，混淆研究结果，并需要额外的动物来实现研究目标。因此，当务之急是开发适当的注射技术来预防并发症，特别是在需要多次、重复关节内注射的纵向研究中。使用所提出的方法，五只豚鼠在全身麻醉下接受了双侧膝关节注射。注射后七天，对动物进行人道安乐死，以分析骨关节炎的严重程度。麻醉或膝关节注射后未发生不良事件，包括跛行、疼痛或感染。膝关节的 X 射线显微计算机断层扫描分析可以检测与骨关节炎相关的病理变化。显微计算机断层扫描数据表明，骨关节炎在老年动物中更为严重，表现为骨密度和小梁厚度随年龄增长而增加。这些结果与组织学变化和改良 Mankin 评分一致，这是一种已建立且广泛使用的评分系统，用于评估这些相同动物的关节炎严重程度。该方案可用于改进豚鼠的关节内注射。

引言

骨关节炎 （OA） 影响了 3250 万美国成年人。它是由关节软骨的进行性损失，关节内和关节周围的组织轻度炎症以及骨赘和骨囊肿的形成引起的^1,2。症状通常在疾病的后期阶段表现出来，目前的治疗方法只能提供姑息性缓解，并且具有全身性副作用。缺乏改善疾病的药物源于对疾病潜在机制的了解不足³.因此，对治疗 OA 的改进药物存在着关键且持续的医疗需求。

有几种 OA 动物模型可用于检查疾病过程的不同组成部分⁴.虽然存在几种手术模型，包括前交叉韧带的横断和内侧半月板的不稳定，但这些都是侵入性的，需要高水平的技术技能⁵。化学诱导模型是侵入性相对较小的程序，通常用于研究 OA 疼痛机制⁶.一种广泛使用的小鼠模型涉及通过关节内膝部注射碘乙酸钠 （MIA） 诱导 OA。该模型产生可重复、稳健和快速的疼痛样表型，可以通过改变 MIA 剂量⁷ 进行分级。诱导该模型的技术细节在前面已经描述^{过 7}.由于它们的解剖学差异，将这种技术应用于较大的啮齿动物（如豚鼠）很困难。一些差异包括与小鼠⁸ 中看到的远端融合相比，豚鼠相邻骨骼和关节空间周围的肌肉组织增加，以及铂骨和胫骨的关节融合。Dunkin-Hartley 豚鼠是一种广泛使用的豚鼠品系，是一种已建立的 OA 动物模型，因为它们会自然发展为这种疾病，从而为研究通过关节内注射给药的新型疗法对疾病进展的影响提供了一个强大的模型⁹。Dunkin-Hartley 豚鼠在三个月大时开始发展 OA，雄性表现出发育加速和更严重的表型¹⁰。在豚鼠中，OA 随着年龄的增长而进展，在 12 个月时，影像学检查显示相关病理学明显¹¹。自发性 OA 模型，如 Dunkin-Hartley 模型，不需要任何干预来诱导 OA，从而概括了人类疾病表型的发展和进展，从而提供了一个强大的转化模型¹⁰。此外，当在给定动物的单膝关节中单侧施用新型疗法时，骨关节炎的自发发展允许内部控制。在分析数据时，这种内部控制可以最大限度地减少动物间变异的影响，并可能有助于减少动物总数。

X 射线显微计算机断层扫描 （μCT） 分析是一种强大的工具，可以对¹² 级 OA 严重程度进行定量评估。μCT涉及扫描从旋转样品或旋转X射线源和检测器¹³获得的多个高分辨率X射线图像。然后，将三维（3D）体积数据以堆叠图像切片¹⁴的形式重建。由于矿化骨在 μCT 上具有出色的对比度，因此该模式可用于评估 3D 特征并对与 OA 15,16,17 相关的变化进行定量分析。与更广泛使用的工具相比，μCT 具有多项优势，包括组织病理学和步态分析。 与对一个或几个组织切片的组织学评估相比，μCT 扫描整个关节，并对 OA 病变提供更全面的评估¹⁸。虽然步态分析可以辨别关节功能随时间推移的症状性变化，但关节变化早在与 OA 相关的功能变化之前就已经发生。μCT 可以在跛行开始之前提供更灵敏的 OA 发展测量。两个特别相关的定量测量包括骨矿物质密度和小梁厚度，因为两者都在 OA^19,20 的进展过程中增加。将分析分为软骨下板和小梁骨会有所帮助，因为它们具有不同的特征，以实现更可靠的测量和比较。

该方法的总体目标是帮助研究人员成功地对豚鼠进行关节内注射。所提出的方案使用5-（n=2）、9-（n=1）和12-（n=2）月龄的完整雄性Dunkin-Hartley豚鼠;手术可以外推到其他需要关节内膝关节注射的豚鼠品系和年龄。在自发的 OA 模型中，如 Dunkin-Hartley 模型，通常需要长时间监测疾病进展和对连续治疗的反应，持续数周至数月⁹。这种扩展的方案导致多次关节内注射，因此拥有适当的注射技术以防止不良事件非常重要，包括疼痛、跛行或感染，所有这些都会影响动物福利并混淆研究结果，同时需要额外的动物进行研究。所提出的方案描述了豚鼠关节内注射的方法和随后的μCT数据分析。

研究方案

此处描述的所有方法均已获得南卡罗来纳医科大学机构动物护理和使用委员会的批准。该研究遵循3R原则。

1.关节内注射制剂

1. 在开始实验之前，让Dunkin-Hartley豚鼠适应设施至少一周。
   注:使用5-（n=2）、9-（n=1）和12-（n=2）月龄雄性豚鼠。男性表现出发育加速和更严重的 OA 表型。
2. 用电动剃须刀剃除膝盖区域。
   注意:小心内侧。
3. 在异氟烷室中麻醉豚鼠，在O₂ 混合物（流速2.5L / min）中提供3-5%异氟烷，然后将豚鼠转移到连接到非再呼吸麻醉回路的鼻锥中。在注射过程中调整异氟烷以维持手术麻醉平面，通常氧气流速为 0.5-1 L/min 和 1-3% 异氟烷。
   注意:关节内注射会引起轻微的短暂疼痛。在手术过程中对动物进行麻醉，以防止对疼痛刺激的感知并提高注射准确性。在所提出的研究中，镇痛剂（包括非甾体抗炎药）的给药会干扰 OA 进展²¹。由于短暂的疼痛，提供麻醉和镇痛药可能混淆模型，除非动物表现出副作用，包括注射后关节触诊时出现跛行和疼痛迹象，否则不会使用镇痛药。研究者应考虑在常规注射中使用镇痛药。当出现副作用时，建议使用镇痛药。在开始研究之前，应与机构兽医讨论镇痛方案，并得到 IACUC 的批准。
4. 通过缺乏脚趾捏合反应，确保豚鼠处于适当的麻醉深度。
5. 将无菌眼部润滑剂涂抹在双眼上，以防止干燥和受伤。
6. 用无菌水将betadine稀释至10%。
7. 用无菌水将 200 度乙醇稀释至 70% 乙醇。
8. 在生物安全柜中制备注射溶液，以保持无菌。在所提出的方案中，使用无菌载体（1x磷酸盐缓冲盐水）注射双膝关节。可以根据研究目标改变解决方案。
   注意:确保在注射前立即稀释新鲜的注射溶液，以确保无菌。任何未使用的溶液都应在每次注射结束时丢弃。
9. 用注射溶液填充无菌一次性胰岛素注射器。注意利用可实现的最小体积，以防止关节空间因体积而超载。在本研究中，使用 50 μL。
10. 将豚鼠和鼻锥放在干净的表面上，并带有用于热支撑的加热垫，并在头部下方填充垫以稍微升高。
11. 在执行注射程序时穿上手术衣、发网、无菌手套和口罩。
12. 将 10% 甜菜碱倒在棉球上，擦拭两个膝盖区域。
13. 将 70% 乙醇倒在棉球上，擦拭两个膝盖区域。
14. 再重复 1.12 和 1.13 两次。
    注意:出于演示目的，相应的视频显示用 10% 甜菜碱和 70% 乙醇清洁膝盖和注射部位一次。随后使用圆周运动再清洁两次注射部位，交替使用这些溶液。建议使用交替的洗涤溶液和酒精进行三次连续洗涤，以实现无菌技术。

2.关节内注射

1. 在整个过程中将豚鼠置于仰卧位。
2. 戴上一副新的无菌手套，触诊膝关节。
   注:在介绍的协议和视频中，使用了高压灭菌的丁腈手套。无菌手套，包括高压灭菌丁腈手套或外科手套，应用于无菌技术。
3. 手动将膝盖弯曲至 90°。
4. 将手指移至髌骨远端，通过弯曲和伸展后肢来定位关节空间远端的凹槽。
   注意:在这个位置可以触及髌骨，作为一个小而坚固的结构，位于关节空间的正上方。胫骨可以感觉到是髌骨远端的骨骼结构。一旦确定了胫骨和髌骨的位置，就感觉到像凹槽一样的关节位于它们之间，位于髌骨远端和胫骨近端。
5. 小心地将胰岛素针插入关节间隙内髌骨远端的中线。针头应插入皮肤下方 1-2 毫米处，以进入关节空间。
   注意:膝关节屈曲时关节空间的最大通路窗位于肢体前方的中线，直接位于髌骨远端。在前后方向的中线注射将有助于准确注射到关节空间，而不会穿透骨骼结构。可以使用外侧到内侧的方法准确注射到关节空间，尽管通路窗口更窄，尤其是当膝关节弯曲时。
6. 将 50 μL 溶液缓慢注入关节。确保针头易于插入，并且内容物注射时没有阻力。
   注意: 确保不要将针头插入太深，因为它会导致关节或骨骼损伤，并导致不必要的炎症和/或疼痛。如果找不到与关节间隙相对应的凹槽，针头可能会穿透股骨、髌骨或胫骨。因此，自信地触诊与关节空间相对应的凹槽是有益的，以防止关节周围注射或与穿透骨骼结构相关的损伤。如果在皮肤下的注射部位出现气泡，则说明注射太浅，液体已进入皮下空间。根据所用药物的性质，药物可能通过扩散进入关节空间，或者可能需要再次注射尝试。
7. 完成后，将针头丢弃到锐器箱中。
   注意:出于练习和训练目的，将含有染料的液体注射到类似大小的啮齿动物或豚鼠的尸体的关节空间中。然后，解剖关节以确认注射的位置。
8. 通过弯曲和伸展关节几次来按摩膝盖，促进药物在关节空间内的扩散。
9. 用1x PBS溶液在对侧肢体上重复步骤2.1-2.5一次。

3. 关节内注射恢复

1. 关闭异氟醚并保持 100% 的氧气流动，直到动物恢复意识。
2. 将动物放在加热垫上以获得热支持，直到可以走动。
3. 用纸巾作为屏障，将冰袋放在膝盖上 30 秒，以帮助减少注射引起的肿胀。
4. 在将动物送回饲养所之前，评估动物走动时的步态。
   注意:如果发现任何步态异常，可能需要镇痛药和支持性护理。建议在麻醉恢复后几个小时再次评估他们的步态，以确保正常的活动能力。

4. 显微计算机断层扫描（μCT）扫描

1. 对于组织收获，用 100% 氧气和 5% 异氟烷混合物建立手术麻醉平面。
2. 确认手术麻醉平面，对脚趾捏刺激没有反应。根据机构政策和批准的动物使用方案 ，通过 静脉注射 ≥ 150 mg/kg 戊巴比妥对动物进行人道安乐死。
   注意:在提出的方案中，五只豚鼠中的每只都接受了双膝注射一次。动物在注射后一周被麻醉并人道地安乐死。
3. 通过将皮肤从周围的肌肉组织解剖出来收获两个后肢。
4. 接下来，在股骨中轴和踝关节近端用 Rongeurs 分离后肢。
   注意:使用的扫描床和标本架无法容纳成年豚鼠的整个后肢。大型试样夹具在市场上可用于较大的试样尺寸。
5. 将组织置于中性缓冲福尔马林溶液中72小时进行固定，然后再进行μCT。
6. 打开 μCT 扫描软件，将含有福尔马林的样本放入兼容的容器中，该容器将适合 μCT 样本文件夹，同时将组织保持在视野中。
7. 根据制造商的建议校准 μCT 机器的暗场和明场暴露。
8. 用 Al+Cu 滤光片扫描 18 μm 的样品。使用旋转步长 0.7° 进行 360° 偏移相机。
   注意:扫描会自动保存。

5. 用于评估骨骼微观结构参数的图像处理

1. 下载并安装μCT重建软件，用于μCT图像的重建。
2. 选择软件文件夹，然后双击以打开软件。
3. 通过单击图像切片，从 μCT 图像中选择一个切片。
4. 选择重建文件目标。选择 "浏览 "并创建一个名为"Recon"的新文件夹。所选的文件格式应为 BMP（8）。
5. 检查 错位补偿。
   注意:通常，估计值接近正确，但可以手动调整它以移动重叠图像，以便左右边缘尽可能对齐。
6. 在 "设置"下，应用 "平滑"、"光束硬化"、"CS 旋转"和" 环形伪影" 算法。
   注意:在重建之前，选择预览图像以确定清晰度可能会有所帮助。微调设置还有助于确定哪些设置是最佳的。
7. 选择" 开始 "以开始处理重建。

6. 从重建图像中收集微建筑数据

1. 下载并安装 Dataviewer。
2. 选择 VOI 并将样品定向为垂直对齐，以便于以后进行分析。
3. 将编辑后的 VOI 另存为新文件夹。
4. 下载并安装CTAnalyser，用于微结构参数的骨骼特性分析。
   注意:CTAnalyser 的免费版本功能有限，因此建议获取完整许可证。
5. 通过将软骨下板和小梁骨另存为单独的图像范围，将分析拆分为软骨下板和小梁骨。
   注意:没有必要拆分分析，但由于软骨下板和小梁骨具有不同的特征，因此单独的分析可以帮助进行稳健的测量和比较。
6. 选择要分析的图像范围，从软骨下板开始，方法是单击要开始的图像切片。
7. 通过单击"感兴趣区域"选项卡，为每个图像选择感兴趣的区域，以确保它包含骨骼。
8. 选择" 二进制选择 "选项卡。调整直方图，使背景和骨骼完全分开。
9. 选择 "骨矿物质密度 （BMD）" 选项卡。将该数据保存到新的分析数据文件夹中。
10. 选择 "自定义处理 "，然后转到" 内部 "选项卡。
11. 首先执行 阈值并 选择 自动 Otsu，然后选择 运行。
12. 然后选择" 消除斑点 "并选择" 删除黑色斑点"，然后选择" 运行"。
13. 重复" 去斑 点"，然后选择" 移除白色斑点"，然后选择" 运行"。
14. 选择 3D 分析 ，然后选择 基本值 和 附加值。
15. 重复步骤 6.2.2-6.4.5 以重置用于骨小梁分析的图像。
    注意:确保输出文件位于新文件夹中，该文件夹与 BMD 数据具有相同的文件。

结果

在对活体动物进行关节内注射之前，在三具大鼠尸体上实施上述方案，以确保正确的注射位置。在练习过程中，使用上述方法将 50 μL 70% 新的亚甲蓝染料注射到双侧膝关节中。这相当于六次练习注射。注射后，通过切开关节空间的颅方面、髌骨远端和髶韧带来解剖膝关节，以可视化关节空间并验证染料沉积的位置。由于新的亚甲蓝染料是一种亮蓝色溶液，因此可以粗略地看到染料沉积的位置。尸?...

讨论

尽管最近在 OA 的对症治疗方面取得了进展，但完全缺乏预防 OA²⁴ 发作或延缓进展的治疗药物。目前，严重骨关节炎的唯一治疗方法是关节置换术，这种关节置换术成本高、侵入性强，并可能导致患者发病和死亡²⁵.因此，迫切需要继续对骨关节炎动物模型进行研究，并持续开发新型疗法。有几种动物模型可用于研究 OA 的不同成分，包括自发模型和化学或手术诱?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	sterilizing agent
3D.SUITE software	Bruker		μ-CT analyzing software
Betadine Surgical Scrub	Avrio Health	67618-151-16	sterilizing agent
Insulin syringe with needle	Ulticare	91008	to perform injections
Isoflurane	Piramal	803249	anesthesize animal
Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	23-427098	Fix tissue
Nrecon Software	Bruker		μ-CT reconstruction software
Phosphate Buffered Saline	Cytiva	SH30258.01	control and diluting agent
SkyScan 1176	Bruker		to scan samples