관절 내 주입 후 노화된 Dunkin-Hartley 기니피그의 무릎에 대한 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석

요약

Dunkin-Hartley 기니피그는 골관절염 연구를 위한 확립된 동물 모델입니다. 이러한 연구는 새로운 약제를 조사하거나 질병을 치료하는 등 다양한 이유로 관절 내 주사의 이점을 얻을 수 있습니다. 기니피그에서 관절 내 무릎 주사를 위한 방법론과 관절염 관련 무릎 변화를 평가하는 후속 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석을 설명합니다.

초록

이 프로토콜의 목적은 연구자들이 기니피그에서 관절 내 무릎 주사의 촉진 유도 기술을 수행하고 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 평가하도록 안내하는 것입니다. Dunkin-Hartley 기니피그는 무릎에 자발적으로 골관절염이 발생하기 때문에 골관절염 연구를 위한 강력한 모델입니다. 관절 내 약물 전달은 in vivo 임상시험용 약물의 효과를 연구하는 일반적인 방법입니다. 인간의 경우, 관절 내 주사를 통해 투여하는 치료제는 통증을 완화하고 골관절염의 추가 진행을 지연시킬 수 있습니다. 다른 종과 마찬가지로 관절 공간에 바늘을 삽입하면 부상을 입을 가능성이 있으며, 이로 인해 통증, 절름발이 또는 감염이 발생할 수 있습니다. 이러한 부작용은 동물 복지를 저해하고, 연구 결과를 혼란스럽게 하며, 연구 목표를 달성하기 위해 추가 동물을 필요로 할 수 있습니다. 따라서 합병증을 예방하기 위해 적절한 주입 기술을 개발하는 것이 필수적이며, 특히 여러 번의 반복적인 관절 내 주사가 필요한 종단 연구에서는 더욱 그렇습니다. 제시된 방법을 사용하여 5마리의 기니피그는 전신 마취 하에 양측 무릎 주사를 받았습니다. 주사 7일 후, 골관절염의 중증도를 분석하기 위해 동물을 인도적으로 안락사시켰다. 마취 또는 무릎 주사 후 절뚝거림, 통증 또는 감염을 포함한 부작용이 발생하지 않았습니다. 무릎의 X선 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석은 골관절염과 관련된 병리학적 변화를 감지할 수 있습니다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 데이터에 따르면 골관절염은 나이가 들면서 골밀도와 섬유주 두께가 증가하는 것으로 나타난 동물에서 더 심각합니다. 이러한 결과는 조직학적 변화 및 Modified Mankin 점수와 일치하며, 이는 동일한 동물에서 관절염 중증도를 평가하기 위해 확립되고 널리 사용되는 점수 시스템입니다. 이 프로토콜은 기니피그에서 관절 내 주사를 정제하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

골관절염(OA)은 3,250만 명의 미국 성인에게 영향을 미칩니다. 관절 연골의 점진적인 손실, 관절 안팎의 경미한 염증, 골종(osteophytes) 및 뼈 낭종(bone cysts)의 형성에 의해 발생한다 ^1,2. 증상은 일반적으로 질병의 말기에 나타나며, 현재의 치료법은 완화적 완화만 제공할 뿐 아니라 전신 부작용도 있습니다. 질병 변형 약물의 부족은 질병의 근본적인 메커니즘에 대한 이해가 부족하기 때문에 발생한다³. 그 결과, 골관절염을 치료하기 위해 개선된 약제에 대한 중요하고 지속적인 의학적 필요성이 있습니다.

골캉염의 여러 동물 모델을 통해 질병 과정의 다양한 구성 요소를 검사할 수 있다⁴. 전방십자인대의 절제술과 내측 반월상 연골의 불안정화를 포함한 여러 수술 모델이 존재하지만, 이는 침습적이며 높은 수준의 기술적 기술을 필요로 한다⁵. 화학적으로 유도된 모델은 골관절염 통증 기전을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 비교적 덜 침습적인 시술이다⁶. 이러한 널리 사용되는 마우스 모델 중 하나는 요오드화나트륨(MIA)의 관절 내 무릎 주사에 의한 OA 유도와 관련이 있습니다. 이 모델은 MIA 투여량을 변경하여 등급을 매길 수 있는 재현 가능하고 견고하며 빠른 통증과 유사한 표현형을 생성합니다⁷. 이 모델을 유도하는 기술적 세부사항은 이전에 설명되었다⁷. 이 기술을 기니피그와 같은 더 큰 설치류로 번역하는 것은 해부학적 차이로 인해 어렵습니다. 몇 가지 차이점으로는 기니피그에서 인접한 뼈와 관절 공간을 둘러싼 근육 조직이 증가하고, 생쥐⁸에서 볼 수 있는 원위 유합술과 비교하여 관절 비골과 경골이 증가한다는 것이 포함된다. 널리 사용 가능한 기니피그 균주인 Dunkin-Hartley 기니피그는 자연적으로 이 질병이 발병하기 때문에 확립된 OA 동물 모델이며, 따라서 관절 내 주사로 투여되는 새로운 치료제가 질병 진행에 미치는 영향을 조사하기 위한 강력한 모델을 제공한다⁹. Dunkin-Hartley 기니피그는 생후 3개월에 골관절염이 발병하기 시작하며, 수컷은 발육이 가속화되고 표현형이 더 심하다¹⁰. 기니피그에서 골관절염은 나이가 들면서 진행되며, 12개월이 되면 영상에서 관련 병리가 뚜렷하게 나타난다¹¹. Dunkin-Hartley 모델과 같은 자발적 골관절염 모델은 골관절염을 유도하기 위한 개입이 필요하지 않으므로 인간에서 질병 표현형의 발달 및 진행을 요약하여 강력한 번역 모델^{(translational model)10}을 제공한다. 더욱이, 골관절염의 자발적인 발달은 새로운 치료법이 주어진 동물의 한쪽 무릎에 일방적으로 투여될 때 내부 통제를 가능하게 합니다. 이러한 내부 통제는 데이터를 분석할 때 동물 간 변동성의 영향을 최소화하고 전체 동물 수를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.

X선 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 분석은 골관절염 중증도¹²를 정량적으로 평가할 수 있는 강력한 도구입니다. μCT는 회전 샘플 또는 회전 X선 소스 및 검출기(¹³)에서 얻은 여러 고해상도 X선 이미지를 스캔하는 것을 포함합니다. 그런 다음, 3차원(3D) 체적 데이터는 적층된 이미지 슬라이스(¹⁴)의 형태로 재구성된다. 광물화된 뼈는 μCT에서 우수한 대비를 갖기 때문에 이 양식은 3D 특징을 평가하고 OA^15,16,17과 관련된 변화에 대한 정량 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. μCT는 조직 병리학 및 보행 분석을 포함하여 널리 사용되는 도구에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 조직의 한 부분 또는 몇 개의 조직학적 평가와 달리, μCT는 전체 관절을 스캔하고 골관절염 병변에 대한 보다 전체적인 평가를 제공한다¹⁸. 보행 분석은 시간이 지남에 따라 관절 기능의 증상적 변화를 식별할 수 있지만, 관절 변화는 골관절염과 관련된 기능적 변화보다 훨씬 전에 발생합니다. μCT는 파행이 시작되기 전에 골관절염 발병에 대한 보다 민감한 측정을 제공할 수 있습니다. 특히 관련성이 높은 두 가지 정량적 측정에는 골밀도와 섬유주 두께가 포함되며, 둘 다 OA^19,20의 진행에 따라 증가합니다. 분석을 연골하판(subchondral plate)과 섬유주골(trabecular bone)로 나누는 것이 도움이 될 수 있는데, 이들은 서로 다른 특징을 가지고 있기 때문에 보다 강력한 측정 및 비교를 달성하기 위해 도움이 될 수 있습니다.

이 방법의 전반적인 목표는 연구자들이 기니피그에서 관절 내 주사를 성공적으로 수행할 수 있도록 돕는 것입니다. 제시된 프로토콜은 5개월된 온전한 수컷 Dunkin-Hartley 기니피그를 사용했습니다. 시술은 관절 내 무릎 주사가 필요한 다른 기니피그 균주 및 연령으로 추정할 수 있습니다. Dunkin-Hartley 모델과 같은 골관절염의 자발적 모델에서는 질병 진행 및 연속적인 치료에 대한 반응이 종종 몇 주에서 몇 개월에 이르는 장기간에 걸쳐 모니터링됩니다⁹. 이 확장된 프로토콜은 여러 관절 내 주사를 초래하므로 통증, 절뚝거림 또는 감염을 포함한 부작용을 예방하기 위해 적절한 주입 기술을 갖추는 것이 중요하며, 이 모든 것은 동물 복지에 영향을 미치고 연구 결과를 혼란스럽게 할 수 있으며 연구에 추가 동물이 필요할 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 기니피그에서 관절 내 주사의 방법론과 μCT 데이터의 후속 분석을 설명합니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 사우스캐롤라이나 의과대학의 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 이 연구는 3R의 원칙을 따랐습니다.

1. 관절 내 주사 제제

1. Dunkin-Hartley 기니피그가 실험을 시작하기 최소 일주일 전에 시설에 적응하도록 합니다.
   참고: 5-(n=2), 9-(n=1) 및 12-(n=2) 개월 된 수컷 기니피그가 사용되었습니다. 남성은 OA의 발달이 가속화되고 더 심각한 표현형을 보입니다.
2. 전기 면도기로 무릎 부분을 면도하십시오.
   알림: 젖꼭지를 내측으로 조심하십시오.
3. _O2 혼합물(유속 2.5L/min)에 3-5% 이소플루란을 전달하는 이소플루란 챔버에서 기니피그를 마취한 다음 기니피그를 비호흡 마취 회로에 연결된 노즈콘으로 옮깁니다. 일반적으로 0.5-1 L/min 및 1-3% 이소플루란의 산소 유속으로 주사 중 수술 마취면을 유지하기 위해 이소플루란을 조정합니다.
   참고: 관절 내 주사는 경미하고 일시적인 통증을 유발합니다. 고통스러운 자극에 대한 인식을 방지하고 주입 정확도를 향상시키기 위해 시술 중에 동물을 마취합니다. 제시된 연구에서 비스테로이드성 항염증제를 포함한 진통제의 투여는 골관절염 진행을 방해할 수 있다²¹. 순간적인 통증, 마취 및 진통제가 모델을 혼란스럽게 할 가능성이 있기 때문에 동물이 주사 후 절뚝거림과 관절 촉진 시 통증 징후를 포함한 부작용을 보이지 않는 한 진통제를 투여하지 않았습니다. 조사관은 일상적인 주사에 진통제의 사용을 고려해야 합니다. 진통제는 부작용이 발생했을 때 권장됩니다. 진통제 요법은 연구를 시작하기 전에 기관 수의사와 논의하고 IACUC의 승인을 받아야 합니다.
4. 기니피그가 발가락 꼬집음 반응이 없어 적절한 마취 깊이에 있는지 확인하십시오.
5. 건조와 부상을 방지하기 위해 양쪽 눈에 멸균 안구 윤활제를 바릅니다.
6. 베타딘을 멸균수로 10%로 희석합니다.
7. 200 프루프 에탄올을 멸균수로 70% 에탄올로 희석합니다.
8. 멸균 상태를 유지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 주입할 용액을 준비합니다. 제시된 프로토콜에서는 멸균 차량(1x 인산염 완충 식염수)을 사용하여 양쪽 무릎을 주입했습니다. 솔루션은 연구 목표에 따라 변경될 수 있습니다.
   알림: 멸균을 보장하기 위해 주입 세션 직전에 주입을 위해 새 용액을 희석해야 합니다. 사용하지 않는 용액은 각 주입 세션이 끝날 때 폐기해야 합니다.
9. 멸균 일회용 인슐린 주사기에 주입용 용액을 채웁니다. 조인트 공간에 볼륨이 과도하게 쌓이지 않도록 달성할 수 있는 가장 작은 볼륨을 활용하도록 주의하십시오. 본 연구에서는 50μL를 사용하였다.
10. 기니피그와 노즈콘을 열 지지용 가열 패드가 있는 깨끗한 표면에 놓고 머리 아래에 패딩을 넣어 약간 들어 올립니다.
11. 수술 가운, 헤어 네트, 멸균 장갑 및 마스크를 착용하고 주사 절차를 수행합니다.
12. 면봉에 베타딘 10%를 붓고 양쪽 무릎 부위를 닦아냅니다.
13. 면봉에 70% 에탄올을 붓고 양쪽 무릎 부분을 닦습니다.
14. 1.12와 1.13을 두 번 더 반복합니다.
    참고: 데모를 위해 해당 비디오는 10% 베타딘과 70% 에탄올로 무릎과 주사 부위를 한 번 청소하는 것을 보여줍니다. 주입 부위는 이후 원형 운동을 두 번 더 사용하여 이러한 용액을 번갈아 가며 청소했습니다. 무균 기술을 달성하기 위해 스크럽 용액과 알코올을 번갈아 사용하는 3번의 연속 스크럽이 권장됩니다.

2. 관절 내 주사

1. 절차 전체를 위해 기니피그를 누운 자세로 놓습니다.
2. 새 멸균 장갑을 착용하고 무릎 관절을 촉진합니다.
   참고: 제시된 프로토콜 및 비디오에서는 오토클레이브 니트릴 장갑이 사용되었습니다. 고압멸균 니트릴 장갑 또는 수술용 장갑을 포함한 멸균 장갑은 무균 기술에 사용해야 합니다.
3. 수동으로 무릎을 90°로 구부립니다.
4. 손가락을 슬개골 원위부로 이동하여 뒷다리를 구부리고 펴서 관절 공간의 원위부 측면의 홈을 찾습니다.
   참고: 슬개골은 이 위치에서 관절 공간 바로 위에 위치한 작고 단단한 구조로 촉진될 수 있습니다. 경골은 슬개골 원위부에 있는 뼈 구조로 느낄 수 있습니다. 경골과 슬개골의 위치가 결정되면 홈으로 느껴지는 관절은 그 사이에 있으며 슬개골의 원위부와 경골의 근위부에 있습니다.
5. 인슐린 바늘을 관절 공간 내 슬개골 원위부의 정중선에 조심스럽게 삽입합니다. 바늘은 관절 공간으로 들어가기 위해 피부 아래 1-2mm에 삽입해야 합니다.
   참고: 무릎을 구부린 상태에서 관절 공간을 위한 가장 큰 접근 창은 슬개골 바로 원위인 정중선에서 사지의 전방에 있습니다. 전방에서 후방 방향으로 정중선에 주입하면 뼈 구조를 관통하지 않고 관절 공간에 정확하게 주입하는 데 도움이 됩니다. 관절 공간에 정확하게 주입하는 것은 외측에서 내측으로의 접근 방식을 사용하여 달성할 수 있지만 특히 무릎을 구부릴 때 접근 창이 더 좁습니다.
6. 용액 50μL를 관절에 천천히 주입합니다. 바늘이 쉽게 삽입되고 내용물이 저항 없이 주입되는지 확인하십시오.
   알림: 관절이나 뼈 손상을 일으키고 원치 않는 염증 및/또는 통증을 유발할 수 있으므로 바늘을 너무 깊게 삽입하지 마십시오. 관절 공간에 해당하는 홈이 발견되지 않으면 바늘이 대퇴골, 슬개골 또는 경골을 관통할 수 있습니다. 따라서 관절 공간에 해당하는 홈을 자신 있게 촉진하여 관절 주위 주사 또는 뼈 구조를 관통하는 것과 관련된 부상을 예방하는 것이 좋습니다. 피하의 주사 부위에 기포가 생기면 주입이 너무 얕아 액체가 피하 공간에 들어가 버린 것입니다. 사용된 약제의 특성에 따라 약물이 확산을 통해 관절 공간으로 들어가거나 다른 주입 시도가 필요할 수 있습니다.
7. 완료되면 바늘을 날카로운 물건 통에 버리십시오.
   참고: 연습 및 훈련 목적으로 염료가 포함된 액체를 비슷한 크기의 설치류 또는 기니피그에서 사체의 관절 공간에 주입하십시오. 그런 다음 관절을 절개하여 주입 위치를 확인합니다.
8. 관절을 몇 번 구부리고 펴서 무릎을 마사지하면 관절 공간 내에서 약물의 확산을 촉진합니다.
9. 2.1x PBS 용액으로 반대쪽 사지에 2.5-1단계를 한 번 반복합니다.

3. 관절 내 주사로부터의 회복

1. 이소플루란을 끄고 동물이 의식을 회복할 때까지 산소로 100% 흐름을 유지하십시오.
2. 보행할 때까지 열 지원을 위해 동물을 가열 패드에 놓습니다.
3. 종이 타월을 장벽으로 삼아 무릎에 얼음 팩을 30초 동안 바르면 주사로 인한 붓기를 줄이는 데 도움이 됩니다.
4. 동물을 주거로 돌려보내기 전에 보행 시 동물의 걸음걸이를 평가하십시오.
   알림: 보행 이상이 발견되면 진통제와 지지 치료가 필요할 수 있습니다. 정상적인 움직임을 보장하기 위해 마취에서 회복된 후 몇 시간 후에 걸음걸이를 다시 평가하는 것이 좋습니다.

4. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 스캔

1. 조직 채취를 위해 100% 산소와 5% 이소플루란 혼합물로 수술 평면을 설정합니다.
2. 발가락 꼬집기 자극에 대한 반응이 없는 수술 마취면을 확인합니다. 기관 정책 및 승인된 동물 사용 프로토콜에 따라 ≥ 150mg/kg의 펜토바르비탈을 정맥 투여 하여 동물을 인도적으로 안락사시킵니다.
   참고: 제시된 프로토콜에서 5마리의 기니피그는 각각 양쪽 무릎에 한 번씩 주사를 맞았습니다. 동물들은 주사 일주일 후에 마취시키고 인도적으로 안락사시켰다.
3. 주변 근육에서 피부를 절개하여 양쪽 뒷다리를 채취합니다.
4. 다음으로, 대퇴골의 중간 축과 발목 근위부에서 Rongeurs로 뒷다리를 분리합니다.
   참고: 사용된 스캐닝 베드와 표본 홀더는 성인 기니피그의 뒷다리 전체를 수용할 수 없었습니다. 대형 시편 홀더는 더 큰 시편 크기에 대해 상업적으로 사용할 수 있습니다.
5. μCT를 수행하기 전에 고정을 위해 조직을 중성 완충 포르말린 용액에 72시간 동안 놓습니다.
6. μCT 스캔 소프트웨어를 열고 포르말린이 함유된 샘플을 μCT 표본 폴더에 맞는 호환 가능한 용기에 넣으면서 시야에서 조직을 유지합니다.
7. 제조업체 권장 사항에 따라 암시야 및 라이트 필드 노출에 대해 μCT 기계를 보정합니다.
8. 18μm에서 Al+Cu 필터로 샘플을 스캔합니다. 오프셋 카메라로 360°를 위해 0.7° 회전 단계를 사용합니다.
   참고: 스캔이 자동으로 저장됩니다.

5. 뼈 미세건축 매개변수를 평가하기 위한 이미지 처리

1. μCT 이미지 재구성을 위한 μCT 재구성 소프트웨어를 다운로드하여 설치합니다.
2. 소프트웨어 폴더를 선택하고 두 번 클릭하여 소프트웨어를 엽니다.
3. 이미지 슬라이스를 클릭하여 μCT 이미지에서 하나의 슬라이스를 선택합니다.
4. 재구성 파일 대상을 선택합니다. 찾아보기를 선택하고 Recon이라는 새 폴더를 만듭니다. 선택한 파일 형식은 BMP(8)여야 합니다.
5. 정렬 불량 보정을 확인합니다.
   참고: 일반적으로 추정치는 정확에 가깝지만 오른쪽 및 왼쪽 가장자리가 가능한 한 가깝게 정렬되도록 겹치는 이미지를 이동하도록 수동으로 조정할 수 있습니다.
6. Settings(설정)에서 Smoothing(스무딩), Beam Hardening(빔 강화), CS Rotation(CS 회전) 및 Ring Artifacts(링 아티팩트) 알고리즘을 적용합니다.
   참고: 재구성하기 전에 선명도를 결정하기 위해 미리보기 이미지를 선택하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 미세 조정 설정은 어떤 설정이 가장 적합한지 결정하는 데도 도움이 될 수 있습니다.
7. 시작을 선택하여 재구성 처리를 시작합니다.

6. 복원된 이미지에서 마이크로아키텍처 데이터 수집

1. Dataviewer를 다운로드하여 설치합니다.
2. VOI를 선택하고 나중에 더 쉽게 분석할 수 있도록 시료를 수직으로 정렬하도록 방향을 지정합니다.
3. 편집한 VOI를 새 폴더로 저장합니다.
4. 마이크로아키텍처 매개변수의 골 특성 분석을 위해 CTAnalyser를 다운로드하여 설치하십시오.
   참고: CTAnalyser의 무료 버전은 기능이 제한되어 있으므로 정식 라이선스를 취득하는 것이 좋습니다.
5. subchondral plate와 trabecular bone을 별도의 이미지 범위로 저장하여 분석을 분할합니다.
   참고: 분석을 분할할 필요는 없지만, 연골하판과 섬유주골은 서로 다른 특징을 가지고 있기 때문에 별도의 분석이 강력한 측정 및 비교에 도움이 될 수 있습니다.
6. 시작하려는 이미지 슬라이스를 클릭하여 subchondral plate부터 시작하여 분석할 이미지 범위를 선택합니다.
7. 각 이미지의 관심 영역을 선택하여 관심 영역 탭을 클릭하여 뼈를 둘러싸고 있는지 확인합니다.
8. 바이너리 선택 탭을 선택합니다. 배경과 뼈가 완전히 분리되도록 히스토그램을 조정합니다.
9. Bone Mineral Density (BMD)(골밀도(BMD)) 탭을 선택합니다. 해당 데이터를 새 해석 데이터 폴더에 저장합니다.
10. Custom Processing(사용자 지정 처리)을 선택하고 Internal 탭으로 이동합니다.
11. 먼저 임계값 설정을 수행하고 Automatic Otsu를 선택한 다음 Run을 선택합니다.
12. 그런 다음 Despeckle을 선택하고 Remove black speckles(블랙 스페클 제거)를 선택한 다음 Run(실행)을 선택합니다.
13. Despeckle(반점 제거)을 반복하고 Remove white speckles(흰색 반점 제거)를 선택한 다음 Run(실행)을 선택합니다.
14. 3D 분석을 선택하고 기본 값과 추가 값을 선택합니다.
15. 6.2.2-6.4.5단계를 반복하여 섬유주 뼈 분석을 위해 이미지를 재설정합니다.
    참고: 출력 파일이 BMD 데이터와 동일한 파일의 새 폴더에 있는지 확인합니다.

결과

살아있는 동물에게 관절 내 주사를 수행하기 전에, 정확한 주입 위치를 보장하기 위해 3개의 쥐 사체에 대해 위의 프로토콜을 실행했습니다. 연습 세션 동안, 위에서 설명한 방법론을 사용하여 50μL의 70% 새로운 메틸렌 블루 염료를 양쪽 무릎 관절에 주입했습니다. 이는 6번의 연습 주사에 해당합니다. 주사 후 무릎 관절을 절개하여 관절 공간의 두개골 측면, 슬개골 원위부, 슬개골 인대를 통해 절?...

토론

골관절염의 증상적 치료의 최근 발전에도 불구하고, 골관절염²⁴의 발병을 예방하거나 진행을 지연시키는 치료제는 완전히 부족하다. 현재 중증 골관절염의 유일한 치료법은 관절 치환술인데, 이는 비용이 많이 들고 침습적이며 환자의 이환율과 사망률을 초래할 수 있다²⁵. 그 결과, 골관절염 동물모델에 대한 지속적인 연구와 새로운 치료제의 지속적인 개발이 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	sterilizing agent
3D.SUITE software	Bruker		μ-CT analyzing software
Betadine Surgical Scrub	Avrio Health	67618-151-16	sterilizing agent
Insulin syringe with needle	Ulticare	91008	to perform injections
Isoflurane	Piramal	803249	anesthesize animal
Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	23-427098	Fix tissue
Nrecon Software	Bruker		μ-CT reconstruction software
Phosphate Buffered Saline	Cytiva	SH30258.01	control and diluting agent
SkyScan 1176	Bruker		to scan samples