Fonte: Jonathan F. Blaize¹, Elizabeth Suter¹, e Christopher P. Corbo^1
1 Departamento de Ciências Biológicas, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301

A avaliação quantitativa dos procariotes pode ser onerosa dada a sua abundância, propensão à proliferação exponencial, diversidade de espécies dentro de uma população e necessidades fisiológicas específicas. Compondo esse desafio, é a natureza de quatro fases em que as bactérias se replicam (lag, log, estacionário e morte). A capacidade de estimar com precisão a concentração de microrganismos é necessária para uma identificação, isolamento, cultivo e caracterização bem-sucedidas (6). Como tal, os microbiologistas têm utilizado diluição serial e várias técnicas de chapeamento por mais de um século para quantificar de forma confiável a carga bacteriana e viral em ambientes clínicos, industriais, farmacêuticos e acadêmicos (2,4,6). Descrições dessa metodologia apareceram pela primeira vez em 1883, quando o cientista e médico alemão Robert Koch publicou seu trabalho sobre agentes causadores de doenças infecciosas (2). Muitas vezes referida como o pai da bacteriologia moderna, as técnicas forenamed de Koch tornaram-se o padrão ouro para a enumeração de microrganismos, culturable ou não, em todo o mundo.

A diluição serial é uma redução sistemática de uma entidade conhecida ou desconhecida (um soluto, organismo, etc.) através da sucessiva re-suspensão de uma solução inicial (solução₀) em volumes fixos de um diluente líquido (em branco). Esses espaços em branco geralmente consistem em 0,45% salino, embora a composição possa ser variada (7). Embora um experimentador possa escolher qualquer volume para cada diluído, é na maioria das vezes um múltiplo de 10, facilitando a redução logarítmica da amostra. Por exemplo, a solução₀ contém um total de 100 células E. coli suspensas em 10 mL de caldo de nutrientes. Se 1 mL de solução₀ for removido e adicionado a 9 mL de soro fisiológico (diluente_1),a nova solução (solução₁) conteria 1/10 da concentração inicial de E. coli. Neste exemplo, a nova solução (solução₁) conteria 10 células E. coli. Repetir este processo removendo 1 mL da solução₁ e adicionando-o a outros 9 mL de soro fisiológico (diluente₂) renderia a solução 2 , contendo_apenasuma única célula E. coli. Uma vez que cada nova solução (9 mL de diluente + 1 mL de solução) contém um total de 10mL, podemos concluir que o fator de diluição para essa redução é de 10 ou que esta foi uma diluição serial de 10 vezes(Figura 1). Como só começamos com 100 células neste exemplo e estamos diluindo por um fator de 10, apenas dois passos são necessários para alcançar a concentração mínima absoluta de 1 célula.

Figura 1: Diluição em série de uma solução de estoque. Uma alíquota de 1 mL da solução de estoque (solução₀) é adicionada ao tubo 1 que contém 9 mL de 0,45% de soro fisiológico (dilent₁); o produto desta mistura é a solução₁. Repita aliquoting 1 mL da solução recém-criada₁ e adicioná-lo ao tubo 2. A aliquotação e a resuspensão continuam desta forma até que o tubo final seja atingido, diluindo a concentração de estoque por um fator de 10 cada um a cada etapa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A diluição serial é a técnica mais simples para obter concentrações gerenciáveis de um organismo desejado e é complementada por listras e espalhamento de placas de petri, apenas duas das muitas técnicas de chapeamento usadas por microbiologistas. Este benefício desta abordagem é que o experimentador pode colher cepas puras de uma única espécie ou separar cepas de uma população mista (7). O streaking é realizado introduzindo um organismo a um meio sólido (geralmente consistindo de agarose) que ele crescerá sobre se os nutrientes apropriados estiverem disponíveis. Varrer suavemente um laço inoculante estéril através do meio (de modo que uma raia sutil permanece) em um rígido padrão sinusoidal irá distribuir o organismo proporcionalmente à frequência da forma de onda do experimentador. Dividir a placa de Petri em terços (raia do quadrante) e diminuir a frequência de cada raia à medida que uma nova região da placa é inserida reduzirá gradualmente o número de microrganismos que podem ocupar aquela região, produzindo colônias únicas em vez de um gramado bacteriano inquantificável. O revestimento disseminador não dilui adicionalmente as amostras; um espalhador de vidro estéril é usado para distribuir uma alíquota de mídia de suspensão através de uma placa de petri inteira(Figura 2). As colônias que crescem na placa de propagação surgem de uma única célula e cada colônia no prato pode ser contada para estimar o número de unidades formadoras de colônias por mililitro (CFU) em uma determinada suspensão, representadas como CFU/mL (6)(Figura 3) Ágar macio e trinagem são variações das técnicas acima mencionadas e permitem o isolamento de bacteriófago e triagem mutante, respectivamente (1,7).

Figura 2: Listramento de placa para enumeração bacteriana e isolamento da tensão. Rotule a parte inferior de uma placa de petri com informações de identificação (nome da bactéria, data, mídia) e divida em terços. Depois de selecionar uma diluição apropriada da amostra de estoque, pegue um laço inoculante estéril (descartável ou inflamado) e submerse-o no tubo de ensaio (aqui, T3). Levante ligeiramente a tampa da placa de petri de um lado para que apenas o laço inoculante possa acessar o ágar. Deslize o laço inoculante através do topo da mídia de uma forma em zig-zag tomando cuidado para não comprometer o ágar. Gire a placa por aproximadamente 1/3^rd (~118°) e reduza a frequência do movimento zig-zag. Gire um tempo final e reduza a frequência em zig-zag mais uma vez. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Espalhe o revestimento. 1 g da zona aeróbica foi resuspended em T1 e, em seguida, diluído em série. Um vidro estéril ou vara descartável de plástico é usado para distribuir inóculo em cada prato. Isso se repetiu com 1 g da zona anaeróbica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como acontece com as diluições seriais, uma escala logarítmica é empregada para expressar a concentração do organismo. O número de colônias cultivadas em placas de petri padrão medindo 100mm x15mm pode ser enumerado manualmente (ou automatizado com o auxílio do processamento computacional) identificando clusters isolados de crescimento. Contagem que totalizam menos de 30 ou mais de 300 devem ser definidas como muito poucos para contar (TFTC) ou muito numerosos para contar (TNTC), respectivamente. No caso deste último, uma diluição seriada deve ser realizada para reduzir a concentração antes de reestilar uma nova placa de petri. A média do número de colônias independentes identificadas a partir de três placas de petri separadas e multiplicando a média pelo fator de diluição produzirá UFC/mL; plotar o registro₁₀ de UFC/mL contra o tempo revelará o tempo médio de geração do organismo (7).

1. Configuração

1. Um fluxograma listando todos os materiais, protocolo experimental stepwise e método para descartar suprimentos deve ser escrito em um caderno de laboratório e mantido perto do espaço de trabalho experimental.
2. Os espaços de trabalho devem ser esterilizados com um antisséptico apropriado (70% de etanol) e o experimentador deve mitigar o risco de contaminação usando roupas de laboratório limpas que também os protegem de anomalias de exposição. Roupas adequadas incluem, mas não se limitam a um jaleco, luvas de látex ou nitríis, googles, respiradores e sapatos fechados. É fundamental manter a técnica asséptica o tempo todo.
3. Prepare 90 mL de 0,45% salina. Utilizando um cilindro graduado limpo, meça 90 mL de água estéril e transfira para um frasco erlenmeyer limpo rotulado 0,45% salino. Pese 0,405 g de cloreto de sódio (Sigma-Aldrich NaCl S9888) e adicione-o ao frasco rotulado 0,45% salino. Redemoinho repetidamente até que nenhum soluto permaneça visível.
4. Após a conclusão, o experimentador deve reestrucionar todas as superfícies e descartar quaisquer organismos indesejados, estoques diluídos, placas de petri ou laços inoculantes descartáveis de acordo com as diretrizes da OSHA. As roupas de laboratório podem ser removidas antes de lavar as mãos.

2. Preparação de mídia

1. Selecione mídias apropriadas para o cultivo de um organismo desejado. Na maioria dos cenários, um caldo permitiria um crescimento bacteriano suficiente. Uma vez que organismos de um protocolo winogradsky são desejados aqui, uma coluna composta de carbonato de cálcio, enxofre, celulose e lama foi montada e deixada intacta por 7 dias. A coluna forenamed é separada em seções aeróbicas, microaerófilas e anaeróbicas.
2. Escolha um meio apropriado para emplacamento do organismo de interesse. A suplementação de mídia líquida com ágar de grau microbiológico é tipicamente empregada como agente solidificador. O meio/ágar LB é suficiente na coleta de amostras de regiões aeróbicas, microaerófilas e anaeróbicas da coluna forenamed. Nota: As amostras da região microaerófila não foram colhidas para este procedimento. No entanto, esses organismos devem ser cultivados em frascos de velas. Introduzir uma vela nesta câmara de cultivo antes de selar cria um ambiente de baixo oxigênio adequado para a proliferação microaerófila.
3. Já que desejamos preparar 250 mL, use frascos erlenmeyer de 500 mL (ou maiores) para evitar a fervura ao se autoclavar. Rotule um "Caldo" e o outro "Agar".
4. Determine a quantidade de mídia necessária para criar cada solução seguindo as recomendações de concentração do fabricante. LB Agar, usado aqui, é preparado combinando 25g/L com água ultrapura. Nosso volume de 250 mL requer uma solução de 6,25 LB Agar/250 mL de água. Da mesma forma, o caldo LB é preparado combinando a mesma proporção de caldo LB e água. Como não é complementado com um agente solidificador, não endurecerá quando resfriado.
5. Pese a mídia e misture-a com água em proporções consistentes com as recomendações do fabricante. Adicione 6,25g de LB Agar a um frasco rotulado de "Agar", e 6,25g de caldo LB a um frasco rotulado de "Caldo". Adicione 250 mL de água ultrapura a cada frasco.
6. Enrole a folha de alumínio sobre cada frasco e use uma autoclave para esterilizar a mídia por um mínimo de 15 minutos a 121°C, 15 psi.
7. Usando uma luva ou almofada resistente ao calor, remova os frascos da autoclave quando o ciclo estiver completo e coloque-os em um banho de água de 40-50°C.
8. Uma vez alcançada a temperatura apropriada, despeje o conteúdo do frasco rotulado "Caldo" em um Erlenmeyer de 250 mL, ou frasco de fundo redondo. Rotule o frasco de 250 mL "solução_0".
9. Obtenha placas de petri estéreis de 10, 100mm x 15 mm e rotulá-las com a data, nome, o tipo de mídia utilizada e a zona de coluna winogradsky da qual os organismos serão colhidos.
10. Retire o frasco rotulado de "Agar" do banho de água e comece a derramar em cada uma das 10 placas de petri. Não mais do que 15 mL deve ser adicionado a cada prato. Isso também pode ser realizado com um pipettor e uma pipeta sorológica de 25 mL para melhorar a precisão. Use uma ponta de pipeta estéril para remover as bolhas presentes e, em seguida, cubra com as tampas da placa e deixe solidificar durante a noite.

3. Preparação diluída

1. Prepare dez tubos de ensaio capazes de armazenar 20 mL ou mais em um rack e rotule-os de T1-T10. Cada número de tubo é consistente com o fator de diluição a que corresponde (ou seja, T4 = 1x10^-4 ou 0,0001 ou 1/10.000º da concentração de estoque).
2. Pipet 9 mL de 0,45% salina em cada um dos 10 tubos de ensaio.
3. Os espaços salinos estão prontos para serem esterilizados por autoclave. Use papel alumínio para cobrir cada um dos 10 tubos de ensaio e, em seguida, transfira-os para um rack de tubo de ensaio compatível com autoclave. Esterilize por um mínimo de 15 minutos a 121°C, 15 psi.
4. Remova os espaços em branco usando luvas resistentes ao calor e deixe esfriar. Cubra e armazene a 4°C até que seja necessário quando os tubos atingirem a temperatura ambiente, ou quando esfriar ao toque.

4. Cultivo de Organismo Alvo

1. Inocular "solução_0"com uma única colônia de uma placa anteriormente listrada ou 50 μL de um estoque congelado. Permita que o organismo alvo se replique colocando a "solução_0"inoculada em uma incubadora de 37°C durante a noite com agitação (se necessário). (Nota: O frasco deve ser coberto para evitar contaminação. Se o organismo alvo for aeróbico, use gaze estéril e tampões de algodão para evitar contaminação. Se avaliar regiões da coluna Winogradsky, basta remover 1 grama de cada zona desejada (aeróbica e anaeróbica para efeitos deste estudo) e resuspend em T1 antes de prosseguir para a etapa 5.3.

5. Diluição em série

1. Obtenha o frasco rotulado de "Caldo de nutrientes" da incubadora e agite vigorosamente.
2. Pipet 1 mL de "solução_0"no tubo de ensaio rotulado T1. Vórtice T1. Se avaliar as explantas winogradsky, pese 1 grama da zona desejada e adicione-a ao T1 antes do vórtice. (Nota: 1 mL é usado aqui para a simplicidade- volumes menores ou maiores de diluente também podem ser usados).
3. Remova 1 mL do tubo de ensaio T1 e adicione-o ao tubo de ensaio T2. Vórtice T2.
4. Remova 1 mL do tubo de ensaio T2 e adicione-o ao tubo de ensaio T3. Vórtice T3.
5. Remova 1 mL do tubo de ensaio T3 e adicione-o ao tubo de ensaio T4. Vórtice T4.
6. Remova 1 mL do tubo de ensaio T4 e adicione-o ao tubo de ensaio T5. Vórtice T5.
7. Remova 1 mL do tubo de ensaio T5 e adicione-o ao tubo de ensaio T6. Vórtice T6.
8. Remova 1 mL do tubo de ensaio T6 e adicione-o ao tubo de ensaio T7. Vórtice T7.
9. Remova 1 mL do tubo de ensaio T7 e adicione-o ao tubo de ensaio T8. Vórtice T8.
10. Remova 1 mL do tubo de ensaio T8 e adicione-o ao tubo de ensaio T9. Vórtice T9.
11. Remova 1 mL do tubo de ensaio T9 e adicione-o ao tubo de ensaio T10.

6. Espalhar revestimento

1. Pipet 100 μL de uma amostra diluída de T1 diretamente em uma placa de petri. Este passo pode ser, mas não precisa ser repetido para cada tubo.
2. Obtenha uma haste estéril e descartável ou uma chama esterilize uma haste de vidro. Em um movimento no sentido horário/anti-horário, deslize a porção horizontal da haste de propagação para distribuir igualmente a amostra dentro da placa de petri.
3. Repita para cada região da coluna Winogradsky que deve ser avaliada.
4. Incubar placas em uma incubadora de 37°C por 24 horas. Para organismos anaeróbicos, use uma câmara anaeróbica.

7. Streaking

1. Selecione uma diluição apropriada do seu organismo alvo. Por exemplo, a solução₄ produzirá uma diluição de 1/10.000 da sua concentração inicial. Normalmente, diluições de 1/1.000^th (T3/Solution), 1/1.000.000^th (T6/Solution₆) e 1/1.000.000.000^th (T9/Solution₉) são avaliadas para micróbios enumerados.
2. Usando um laço de inoculação descartável plástico ou um laço de inoculação de metal reutilizável que está sob fogo há pelo menos 10 segundos, mergulhe na solução desejada a partir do passo 5. Os loops de inoculação calibrados devem transferir 0,01 mL. (Cuidado: Não permita que o laço flamede entrar em contato com bactérias imediatamente após a remoção do calor)
3. Levante ligeiramente a tampa da placa de petri de um lado para que apenas o laço inoculante possa acessar o ágar. Deslize o laço inoculante através do topo da mídia de uma forma em zig-zag tomando cuidado para não comprometer o ágar. Abaixe a tampa da placa de petri.
4. Use um novo laço de inoculação descartável ou reesterirei seu loop reutilizável.
5. Gire a placa por aproximadamente 1/3^rd (~118°) e reduza a frequência do movimento zig-zag.
6. Novamente, use um novo laço descartável ou reesterirei uma alça metálica antes de girar um tempo final e reduzir a frequência em zig-zag mais uma vez. Abaixe a tampa da placa de petri.
7. Repetição de passos 7.2 - 7.6 até que pelo menos três placas de petri tenham sido listradas para três diluições diferentes, usando um novo laço descartável ou re-flamejando um loop reutilizável(Figura 2).
8. Coloque pratos de petri listrados em uma incubadora de 37°C durante a noite. Para organismos anaeróbicos, use uma câmara aeróbica.

8. Análise e Resultados de Dados

1. As culturas foram colhidas das zonas oxica e anoxica de uma coluna winogradsky de 7 dias. Estas zonas são adequadas para anaeróbios heterotróficos e oxidantes de ferro, respectivamente.
2. As explantas da coluna foram diluídas em série antes de listrar ou se espalhar em placas LB Agar.
3. Streaking revelou uma população mista de cada uma das zonas de Winogradsky avaliadas. As placas de difusão produziram resultados semelhantes.
4. Para calcular CFU/mL ou UFC/g, é média o número de colônias contadas a partir de três placas. Multiplique o número médio de colônias pelo fator de diluição e divida pela quantidade alitada. Por exemplo, se uma média de 65 colônias fosse contada em placas inoculadas com 0,1 mL de solução₆ (T6) a fórmula descrita anteriormente seria igual a 650.000.000 UFC/mL.
5. Colônias isoladas agora podem ser escolhidas de cada placa para uso em ensaios de enriquecimento para determinar a identidade das espécies.

Enumeração bacteriana e isolamento da tensão por chapeamento requer concentrações gerenciáveis de organismos alvo. O revestimento bem sucedido depende, portanto, da diluição serial. Como tal, as técnicas supracitadas continuam a ser a pedra angular do exame microbiológico e da experimentação. Embora simples pelo design, fatores de diluição e técnica de chapeamento podem ser modificados pelo experimentador para reforçar os resultados sem comprometer a integridade de cada método. Traçar as quatro fases do crescimento bacteriano pode ser útil ao caracterizar micróbios desejados. Essas fases, lag, log, estacionárias e morte, são marcadas por mudanças na replicação bacteriana. A fase de defasagem apresenta crescimento lento devido à adaptação fisiológica, a fase de registro é o período de proliferação máxima com um aumento exponencial de células viáveis, a fase estacionária é então alcançada devido a limitações ambientais e acúmulos de toxinas, antes da fase de morte onde as contagens de células começam a cair. Isso pode ser feito diluindo em série (ou diluindo 1 passo para evitar confusão) Solução₀ a cada hora por um total de 8 horas, começando no Time₀ (a Solução₀ deve ser devolvida a uma incubadora de agitação após cada diluição). Calcule o registro₁₀ de CFU/ml para um único diluente do Tempo₀ e plote no eixo Y. Repita este cálculo para a amostra Tempo₁ (certifique-se de calcular CFU/mL usando o mesmo fator de diluição que o Tempo₀). Repita até que cada vez (Hora₁-Tempo₈) sejam plotados no eixo X.

1. Allen, M.E., Gyure, R.A. (2013) An Undergraduate Laboratory Activity Demonstrating Bacteriophage Specificity. Journal of Microbial Biological Education 14: 84-92.
2. Ben-David, A., Davidson, C.E. (2014) Estimation Method for Serial Dilution Experiments. Journal of Microbiological Methods 107:214-221.
3. Goldman, E., Green, L.H. (2008) Practical Handbook of Microbiology.
4. Koch, R. (1883) New Research Methods for Detection of Microcosms in Soil, Air and Water.
5. Lederberg, J., Lederberg, E.M. (1952) Replica Plating and Indirect Selection of Bacterial Mutants. Journal of Bacteriology 63:399-406
6. Pepper, I., Gerba, C., Ikner, L. (2019) Bacterial Growth Curve Analysis and its Environmental Changes. JoVE Science Education Database. Environmental Microbiology.
7. Sanders., E.R. (2012) Aseptic Laboratory Technique: Plating Methods. JoVE 63:e3063.