1. Configurar

1. Ao manusear microrganismos, é necessário seguir uma boa prática microbiológica. Todos os microrganismos, especialmente amostras desconhecidas, devem ser tratados como patógenos potenciais. Siga a técnica asséptica para evitar contaminar as amostras, pesquisadores ou o laboratório. Lave as mãos antes e depois de manusear bactérias, use luvas e use roupas de proteção.
2. Realizar uma avaliação de risco para o protocolo experimental para o isolamento genômico de DNA e purificação do produto PCR. Alguns reagentes podem ser prejudiciais!
3. A cultura pura é essencial para o sequenciamento de rRNA 16S. Antes de proceder ao isolamento do DNA genômico, certifique-se de que o material inicial é totalmente puro. Isso pode ser feito por uma série de listras para isolar colônias individuais. Estes podem ser ainda mais crescidos em placas individualmente, ou em caldo, se necessário.
4. Equipamento de laboratório necessário:
   1. Ciclofadão térmico para PCR. A função do cicloviário térmico é aumentar e baixar a temperatura de acordo com um programa definido. Ao criar o programa, você será solicitado a inserir os valores de temperatura e tempo para cada etapa do PCR, bem como o número total de ciclos.
   2. Sistema de eletroforese de gel agarose. É usado para separar fragmentos de DNA com base em seu tamanho e carga. Neste protocolo, a eletroforese de gel agarose será usada para visualizar a qualidade de produtos isolados de DNA genômico e PCR.

2. Protocolo

Nota: O protocolo demonstrado se aplica ao sequenciamento genético de 16S rRNA de uma cultura pura de bactérias. Não se aplica a estudos metagenômicos.

1. Culturing bactérias para isolamento do DNA genômico (gDNA).
   1. Cresça seu microrganismo em um meio adequado. Tanto as mídias líquidas quanto as sólidas podem ser usadas nesta etapa. Escolha condições que produzam o melhor crescimento. Ao planejar o experimento, tenha em mente que as bactérias de crescimento lento podem precisar de vários dias para chegar à fase de crescimento estacionário/de tronco tardio. Neste protocolo, o Bacillus subtilis 168 foi cultivado em caldo de lysogenia (LB) durante a noite em uma incubadora de agitação fixada a 200 rpm, 37°C.
2. Isolamento do GDNA.
   1. Se as bactérias foram cultivadas em meio sólido, raspe algumas células usando um laço estéril e resuspensá-las em 1 mL de água destilada
   2. Se as bactérias foram cultivadas em meio líquido, utilize aproximadamente 1,5 mL de uma cultura durante a noite.
   3. Pelotar as células por centrifugação (1 minuto, 12.000 - 16.000 × g), remover o supernante e usar as células para isolamento gDNA usando um kit comercial ou protocolos padrão [por exemplo, preparação total de DNA CTAB (13) ou extração de fenol-clorofórmio (14)]. Aqui, um kit comercial foi utilizado para isolar gDNA de 1,5 mL de B. subtilis 168 overnight culture, OD₆₀₀ = 1.5.
      Nota 1: Para algumas bactérias Gram-negativas esta etapa pode ser omitida e substituída pela simples liberação de DNA das células por ebulição. Resuspenque a pelota bacteriana em água destilada e incuba em um bloco de aquecimento a 100 °C por 10 minutos.
      Nota 2: Células bacterianas gram-positivas são difíceis de interromper. Recomenda-se, portanto, escolher um método de isolamento gDNA ou kit dedicado ao isolamento desse grupo de bactérias.
3. verificação de qualidade gDNA.
   1. Verifique a qualidade do gDNA isolado por eletroforese de gel agarose. Primeiro, misture 5 μL do gDNA isolado com 1 μL do corante de carregamento (6x), e carregue a amostra em um gel de 0,8% de agarose que contenha um reagente de coloração de DNA.
   2. Carregue um padrão de massa molecular e execute a eletroforese até que a frente de corante atinja a parte inferior do gel.
   3. Uma vez que a eletroforese esteja concluída, visualize o gel em um transilluminador adequado (UV ou luz azul). gDNA aparece como uma faixa molecular grossa (acima de 10 kb). Um exemplo da verificação de qualidade gDNA é mostrado na Figura 3.
   4. Se o gDNA passar pelo controle de qualidade (ou seja,a banda molecular alta está presente e há pouca ou nenhuma mancha do gDNA), diluir seu gDNA serialmente pela primeira rotulagem de 3 tubos de microcentrifuuge da seguinte forma: "10x", "100x" e "1000x".
   5. Pipeta 90 μL de água destilada estéril em cada um dos 3 tubos.
   6. Pegue 10 μL da solução gDNA e adicione-a ao tubo marcado como "10x".
   7. Em pipetar todo o volume(ou seja, 100 μL) para cima e para baixo completamente para garantir que a solução seja misturada uniformemente. Em seguida, pegue 10 μL da solução deste tubo e transfira-a para o tubo marcado como "100x".
   8. Misture como descrito antes e repita o mesmo procedimento transferindo 10 μL da solução do tubo "100x" para o tubo "1000x". Essas diluições serão usadas como modelo na reação do PCR.

Figura 3: Eletroforese de gel agarose de gDNA isolada de Bacillus subtilis. Pista 1: M - marcador de massa molecular (de cima a baixo: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp). Raia 2: gDNA - DNA genômico isolado do Bacillus subtilis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Amplificação do gene 16S rRNA por PCR.
   Nota: O protocolo PCR abaixo é otimizado para um determinado polimerase de DNA e par de primer 8F - 1492R (ver Tabela 1). A otimização do protocolo é necessária para cada par de polimerase e primer.
   1. Descongele todos os reagentes no gelo.
   2. Prepare o mix mestre pcr como mostrado na Tabela 2. Uma vez que a polimerase de DNA está ativa à temperatura ambiente, a configuração de reação deve ser realizada no gelo, ou seja, os tubos PCR e os componentes de reação devem ser mantidos no gelo o tempo todo. Prepare uma reação por cada amostra gDNA e uma reação para controle negativo. O controle negativo é uma mistura pcr sem o modelo gDNA e é usado para garantir que os outros componentes da reação não estejam contaminados.
      Nota: No caso de múltiplas amostras, uma mistura mestra é comumente preparada. Master mix é uma solução que contém todos os componentes de reação, exceto o modelo. Ajuda a omitir a tubulação repetitiva, evitar erros de pipetação e garante alta consistência entre as amostras. Para preparar a mistura mestre, multiplique o volume de cada componente (exceto o modelo de DNA) pelo número de amostras testadas. Misture todos os componentes no tubo de microcentrifusagem e encorregue todo o volume várias vezes.
   3. Alíquota de 49 μL da mistura mestre nos tubos PCR individuais.
   4. Adicione 1 modelo μL em tubos com mix mestre. Para controle negativo adicione 1 μL de água estéril. Para garantir que os componentes estejam bem misturados, encobre suavemente a mistura para cima e para baixo ~10 vezes com uma pipeta definida para 30-50μL.
   5. Defina a máquina PCR com o programa mostrado na Tabela 3.
   6. Coloque os tubos na máquina PCR e inicie o programa.
   7. Uma vez concluído o programa, examine a qualidade do seu produto PCR por eletroforese de gel agarose.
   8. Uma reação de PCR bem sucedida usando o par de primer 8F-1492R rende uma única faixa de aproximadamente 1,5 kb(Figura 4). Se outras bandas (ou seja, produtos inespecíficos) estiverem presentes, otimize o programa PCR ajustando a temperatura de reclusão. Se uma única faixa de tamanho esperado estiver presente, proceda para o próximo passo. Aqui, a reação do PCR com modelo gDNA diluído de 100x rendeu o melhor produto, pois tinha uma faixa acentuada de tamanho esperado e não tinha produtos inespecíficos. Por isso, foi escolhido para ser purificado e enviado para sequenciamento.
   9. Antes do sequenciamento, o produto deve ser limpo a partir de primers residuais, desoxyribonucleotídeos, polimerase e tampão que estavam presentes na reação pcr. Os produtos PCR podem ser isolados usando um kit comercial de purificação pcr. A reação do PCR é carregada em uma coluna que contém uma matriz de ligação de DNA. O produto PCR se liga à coluna, enquanto outros componentes fluem através da coluna. A coluna é então lavada usando tampão de lavagem, e, finalmente, o DNA é elucido no buffer de escolha. Confirme se o tampão de elução que é complementado com o kit é compatível com sequenciamento.
   10. Envie o produto PCR purificado para sequenciamento de DNA. Siga as orientações para a apresentação de amostras de sequenciamento na instalação de sequenciamento escolhida. Para obter a melhor cobertura de sequência, use os primers de amplificação PCR (o mesmo usado na seção 2.4.1) como primers de sequenciamento. Aqui, foram utilizados primers 8F e 1492R para sequenciar o produto PCR.

Tabela 2: Componentes de reação do PCR. * use o gDNA diluído de 10x, 100x ou 1000x a partir da etapa 2.3.

Tabela 3: Programa PCR para a amplificação do gene rRNA 16S.

Figura 4: Eletroforese de gel agarose de produtos PCR amplificados usando primers 8F e 1492R e gDNA como modelo. A amostra de gDNA de B. subtilis (ver Figura 3) foi diluída 10, 100 e 1000 vezes para testar o melhor resultado. Raia 1: M - marcador de massa molecular (de cima a baixo: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp). Faixa 2: Reação pcr com modelo diluído de 10x. Pista 3: Reação pcr com modelo diluído de 100x. Pista 4: Reação pcr com modelo diluído de 1000x. Raia 5: (C-) - controle negativo (reação sem o modelo de DNA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Análise de dados e resultados

Nota: O produto PCR é sequenciado usando os primers para a frente (aqui 8F) e o inverso (aqui 1492R). Portanto, são gerados dois conjuntos de sequência de dados, um para o atacante e outro para o primer reverso. Para cada sequência são gerados pelo menos dois tipos de arquivo: i) um arquivo de texto contendo a sequência de DNA e ii) um cromatógrafo de DNA, que mostra a qualidade da execução de sequenciamento.

1. Para o primer dianteiro, abra o cromatograma e examine cuidadosamente a sequência. Um cromatógrafo ideal para uma sequência de qualidade deve ter picos espaçados uniformemente e pouco ou nenhum sinal de fundo(Figura 5A).
2. Se o cromatógrafo não for de alta qualidade, a sequência deve ser descartada ou o arquivo de texto sequencial deve ser revisado de acordo com o seguinte:
   1. A presença de picos duplos ao longo do cromatograma indica a presença de múltiplos modelos de DNA. Este pode ser o caso se a cultura bacteriana não fosse pura. Tal sequência deve ser descartada(Figura 5B).
   2. Um cromatógrama ambíguo pode surgir da presença de diferentes picos coloridos no mesmo local. Um dos erros mais comuns é a presença de dois picos coloridos diferentes na mesma posição e a atribuição inadequada das bases pelo software de sequenciamento(Figura 5C). Corrija manualmente nucleotídeos atribuídos incorretamente e edite-os no arquivo de texto.
   3. Cromatógramas de baixa resolução podem resultar em "picos amplos" que muitas vezes causam má contagem dos nucleotídeos nessas regiões(Figura 5D). Este erro é difícil de corrigir e, portanto, possíveis desencontros na etapa de alinhamento adicional não devem ser tratados como confiáveis.
   4. A má qualidade de leitura do cromatograma e a presença de múltiplos picos são comumente vistas nas extremidades de 5' e 3' da sequência. Alguns softwares sequenciadores removem esses fragmentos de baixa qualidade automaticamente(Figura 5E),e os nucleotídeos não estão incluídos no arquivo de texto. Se sua sequência não foi truncada automaticamente, determine os fragmentos de baixa qualidade (por exemplo, sinal fraco, picos sobrepostos, perda de resolução) nas extremidades e remova as respectivas bases do arquivo de texto.

Figura 5: Exemplos de sequenciação de DNA. A) Um exemplo de uma sequência de cromatograma de qualidade (picos uniformemente espaçados e inequívocos). B) Sequência de baixa qualidade que geralmente ocorre no início do cromatograma. A área de zona cinzenta é considerada de baixa qualidade e automaticamente removida pelo software de sequenciamento. Mais bases podem ser aparadas manualmente. C) Presença de picos duplos (indicados por setas). Um nucleotídeo que é indicado pela seta vermelha foi lido pelo sequenciador como "T" (pico vermelho), mas o pico azul é mais forte, e também pode ser interpretado como "C". D) Picos sobrepostos indicam contaminação de DNA(ou seja, mais de um modelo). E) Perda de resolução e os chamados "picos amplos" (marcados por retângulo) que impedem a chamada de base confiável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Repita 3.1 e 3.2 para o primer reverso.
4. Finalmente, monte as sequências para frente e invertida em uma sequência contígua. Uma boa corrida de sequenciamento rende uma sequência de até 1100 bp. Considerando que o produto PCR tem ~1500 bp de comprimento, as sequências obtidas usando primers dianteiros e invertidos devem se sobrepor parcialmente.
   1. Mescle as duas sequências usando o programa de montagem de sequência de DNA, por exemplo, uma ferramenta gratuita como CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (15).
   2. Insira as duas sequências no formato FASTA na caixa indicada. Clique no botão "Enviar" e aguarde o retorno dos resultados.
   3. Para visualizar a sequência montada pressione "Contigs" na guia de resultado. Para ver os detalhes do alinhamento pressione "Detalhes da montagem".
      Nota 1: Se o software CAP3 for usado para montagem de contig, não há necessidade de converter a sequência de primer reverso em reverso-complementar; no entanto, esse passo pode ser necessário se outro programa for usado.
      Nota 2: O formato FASTA é um formato baseado em texto para representar a sequência nucleotídea. A primeira linha (a linha de descrição) em um arquivo FASTA começa com um símbolo ">" seguido pelo nome ou um identificador exclusivo da sequência. Seguindo a linha de descrição está a sequência de nucleotídeos. Cole suas sequências no seguinte formato:
      
      >sequence_frw_primer
      cole sua sequência do arquivo de texto aqui
      >sequence_rvs_primer
      cole sua sequência do arquivo de texto aqui
5. Realize uma pesquisa no banco de dados visitando o site da Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico (BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
   1. Selecione a ferramenta "Nucleotide BLAST" para comparar sua sequência com o banco de dados.
   2. Digite sua sequência (a contig montada em 3.5) na caixa de texto "Sequência de consulta" e selecione o banco de dados "sequências de rRNA 16S (Bactérias e Archea)" no menu scroll down.
   3. Pressione o botão "BLAST" na parte inferior da página. As sequências mais semelhantes serão devolvidas. Um exemplo de resultado BLAST é mostrado na Figura 6. No experimento apresentado, o principal hit é b. subtilis strain 168, mostrando 100% de identidade com a sequência disponível no banco de dados BLAST.
   4. Se o topo não mostrar 100% de identidade, vá para o alinhamento e verifique se há desencontros. Ao clicar no topo, você será direcionado para os detalhes do alinhamento. Nucleotídeos alinhados serão unidos por linhas verticais curtas, enquanto nucleotídeos incompatíveis têm uma lacuna entre eles. Retorne ao cromatógrafo que recebeu da empresa de sequenciamento e revise a sequência mais uma vez com o foco na região incompatível. Corrija a sequência se forem encontrados erros adicionais. Execute blast novamente usando a sequência corrigida.

Figura 6: Exemplo do resultado blast nucleotídeo. 16S sequência genética rRNA a partir da cultura pura de B. subtilis 168 foi usada como uma sequência de consulta. O sucesso superior mostra 100% de identidade (sublinhada) para a cepa B. subtilis 168, como esperado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.