1. Testes de epsilômetro (E-testes)

1. Configuração
   1. Use luvas e um jaleco.
   2. Prepare o espaço de trabalho esterilizando-o usando 70% de etanol
   3. Coletar placas de ágar Mueller-Hinton (placas MHA)
2. Preparando um padrão de turbidez McFarland nº 0,5
   1. Prepare uma solução de 1% de cloreto de bário (BaCl₂):
      Adicione 1 grama de cloreto de bário anidro (BaCl₂) em água destilada de 100 mL. Vórtice bem.
   2. Prepare uma solução de 1% de ácido sulfúrico (H₂SO₄):
      Adicione 1 mL de H₂SO₄ concentrado em 99 mL de água destilada. Vórtice bem.
   3. Prepare um padrão de turbidez mcfarland nº 0,5:
      Solução 50 μL BaCl₂ em 5 mL de solução 1% H₂SO_4. Vórtice a solução bem para obter uma suspensão turva.
   4. Mantenha o padrão de turbidez mcFarland nº 0,5 em um tubo coberto de papel alumínio. Armazene a 25°C por uma máxima de 6 meses. Vórtice bem para uma solução homogênea antes de usar.
3. Preparando placas MHA
   1. Raspe as bactérias do grupo G do grupo G da placa de ágar de sangue usando um laço estéril. Misture em 1mL de soro fisiológico, e vórtice a uma suspensão da bactéria.
   2. Compare a suspensão a um McFarland padrão nº 0.5 para alcançar a mesma turbidez, a fim de ter o mesmo tamanho inóculo durante os experimentos. Ajuste a concentração usando soro fisiológico adicional ou bactérias.
   3. Inocular as placas de MHA usando um aplicador de ponta de algodão estéril. Limpe a placa suavemente para cobrir a superfície. Prossiga com um dos três métodos descritos abaixo (1.4-1.6).
4. Teste único de resistência a antibióticos. Grupo Streptococcus G, resistência à penicilina G ou gentamicina
   1. Coloque uma tira de teste E (penicilina G ou gentamicina) no centro da placa MHA(Figura 1 A,B).
   2. Incubar por 18-20 horas, 37°C.
   3. Leia os resultados. O MIC é medido como a zona de inibição que cruza a tira de teste de antibióticos classificada(Figura 1 C,D).

Figura 1: Teste único. Colocação de uma tira de teste E de A) penicilina G e B) gentamicina em uma placa de ágar Mueller Hinton coberta com colônias bacterianas de um grupo G streptococci antes(A e B) e depois(C e D) incubação durante a noite a 37°C 5% CO₂. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Sinergia testando abordagem cruzada. Grupo Streptococcus G, resistência à penicilina G e gentamicina.
   1. Coloque duas tiras de teste E com antibióticos diferentes (por exemplo, penicilina G e gentamicina) na placa MHA inoculada em uma formação cruzada.
      1. Para obter os resultados mais precisos, o objetivo é colocar a cruz em um ângulo de aproximadamente 90° na intersecção entre as balanças em seus valores MIC, previamente determinado em um único teste de resistência a antibióticos(Figura 2 A).
      2. Note que uma vez que as tiras são colocadas na placa de ágar, elas não devem ser movidas, uma vez que alguns antibióticos já podem ter sido absorvidos pela placa. Portanto, é mais apropriado manter as tiras em um ângulo ligeiramente errado (por exemplo, 85°) e até 1-2 mm do valor mic real. É aconselhável executar o experimento em triplicado para reduzir este problema.
   2. Incubar por 18-20 horas, 37°C.
   3. Leia os resultados. O MIC é medido como a zona de inibição que cruza a tira de teste de antibióticos classificada em cada tira de teste E(Figura 2 B).
   4. Use a fórmula para concentração inibitória fracionária (FIC) (Equação 1) a fim de determinar a sinergia.

Figura 2: Detecção de sinergismo - teste cruzado. Resultados dos testes de sinergia antimicrobiana do MIC da penicilina G e gentamicina no grupo Streptococcus G antes (A) e depois (B) incubação durante a noite a 37°C 5% DE CO₂. Forma-se um ângulo de 90° entre os dois valores MIC individuais (penicilina G: 0,094 μg/mL, gentamicina: 8 μg/mL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Sinergia testando abordagem não cruzada. Grupo Streptococcus G, resistência à penicilina G e gentamicina.
   1. Coloque a tira de teste E no centro da placa MHA(Figura 3 A,D).
   2. Marque onde o valor MIC previamente determinado estava em cada tira.
   3. Incubar por 1 hora em temperatura ambiente.
   4. Descarte a tira de teste E para cada placa MHA(Figura 3 B,E).
   5. Coloque a segunda tira de teste E (contendo um antibiótico diferente) na área da tira removida anteriormente, respectivamente, para que seus valores MIC correspondam à marca e estejam alinhados.
   6. Incubar por 18-20 horas, 37°C.
   7. Leia os resultados. O MIC é medido como a zona de inibição que cruza a tira de teste de antibióticos classificada em cada tira de teste E(Figura 3 C,F).
   8. Para determinar a sinergia, utiliza-se a fórmula de concentração inibitória fracionária (FIC)(Equação 1).

Figura 3: Detecção de sinergismo - teste não transversal. Resultados dos testes de sinergia antimicrobiana do MIC da penicilina G e gentamicina no grupo Streptococcus G. A) Tira de gentamicina (8 μg/mL centrada) em cima de bactérias do grupo G streptococcus, B) Remoção da tira de gentamicina, C) Tira g de gentamicina combinada / penicilina (0,094 μg/mL centrada) em cima das bactérias G do grupo Streptococcus, D) Penicilina G strip (0,094 μg/mL centrada), E) Remoção da tira G penicilina, F) Penicilina combinada G / tira de gentamicina (8 μg/mL centrada) em cima das bactérias Do grupo G de Streptococcus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Teste de caldo

1. Configuração
   1. Use luvas e um jaleco.
   2. Prepare o espaço de trabalho esterilizando-o usando 70% de etanol
   3. Coletar caldo MH de 15mL com 50% de sangue de cavalo e 20 mg/mL β-NAD (MH-F)
2. (Opcional) Realize um teste eletrônico [Protocolo 1] para determinar o MIC em meio sólido
   1. Embora opcional, tal conhecimento permitirá um melhor design experimental (por exemplo, as concentrações de antibióticos adicionados podem ser projetadas para cercar o valor MIC determinado a partir da placa), melhorando as chances de um experimento bem-sucedido.
3. Preparando um inóculo bacteriano. Como dito acima, a concentração bacteriana pode ser estimada por medidas de OD nm ou padrões de turbidez mcFarland
   1. Método OD600 nm
      1. Obtenha uma suspensão bacteriana com uma concentração bacteriana estabelecida
      2. Diluir a cultura no caldo MH-F para alcançar um OD600 de 0,003
   2. Método de turbidez de McFarland
      1. Coloque caldo MH-F de 15 mL em um tubo estéril.
      2. Inocular o caldo MH-F com bactérias (de uma placa) a um nível McFarland. Vórtice a solução vigorosamente. Despeje a solução em uma placa de Petri estéril.
4. Preparando antibióticos
   1. Determine a concentração de antibióticos desejados
      1. Identifique o valor MIC do teste E (ex. 0,125 μg/mL para penicilina G e 8 μg/mL para gentamicina)
      2. Multiplique o valor MIC da placa de ágar por^{2 4}-2⁷, correspondendo a diluições seriais de quatro a sete 2x. Esta será a concentração inicial de antibióticos. (ex. para penicilina G, sete diluições seriais 2x: 0,125 μg/mL x 2⁷ = 16 μg/mL; para gentamicina, quatro diluições seriais 2x 8 μg/mL x 2⁴ = 128 μg/mL
      3. Multiplique o valor inicial desejado 100x para determinar a geração de uma concentração de estoque dos antibióticos (ex. estoques de 1,6 mg/mL penicilina G e 12,8 mg/mL gentamicin)
   2. Prepare uma concentração de estoque de antibióticos de 100x em conformidade
      1. Dissolva os antibióticos em 10mL de água autoclavada e vórtice para gerar uma solução de estoque (ex. 16 mg penicilina G e 128 mg de gentamicina para criar os estoques acima)
5. Adicione bactérias a poços de microplacícios
   1. Aliquot 200 μl caldo MH-F contendo bactérias inóculos para os poços nas primeiras 3 fileiras de uma placa de microtiter de 96 poços para um experimento em triplicado.
6. Adicione antibióticos a poços de microplato
   1. Adicione 200 μL de caldo extra MH-F com bactérias à primeira coluna de poços (A1, B1, C1) para levar o volume total a 400 μL.
   2. Adicione 4 μL da concentração de estoque de antibióticos à primeira coluna de poços. Uma vez que a amostra contém 400 μL resultará em uma diluição de 100x dos antibióticos.
   3. Gerar uma diluição serial de 2x transferindo 200 bactérias/antibióticos μL de A1 para A2, até A11. Pipet vigorosamente entre as diluições. Repita o passo para linhas adicionais.
   4. Remova 200 μL da coluna 11 para que o volume final em todos os poços seja de 200 μL.
   5. Deixe a última coluna (A12, B12, C12) sem antibióticos, como controles.
7. Determine valores MIC
   1. Incubar a placa de microtiter de 96 poços por 24 horas a 37°C sem tremer.
   2. O valor MIC é definido como o último poço da série de diluição que não apresenta crescimento visível de bactérias(Figura 4). Esse valor, no entanto, só pode ser confiável se o tamanho original do inóculo estiver correto.

Figura 4: Determinação mic por diluição de caldo. Mic é aqui definido como o último poço que exibe clareza (sem crescimento de bactérias) antes de mudar a turbidez. Linha são duplicatas do valor MIC da penicilina G e linha são duplicatas do valor MIC da gentamicina, ambas versus um isolado do Streptococcus grupo G. A) interpretação experimental real, B) interpretação esquemática dos valores de A (cinza = sem crescimento; branco = crescimento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Procedimento esquemático da série de diluição para contar a concentração original de bactérias. Diluições foram realizadas como descrito (20 μL diluídos em 180 μL para uma série de diluição de 10x), e, em seguida, 10 μL das linhas A-H são banhados em duas placas de ágar de sangue separadas, conforme indicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Determinar o tamanho do inóculo original
   NOTA: Os ensaios de microbroth são altamente sensíveis para o tamanho original do inóculo usado. Um tamanho excessivo de inóculo dará um resultado falso positivo, uma vez que os antibióticos adicionados não serão capazes de inibir o crescimento por mais tempo nessa proporção. Portanto, é fundamental verificar quanta bactéria foi adicionada aos microwells. Embora os dados não estejam disponíveis no ponto do experimento (devido à necessidade de incubação de 24 horas), ele servirá como um controle. Se o número de bactérias adicionadas estiver dentro da faixa de concentração indicada, os valores mic podem ser confiáveis. Se o inóculo era muito alto ou muito baixo, o experimento precisa ser repetido.
   1. Diluir seriamente as bactérias
      1. Prepare uma placa microtiter de 96 poços para diluir a concentração bacteriana original, a fim de determinar o tamanho do inóculo. O ideal é um volume de 200 μL com 10 bactérias^5-6. Para realizar as diluições, primeiro aliquot 180 μL PBS estéril para cada poço em B-H (em triplicado 1-3).
      2. Em seguida, adicione 100 μl de solução bacteriana a A (em triplicado 1-3).
      3. Gerar uma diluição serial de 10x (em triplicado) transferindo 20 μl bactérias de A para B, pipet vigorosamente. Repita os passos para C-H.
   2. Aplauque as diluições bacterianas para determinação do tamanho do inóculo
      1. Marque placas de ágar de sangue de acordo com a Figura 5.
      2. Transfira 10 μL da diluição serial para a placa de acordo com a Figura 5.
      3. Incubar a placa a 37°C durante 20-24 horas.
   3. Determine o tamanho do inóculo bacteriano
      1. Contagem de números bacterianos em pontos dentro de 5-50 colônias(Figura 6).
      2. Calcule o tamanho inicial do inóculo calculando a média das amostras triplicadas, multiplique pelo fator de diluição (por exemplo, 10x para amostras B, 100x para amostras C, 1000x para amostras D, etc.) e depois por 100 para compensar o volume de manchas de 10 μL, resultando no tamanho do inóculo em cfu/mL. Se o inóculo estiver dentro de 10^5-6 cfu/mL, os dados MIC podem ser confiáveis.

Figura 6: Determinação do tamanho do inóculo. Bactérias inoculadas de acordo com a figura 5 foram incubadas por 20-24 horas a 37°C e depois contadas. A linha D tem um bom número de colônias para contar (por exemplo, 5-50). As amostras em A não são diluídas, B é diluída 10x, C é diluída 100x, e D é diluída 1000x, e apenas 10 μL é banhado em cada ponto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.